Diverse analgesic effects of novel benzimidazole derivatives

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Создание новых безопасных и эффективных анальгетиков представляется перспективным [23] в связи с большим количеством патологий, которые сопровождаются болевым синдромом, а также резким ростом злоупотребления опиоидами и увеличением числа связанных с ними смертей от передозировки [1, 9, 16]. Исследование именно агонистов каппа-опиоидных рецепторов (КОР) связано с отсутствием у них ряда нежелательных эффектов — эйфории и, в некоторых случаях, дисфории, что позволяет расширить диапазон их потенциального терапевтического применения.

Анализ структур известных лигандов КОР показал, что многие из них являются производными азотсодержащих гетероциклов, в частности, неконденсированных и конденсированных бензимидазолов (БИ) [11]. Примерами агонистов из числа БИ первого типа может служить фенотиазинилбензимидазол RP-61127 и бензимидазолон SR-14136 [24]. Разработка высокоселективных каппа-агонистов ведется при этом на основе биоизостерных по отношению к БИ скаффолдов, один из которых, бензтиазолиновый, присутствует в таком лиганде, как 2-арилбензтиазолин SA14867.

Поиску агонистов КОР в ряду конденсированных БИ способствовали результаты анализа баз данных, полученных in silico, для содержащих специфические для рассматриваемого вида активности фармакофоры. Это позволило идентифицировать как высокоселективные агонисты КОР некоторые структурные типы такого рода БИ, содержащие 2-аминобензимидазольный скаффолд [20]. Проведенные на базе кафедры фармакологии и биоинформатики Волгоградского государственного медицинского университета (ВолгГМУ) предварительные исследования in vitro ряда таких типов структур, в частности с 2-аминобензимидазольным скаффолдом, включенным в состав трициклических систем, синтезированных в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета (НИИ ФОХ ЮФУ, Ростов-на-Дону), позволили выявить ряд соединений с высокой селективностью по отношению к КОР, с выраженным и налоксонобратимым анальгетическим действием в экспериментах in vivo на стандартной модели поведенческих ноцицептивных реакций в тесте «отдергивание хвоста» [4]. Это стимулировало дальнейший поиск и исследование веществ с каппа-рецепторным профилем фармакологической активности среди указанного класса производных БИ.

В ходе ранее проведенных исследований соединения под лабораторными шифрами BIF-70 и BIF-72 проявили нейротропные свойства, сходные с ранее изученным производным бензимидазола РУ-1205 [5], для которого была показана выраженная агонистическая активность в отношении каппа-опиоидных рецепторов [3], а также высокая анальгетическая активность [25]. На основании данных результатов было принято решение оценить обезболивающие свойства новых соединений и установить степень выраженности дисфории как побочного эффекта, характерного для соединений с подобным механизмом действия [13].

Цель — оценить выраженность анальгетической активности соединений BIF-70 и BIF-72 в моделях:

• термической соматической боли «Плантарный тест» по методике [14];
• воспалительной боли, вызванной подкожным введением формалина [6];
• нейрогенной боли, вызванной повреждением седалищного нерва [8, 10] с последующим проведением тестов тактильной аллодинии и термической гипералгезии.

Установить уровень выраженности аверсивного действия соединений BIF-70 и BIF-72 в тесте «условное избегание места» по методике [2] в модификации [22].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на половозрелых крысах-самцах, массой 200–230 г, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская обл.). Крысы до начала эксперимента подверглись адаптационному карантину в течение 14 дней в виварии кафедры фармакологии и биоинформатики ВО ВолгГМУ, с последующей визуальной оценкой состояния и выбраковыванием особей с отклонениями. Животные имели круглосуточный доступ к кормушкам и поилкам ad libitum и содержались в стандартизированных условиях вивария^[*]. Крыс содержали группами по 5 особей, при регулируемом совмещенном световом режиме (12/12 ч) и температуре 20–22°C. За 12 ч до эксперимента животных лишали еды при свободном доступе к воде. Эксперименты были одобрены региональным исследовательским этическим комитетом Волгоградской области.

