I.developmentof methods for analysis of ointment containing anaesthesin, methyluracil, furacilin

Full Text

Актуальность темы.

Проблема создания лекарственных средств, обладающих комплексным и многонаправленным действием, по-прежнему актуальна, особенно в связи с резистентностью микроорганизмов ко многим химиотерапевтическим фармацевтическим субстанциям.

В данном сообщении приведены результаты разработки способов стандартизации мази, содержащей анестезин, метилурацил, фурацилин, и оценки её противовоспалительной и ранозаживляющей активности.

Цель работы. Разработка способов идентификации и количественного определения ингредиентов многокомпонентной мази на гидрофильной основе, содержащей анестезин, метилурацил, фурацилин. Оценка воздействия мази предлагаемого состава на воспалительный и раневой процессы в опытах на животных.

Используемые материалы и методы.

 Объектом исследования служили опытные образцы разработанной ранее мази на гидрофильной основе ПЭО-1500, содержащие анестезин, метилурацил и фурацилин. Идентификацию действующих веществ мази проводили с помощью химических реакций, описанных в нормативной документации и научной литературе для соответствующей фармацевтической субстанции.

Спектры поглощения и необходимые для расчетов характеристики спектров растворов многокомпонентного стандарта и анализируемой мази измеряли на спектрофотометрах марок «Shimadzu UV mini-1240» и «СФ-56».

Методика количественного определения анестезина и метилурацила в модельной мази модифицированным методом Фирордта: около 0,5 г мази (точная навеска) помещали в химический стакан вместимостью 50 мл, добавляли по 25 мл воды и спирта этилового, подогревали на кипящей водяной бане до образования однородной массы. Фильтровали в тёплом виде в мерную колбу вместимостью 100 мл. Фильтр промывали теплой смесью воды и спирта этилового (около 40 мл). Фильтрат охлаждали и доводили водой до метки, перемешивали (раствор А). 10,0 мл раствора А доводили водой до метки в мерной колбе вместимостью 100 мл, перемешивали (раствор Б).

Для приготовления раствора многокомпонентного стандарта точные навески метилурацила (около 0,25 г), анестезина (около 0,2 г), фурацилина (около 0,01 г) вносили в мерную колбу вместимостью 250 мл, добавляли около 50 мл спирта этилового, взбалтывали в течение 10 мин до растворения действующих веществ. Затем доводили водой до метки, перемешивали (раствор В). 1,0 мл полученного раствора доводили водой до метки в мерной колбе вместимостью 100 мл, перемешивали (раствор Г).

Измеряли на спектрофотометре оптические плотности испытуемого раствора Б мази и раствора Г многокомпонентного стандарта относительно воды в кювете с толщиной слоя 10 мм при 240 нм и 290 нм.

Содержание анестезина и метилурацила (х, %) рассчитывали по формулам (соответственно 1, 2) (см. результаты и обсуждение).

Методика количественного определения фурацилина в испытуемом растворе мази методом изолированной абсорбции: 5,0 мл раствора А (приготовление указано выше) доводили водой до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл, перемешивали (раствор Д). Для приготовления раствора многокомпонентного стандарта 1,0 мл раствора В многокомпонентного стандарта (приготовление указано выше) доводили водой до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл, перемешивали (раствор Е).

Измеряли на спектрофотометре оптическую плотность раствора Д испытуемого образца мази и раствора Е многокомпонентного стандарта в кювете с толщиной слоя 10 мм при 375 нм относительно воды. Содержание фурацилина в мази (хф, %) рассчитывали по формуле (3) (см. ниже).

Противовоспалительную и ранозаживляющую активность мази предлагаемого состава оценивали в опытах на белых беспородных крысах обоего пола массой 180-200 г, содержащихся в стандартном режиме вивария в соответствии с правилами GLP[1].

Противовоспалительную активность мази оценивали на модели каолинового отёка [2]. Согласно данной методике измеряли исходный объём задней лапки подопытных животных. Затем вводили в дорсовентральную часть лапки крысы 0,1 мл 1% раствор взвеси каолина и наносили исследуемую мазь на раневую поверхность лапки в количестве 250 мг. Повторно объём лапки крысы измеряли спустя 3 часа после травмы в момент наибольшего развития воспалительного процесса при данной модели. Прирост объёма лапки отражал степень экссудации. В качестве препарата сравнения использовали мазь бутадионовую [3]. Контролем служили нелеченые животные.

Ранозаживляющую активность мази разработанного состава изучали на модели термического повреждения кожи у белых беспородных крыс. Для этого на спинке животного выстригали шерстяной покров площадью 4 см². Под лёгким наркозом с помощью разогретой до 100⁰С плоскодонной пробирки с площадью донышка 2 см² создавали контактным способом ожоговое повреждение. Время экспозиции составляло 20 сек. Динамику ожогового повреждения оценивали по площади раны весовым методом [2; 4].