Соединение BIF-70 представляет собой 2-(2'-фтор[1,1'-бифенил]-4-ил)-3-метил-9-(2-(пирролидин-1-ил)этил)-9H-бензо[5]имидазо[1,2-а]имидазол. В свою очередь соединение BIF-72 является 4-(2-(2-(2'-фтор-[1,1'-бифенил]-4-ил)-3-метил-9H-бензо[d]имидазо[1,2-а]-имидазол-9-ил)этил)морфолином. Оба вещества использованы в виде субстанции, синтезированной в НИИ ФОХ ЮФУ.

Соматическая боль

Исследования выполнены на установке 37370 «Плантарный тест» при мощности излучения 40% на 20 беспородных белых-крысах, рандомизированных на 2 группы (n=10). Оценка анальгетической активности осуществляется на основании увеличения продолжительности латентного периода ноцицептивного ответа на болевой раздражитель (инфракрасное излучение). Ноцицептивной реакцией считается облизывание подошвы лапы, подверженной излучению, или ее отдергивание. Для каждого животного болевое воздействие повторяется дважды для каждой задней лапы. Регистрация времени отдергивания осуществляется встроенным ПО установки.

Крысу помещают в установку для привыкания к новой обстановке за 5 мин до тестирования, после чего проводят контрольный замер времени реакции. После этого внутрибрюшинно вводят соединения в дозе 10 мг/кг и объемом 0,3 мл, и через 30 мин тестирование повторяют. Доза выбрана на основании предыдущих исследований, посвященных изучению соединения РУ-1205 в аналогичной дозировке [25].

Статистическую значимость различий рассчитывали на основе двухфакторного дисперсионного анализа (2way ANOVA, p <0,05). Построение графиков и математические расчеты выполняли в комплексе ПО GraphPad Prism 8.

Воспалительная боль

Эксперименты выполняли на 15 самцах нелинейных белых крыс массой 250–300 г, рандомизированных на 3 группы (n=5) и содержавшихся в условиях вивария (температура 22–24°C, относительная влажность воздуха 40–50%) с естественным световым режимом на стандартной диете лабораторных животных в соответствии с ГОСТ Р 50258–92.

Для оценки влияния соединения на острое воспаление использовали метод формалиновой гипералгезии. Данное состояние моделировали подкожным введением 50 мкл 2% водного раствора формалина в тыльную поверхность правой задней лапы. Исследуемые соединения BIF-70 и BIF-72 (НИИ ФОХ ЮФУ) вводили в дозе 1 мг/кг за 60 мин до тестирования [3]. Группе контроля вводили аналогичный объем растворителя (дистиллированная вода). Регистрировалось число болевых реакций «flinches» (поднятие лапки, облизывание, покусывание места инъекции) с момента введения формалина и на протяжении всего периода наблюдения с учетом острой (первые 10 мин) и воспалительной (с 10 по 60 мин) фаз ноцицептивного ответа. Анальгетическую активность соединений оценивали отдельно для I и II фаз ноцицептивного ответа по уменьшению числа болевых реакций относительно таковых у контрольных животных.

Статистическую значимость различий рассчитывали на основе двухфакторного дисперсионного анализа (тест Краскела–Уоллиса, p <0,05). Построение графиков и математические расчеты выполняли в комплексе ПО GraphPad Prism 8.

По истечении срока эксперимента лабораторные животные подвергались эвтаназии методом цервикальной дислокации [7].

Нейропатическая боль

Эксперименты выполняли на 10 самцах нелинейных белых крыс массой 250–300 г, рандомизированных на 2 группы (n=5) и содержавшихся в условиях вивария (температура 22–24°C, относительная влажность воздуха 40–50%) с естественным световым режимом на стандартной диете лабораторных животных в соответствии с ГОСТ Р 50258–92.

В качестве наркоза при хирургических манипуляциях использовали хлоралгидрат в дозе 400 мг/кг внутрибрюшинно (в/б). Перед моделированием патологии операционное поле обрабатывали спиртовым раствором йода. Крыс разделили на 2 группы: 1-я группа — «нейропатия + BIF-70» (n=5) — крысам с правосторонним повреждением седалищного нерва вводили изучаемое соединение (в дозе 1 мг/кг); 2-я группа — «нейропатия + BIF-72» (n=5) — животным с правосторонним повреждением седалищного нерва вводили изучаемое соединение (в дозе 1 мг/кг).

После моделирования патологии в течении 7 дней крысам ежедневно в/б вводили 5 мл раствора ципрофлоксацина (по 2 мг/мл). Изучаемые соединения вводили в/б дважды в сутки, начиная со дня операции и последующие 14 дней. Данные для препаратов сравнения (морфина в дозе 1 мг/кг в/б и габапентина в дозе 10 мг/кг в/б), а также соединения-лидера (РУ-1205 в дозе 1 мг/кг в/б) получены в ходе предыдущих исследований [25]. По истечении срока эксперимента лабораторные животные подвергались эвтаназии методом цервикальной дислокации.

Эксперименты проводились с использованием методик, рекомендованных при изучении нейропатической боли [12], в следующей последовательности:

1. Тест тактильной аллодинии.
2. Тест термической гипералгезии («горячая пластина»).

Оценка тактильной аллодинии

Тактильную аллодинию у крыс оценивали регистрацией давления, при котором крысы отдергивают правую заднюю лапу, избегая воздействия нарастающих по степени стимулов. Крысе снизу через сетку к правой задней лапе (оперированной) по очереди прикладывают волоски VonFrey, представляющие собой 20 монофиламентов из нейлоновых нитей различного диаметра, закрепленные на пластиковых ручках. Эксперимент начинали с монофиламента с маркировкой 4.31. В случае если после 5-кратного прикосновения нет ответа, последовательно переходили к следующему монофиламенту с большей силой. Тест заканчивали при достижении филамента с маркировкой 5.18 либо через 4 тестирования после первого положительного ответа. Определяли 50% порог отдергивания лапы при последовательном увеличении и уменьшении силы стимула с использованием метода UP-AND-DOWN [15].

Рассчитывали показатель 50% порога болевой реакции по формуле:

$A_{50\%}=\frac{{10}^{(Xf + K\delta )}}{10 000}$,

где X_f — значение величины финального волоска Фрея (в log единицах); K — стандартное значение коэффициента; δ — среднее значение разницы между стимулами (в log единицах).

Оценка термической аллодинии

Изучение термической (холодовой) аллодинии проводили с помощью прибора Hot/Cold-plate при охлаждении пластины до 5°C. В данном тесте в течение всего времени наблюдения учитывали период (2 мин), в который животные выдерживают холодную температуру, опираясь всеми конечностями на охлажденный пол [18].

Критерием анальгетического эффекта считали статистически значимое увеличение времени удержания конечности на пластине под влиянием исследуемых веществ в сравнении с группой контроля. Статистическую значимость различий рассчитывали на основе двухфакторного дисперсионного анализа (2 way ANOVA, р <0,05). Построение графиков и математические расчеты выполняли в комплексе ПО GraphPadPrism 8.

Изучение аверсивной активности

Эксперимент выполняли на 20 белых мышах-самцах по следующей схеме.

В 1-й день — экспериментальные животные помещаются в установку, разделенную на две камеры, отличные по визуальным и тактильным признакам, на 20 мин каждое без ограничений на перемещение. Фиксируется длительность нахождения в каждой области. Рассчитывается процент времени нахождения в каждой области.

Со 2-го по 9-й дни — животному проводится в/б инъекция исследуемого соединения (в дозе 5 мг/кг) или растворителя в равновероятной последовательности, после чего оно помещается в соответствующую камеру, выход в другую при этом ограничивается. Животное находится в установке в течение 30 мин, после чего возвращается в клетку.