Исследуемую мазь и мазь сравнения ежедневно наносили на повреждённую поверхность кожи тонким слоем без втирания по 250 мг. Контролем служили нелеченые животные. Результаты ожогового повреждения оценивали на 2-е и 8-е сутки. Препаратом сравнения служила 10% мазь метилурациловая [3].

Результаты опытов обрабатывали методами вариационной статистики с помощью таблиц ускоренной оценки фармакологического эффекта [5].

Результаты и обсуждение.

Для идентификации компонентов исследуемой мази (качественный анализ) было предложено устанавливать подлинность анестезина по реакции образования азокрасителя после растворения 0,2-03 г мази в 2 мл воды [6].

Метилурацил предложено идентифицировать по реакции солеобразования с нитратом серебра по выпадению белого осадка после растворения 0,2-0,3 г мази в 2 мл воды [7]. Кроме того, метилурацил может быть идентифицирован по фиолетовому окрашиванию со спиртовым раствором кобальта нитрата и раствором аммиака после нагревания 0,5 г мази с 2-3 мл этанола [8].

Фурацилин даёт оранжево-красное окрашивание после нагревания 0,5 г мази со смесью 2 мл воды и 2 мл раствора натрия гидроксида [9].

Для количественного определения действующих веществ в мази разработана методика на основе использования УФ-спектрофотометрии, позволившая оценивать содержание каждого ингредиента в одной навеске в присутствии сопутствующих. Ранее было установлено, что мазевая основа не поглощает в максимумах поглощения анестезина, метилурацила и фурацилина и не мешает их количественному определению методом спектрофотометрии [10].

Наложение полос поглощения всех ингредиентов в области 200-340 нм делает невозможным количественное определение анестезина и метилурацила в мази методом непосредственной спектрофотометрии без предварительного разделения, но позволяет использовать для их количественного определения при совместном присутствии модифицированный метод Фирордта [11].

В то же время полоса поглощения фурацилина с максимумом при 375 нм, свободная от поглощения сопутствующих ингредиентов, позволяет определять его количественное содержание методом изолированной абсорбции.

Для использования модифицированного метода Фирордта особенно важен правильный выбор аналитических длин волн. Учитывая наложение полос поглощения всех ингредиентов, выбор аналитических длин волн проводили по максимальному значению коэффициентов Каца-Розкина для каждой фармацевтической субстанции [11]. Результаты расчёта приведены в таблице 1.

Таблица 1

Значения информационных (Каца-Розкина) и аналитических коэффициентов ингредиентов анализируемой мази

На основе проведённых расчётов (см. табл. 1) в качестве оптимальных аналитических длин волн для количественного определения модифицированным методом Фирордта выбраны для анестезина 290 нм и 240 нм, метилурацила 240 нм и 290 нм.

На основе значений коэффициентов Каца-Розкина рассчитаны аналитические коэффициенты и выведены расчётные формулы (1, 2):

$X_{м}\%=$$\frac{\left(\mathrm{1,324}\cdot \frac{{{\rm A}}_{х}^{240}}{{{\rm A}}_{ст}^{240}}-\mathrm{0,324}\cdot \frac{{{\rm A}}_{х}^{290}}{{{\rm A}}_{ст}^{290}}\right)\cdot {\alpha }_{ст}^{м}\cdot 25\cdot 100\cdot 100}{100\cdot 1\cdot {\alpha }_{х}^{м}}$.                                            (1)

$X_{а}\%=$$\frac{\left(\mathrm{1,0478}\cdot \frac{{{\rm A}}_{х}^{290}}{{{\rm A}}_{ст}^{290}}-\mathrm{0,0478}\cdot \frac{{{\rm A}}_{х}^{240}}{{{\rm A}}_{ст}^{240}}\right)\cdot {\alpha }_{ст}^{а}\cdot 25\cdot 100\cdot 100}{100\cdot 1\cdot {\alpha }_{х}^{а}}$.                                     (2)

где Ах²⁴⁰, Ах²⁹⁰оптические плотности растворов испытуемого образца мази; Аст²⁴⁰, Аст²⁹⁰ оптические плотности раствора многокомпонентного стандарта (метилурацила, анестезина, фурацилина); ах^м, ах^а соответственно навески метилурацила и анестезина в испытуемых образцах мази, г; аст^м, аст^а соответственно навески метилурацила и анестезина в растворе многокомпонентного стандарта, г.

Содержание фурацилина в мази (хф, %) рассчитывали по формуле (3):

$X_{ф}\%=$$\frac{{{\rm A}}_{х}^{375}\cdot {\alpha }_{ст}^{ф}\cdot 1\cdot 25\cdot 100\cdot 100}{{{\rm A}}_{ст}^{375}\cdot 100\cdot 25\cdot 1\cdot {\alpha }_{х}^{ф}}$.                                                                                   (3)

где Ах, Аст соответственно оптические плотности растворов испытуемого образца мази и многокомпонентного стандарта; ах^ф, аст^ф соответственно навески фурацилина в растворах испытуемых образцов мази и в растворе многокомпонентного стандартного образца, г.

Статистически обработанные результаты количественного определения анестезина, метилурацила и фурацилина разработанной методикой приведены в табл. 2. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что разработанная методика позволяет с достаточной точностью проводить количественное определение соответствующими методами спектрофотометрии всех действующих веществ мази предлагаемого состава без предварительного разделения ингредиентов. Относительная погрешность определения анестезина в мази составляет (98,5±0,6) %, метилурацила – (101,6±1,1) %, фурацилина (100,1±1,4) %.5

Таблица 2

Результаты количественного определения ингредиентов модельной мази, содержащей анестезин, метилурацил, фурацилин (n=6)

Объединённые показатели качества анализа мази, содержащей анестезин, метилурацил и фурацилин, приведены в виде спецификации в таблице 3.

Таблица 3

Показатели качества мази, содержащей анестезин, метилурацил и фурацилин (спецификация) и допустимые значения

Проведенные исследования фармакологической активности показали, что мазь предлагаемого состава не обладает противовоспалительным действием. Прирост объёма лапки животных, которых лечили указанной мазью, не отличался от прироста объёма лапки нелеченых животных. При этом мазь бутадионовая (препарат сравнения) оказывала хороший противовоспалительный эффект (см. табл. 4).

Таблица 4

Сравнительная оценка противовоспалительной активности мази предлагаемого состава (n = 6)

Исследование ранозаживляющей активности мази предлагаемого состава (см. табл. 5) показало, что нелеченое термическое ожоговое повреждение кожи животных, вызванное контактным способом, на вторые сутки имело площадь раны в весовых единицах 13,5±0,25 мг, а на восьмые сутки 6,6±0,25 мг. Эти значения были приняты за 100% фармакологического действия.

Таблица 5

Сравнительная оценка влияния мази предлагаемого состава на процесс заживления ожоговой раны (n = 6)

Примечание: Р вероятность различия результатов с контрольными животными.

У животных, получивших основу-плацебо (гель ПЭО-1500), отмечалось незначительное уменьшение, на 2,2%, общей площади раны на вторые сутки и на 10,6% на восьмые сутки. Применение предлагаемой мазевой композиции снизило площадь раны на вторые сутки на 69,9%, а на восьмые на 65,5% по сравнению с контролем. Препарат сравнения мазь метилурациловая снижала площадь ожоговой поверхности на вторые сутки на 47,4%, на восьмые на 53,1% по сравнению с контролем.

Таким образом, в опытах на животных установлено, что мазь предлагаемого состава при изучении ранозаживляющей активности на модели термического ожога кожи крыс показала более выраженный эффект на саногенез по сравнению с препаратом сравнения в ранние и более поздние сроки (см. табл. 5). Это обусловлено аддитивным фармакологическим действием каждого компонента, поскольку у группы животных, получавших для лечения основу-плацебо, аналогичного эффекта не проявлялось.

Выводы.

Разработаны способы стандартизации мази на основе геля ПЭО-1500, содержащей анестезин, метилурацил и фурацилин. Идентификацию ингредиентов мази предложено проводить с помощью химических реакций, описанных в литературе, после экстракции действующих веществ в водную вытяжку.

Для количественного определения анестезина, метилурацила и фурацилина в мази рекомендуется спектрофотометрическая методика, позволяющая определить все ингредиенты в одной навеске. При этом количественное определение анестезина и метилурацила основано на использовании модифицированного метода Фирордта, фурацилина – метода изолированной абсорбции. Погрешность определения составляет соответственно для анестезина (98,5±0,6) %, метилурацила (101,6±1,1) %, фурацилина (100,1±1,4) %. Установлено, что предлагаемая мазь противовоспалительным действием не обладает, однако ранозаживляющее действие превосходит аналогичное действие мази метилурациловой на 10%.

About the authors

A. S. Saushkina

Author for correspondence.
Email: ogarevonline@yandex.ru
Russian Federation

E. P. Sanaeva

Email: ogarevonline@yandex.ru
Russian Federation

T. S. Samoukova

Email: ogarevonline@yandex.ru
Russian Federation

E. V. Romanova

Email: ogarevonline@yandex.ru
Russian Federation

V. I. Fomicheva

Email: ogarevonline@yandex.ru
Russian Federation

References

Supplementary files