На 10-й день — действия аналогичны дню 1. Соединения, обладающие аверсивной активностью, должны снижать процент времени нахождения в выбранной области на 10-й день эксперимента в сравнении с процентом на 1-й день.

Статистическую значимость различий рассчитывали на основе двухфакторного дисперсионного анализа (2 way ANOVA, р <0,05). Построение графиков и математические расчеты выполняли в комплексе ПО GraphPadPrism 8.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Соматическая боль

На рис. 1 представлено относительное изменение длительности латентного периода реакции, вызванное введением исследуемых соединений. За начало отсчета принимались результаты контрольной группы. Данные для препарата сравнения получены из публикации [14]. Представляется необходимым отметить, что полученные результаты статистически значимо отличались от группы контроля, однако статистически значимых различий между группами обнаружено не было.

 

Рис. 1. Сравнение относительного изменения длительности латентного периода исследуемых соединений с препаратом сравнения. Все исследуемые соединения статистически значимо отличались от группы контроля.

Fig. 1. Comparison of relative changes in latency period for test compounds and reference drug. All test compounds showed statistically significant differences compared to the control group.

 

Воспалительная боль

На рис. 2 представлено относительное изменение (Δ%) количества болевых реакций в I и II фазе, вызванное введением исследуемых соединений. За начало отсчета принимались результаты контрольной группы. Согласно литературным данным, в данной модели снижение количества реакций в I фазе характерно для анестезирующих соединений, снижение количества реакций во II фазе — для противовоспалительных средств, в то время как опиоидные анальгетики должны оказывать влияние на обе фазы [17].

 

Рис. 2. Изменение количества болевых реакций в I и II фазе. Относительные значения: *различия статистически значимы относительно группы контроля; #различия статистически значимы относительно препарата сравнения. Данные для препарата сравнения и РУ-1205 взяты из источника [3].

Fig. 2. Changes in pain response counts in phase I and phase II. Relative values are shown: *statistically significant differences compared to the control group; ^#statistically significant differences compared to the reference drug. Data for the reference drug and RU-1205 were obtained from [3].

 

Нейрогенная боль

Исследования проводили в 2 этапа: через 7 и через 14 дней после моделирования патологии для оценки прогрессирования. На рис. 3 представлены графики, отражающие изменения порога болевой реакции и латентного периода удержания поврежденной конечности на холодной пластине в зависимости от времени и введенных соединений.

 

Рис. 3. Изменение болевой (a) и температурной (b) чувствительности на разных этапах исследования под действием изучаемых соединений. *Различия статистически значимы относительно показателей группы контроля в соответствующий день; ^#различия статистически значимы относительно показателей препарата сравнения в соответствующий день.

Fig. 3. Changes in pain (a) and thermal (b) sensitivity at different stages of the study under the influence of test compounds. *Statistically significant differences compared to the control group on the corresponding day; ^#statistically significant differences compared to the reference drug on the corresponding day.

 

Изучение аверсивной активности

С целью изучения выраженности аверсивного эффекта оценивалась длительность нахождения животного в той или иной камере. В первый день исследования животные предпочитали находится в камере, которая затем в ходе обучения была случайным образом выбрана как ассоциированная с введением растворителя, причем различия в длительности периода были статистически значимы (рис. 4).

 

Рис. 4. Изменения длительности пребывания животного в различных камерах установки на 1-й и на 10-й день обучения на фоне введения соединения BIF-70 (а) или соединения BIF-72 (b). *Различия указанных групп статистически значимы (Two-way ANOVA, p <0,05).

Fig. 4. Changes in duration of animal presence in different chambers of the apparatus on day 1 and day 10 of training following administration of compound BIF-70 (а) or of compound BIF-72 (b). *Statistically significant differences between the indicated groups (Two-way ANOVA, p <0.05).

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее проведенные исследования [5] показали, что соединения BIF-70 и BIF-72 проявляют свойства, характерные для опиоидных анальгетиков. Все исследованные соединения проявили высокую анальгетическую активность, сравнимую с морфином и РУ-1205 (в равных дозировках) в модели термической соматической боли, статистически значимо увеличивая длительность латентного периода, что характерно для опиоидных анальгетиков.

В модели воспалительной боли BIF-70 статистически значимо подавляет болевые реакции в I фазе воспалительного ответа, превосходя по уровню активности буторфанол и РУ-1205. Во II фазе соединение статистически значимо снижало количество болевых реакций в сравнении с группой контроля на уровне препарата сравнения и РУ-1205. Подобное сочетание эффектов характерно для веществ с опиоидергической анальгетической активностью. Соединение BIF-72 в модели воспалительной боли не проявило статистически значимого эффекта в I фазе болевого ответа, однако статистически значимо снижало количество болевых реакций во II фазе, превосходя остальные группы. Подобный эффект характерен скорее для нестероидных противовоспалительных средств, чем для опиоидных анальгетиков.

В модели нейропатической боли соединение BIF-70 статистически значимо увеличивает латентный период реакции в тесте термической гипералгезии, а также показатель А_50% через 14 дней после моделирования патологии, причем эффект проявляется на уровне препарата сравнения морфина в аналогичной дозировке. Отсутствие выраженных эффектов на 7-й день после операции характерно и для морфина, и для BIF-70. Кроме того, BIF-70, как и морфин, статистически значимо уступает по уровню активности габапентину и РУ-1205. Соединение BIF-72 в этой модели проявило свой эффект только в тесте тактильной аллодинии, однако, во-первых, статистически значимо превосходило морфин, а во-вторых, эффект проявлялся и на 7-й, и на 14-й день после операции. Тем не менее по уровню активности соединение уступало габапентину и РУ-1205.

Анальгетическая активность исследуемых соединений по своему профилю соответствует опиоидным анальгетикам, сравнимым по уровню активности с морфином или даже превосходящим его в некоторых случаях.

Что касается выраженности побочного эффекта, то введение соединения BIF-70 в течение 8 дней приводило к исчезновению различий в длительности пребывания в разных камерах установки — на 10-й день эксперимента длительность нахождения животных в обеих камерах практически не различалась, что может свидетельствовать о подкрепляющем или эйфорическом действии исследуемого соединения. Для поведения животных, входивших в группу BIF-72, в первый день эксперимента были характерны схожие тенденции, которые сохранялись и на 10-й день. То есть введение соединения в течение 8 дней не вызывало статистически значимых изменений в предпочтении места, на основании чего можно выдвинуть предположение об отсутствии у данного вещества аверсивного или эйфорического действия.

Данные результаты можно сравнить с результатами, полученными для специфического каппа-опиоидного агониста U-50,488 в публикации [22]. На рис. 5 можно видеть, что на 10-й день препарат сравнения формирует статистически значимые различия, причем в сторону увеличения количества времени, проведенного в камере, ассоциированной с введением растворителя, что связывают с формированием у животных аверсивного эффекта.

 

Рис. 5. Изменения длительности пребывания животного в различных камерах установки на 1-й и 10-й день обучения на фоне введения классического агониста каппа-опиоидных рецепторов с выраженным аверсивным эффектом — соединения U-50,488 [22]. *Различия указанных групп статистически значимы (тест Манна–Уитни, p <0,05).

Fig. 5. Changes in duration of animal presence in different chambers of the apparatus on day 1 and day 10 of training following administration of U-50,488, a classic kappa-opioid receptor agonist with pronounced aversive effects [22]. *Statistically significant differences between the indicated groups (Mann–Whitney U test, p <0.05).

 

С большей долей вероятности BIF-70 представляется классическим опиоидным анальгетиком, сходным по уровню активности с морфином и/или буторфанолом, что подтверждается не только его анальгетическим профилем, но и подкрепляющим действием в тесте предпочтения места. В то же время профиль активности BIF-72 ближе к противовоспалительным препаратам, хотя и не соответствует им в полной мере. Это может быть связано с тем, что для некоторых агонистов каппа-опиоидных рецепторов было показано периферическое противовоспалительное действие [21], связанное с активацией MyD88-зависимого сигнального пути, который способствует ядерной транслокации субъединицы p65 [19], ингибированием аденилатциклазы и, следовательно, снижением выработки циклического аденозинмонофосфата и инактивации протеинкиназы A [21].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В модели термической соматической боли для соединений BIF-70 и BIF-72 показана анальгетическая активность, сравнимая с классическим препаратом и ранее исследованным высокоактивным соединением.

В модели воспалительной боли активность, характерную для опиоидных анальгетиков, проявило только соединение BIF-70, причем степень выраженности эффекта соответствовала классическому анальгетику буторфанолу или превосходила его. В то же время BIF-72 не оказывал выраженного воздействия в первой фазе воспаления, несмотря на высокую активность во второй фазе.

В модели нейропатической боли для обоих соединений были получены неоднозначные результаты — несмотря на некоторые отличия от группы контроля, и BIF-70, и BIF-72 заметно уступали по уровню активности как препарату сравнения, так и ранее исследованному соединению РУ-1205. Тем не менее подобные свойства характерны и для классического опиоидного анальгетика морфина.

Изучение аверсивного действия соединений показало, что BIF-70 увеличивало длительность нахождения животного в камере, ассоциированной с введением вещества. В то же время BIF-72 не оказывал статистически значимого влияния на регистрируемый параметр.

Таким образом, профиль обезболивающей активности позволяет в дальнейших исследованиях позиционировать BIF-70 как новый наркотический анальгетик, в ряде случаев превосходящий существующие препараты по уровню активности. В свою очередь активность BIF-72 требует более детального исследования, поскольку полученные данные позволяют предположить наличие у него выраженной противовоспалительной активности.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Все авторы внесли существенный равноценный вклад.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этический комитет. Эксперименты были одобрены региональным исследовательским этическим комитетом Волгоградской области (регистрационный номер IRB00005839 IORG 0004900 (OHRP), протокол № 2077-2018 от 30 октября 2018 г.).

ADDITIONAL INFO

Authors’ contribution. All the authors made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication. All authors made a substantial equal contribution.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Ethics approval. The present study protocol was approved by the Volgograd Regional Research Ethics Committee (IRB registration number 00005839 IORG 0004900 (OHRP), Minutes No. 2077-2018 dated 2018 October 30).

[*] Постановление от 29.08.2014 № 51 «Об утверждении СП 2.2.1.3218-14 „Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)“, директива Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. «О защите животных, использующихся для научных целей».

About the authors

Gleb V. Pridvorov

Volgograd State Medical University; Kirov Military Medical Academy

Email: gleb.pridvorov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8070-693X
SPIN-code: 7998-0743

Lecturer of the Department of Pharmacology, Kirov Military Medical Academy; assistant of the Department of Pharmacology and Bioinformatics, Volgograd State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation

Russian Federation, Volgograd; Saint Petersburg

Alexander A. Spasov

Volgograd State Medical University

Email: aspasov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7185-4826
SPIN-code: 8777-1303

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences, Head of the Department of Pharmacology and Bioinformatics

Russian Federation, Volgograd

Vyacheslav P. Ganapolsky

Kirov Military Medical Academy; North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Author for correspondence.
Email: ganvp@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7685-5126
SPIN-code: 9872-8841

MD, Dr. Sci. (Medicine), Associate Professor, Acting Head of the Department of Pharmacology, Kirov Military Medical Academy; Professor of the Department of Pharmacology nd Pharmacy, North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, Ministry of Health of the Russian Federation

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Anastasiya D. Dulimova

Volgograd State Medical University

Email: bellochka0805@mail.ru

student

Russian Federation, Volgograd

Olga Yu. Mukha

Volgograd State Medical University

Email: olay.myha14@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0429-905X
SPIN-code: 2610-9280

Laboratory Technician of the Department of Pharmacology and Bioinformatics

Russian Federation, Volgograd

References

Supplementary files