Ионно-индуцированное гелеобразование альгината в присутствии аланингидроксиматных металлакраунов Sr(II), Са(II) И La(III)

Полный текст

Введение

Гелеобразование биополимеров активно исследуется для получения прочных и не растворимых в воде и в водных растворах полимерных комплексов – гидрогелей [1‒5]. Гидрогели на основе биополимеров, благодаря своим уникальным механическим и физико-химическим свойствам, а также высокой биосовместимости и нетоксичности, находят широкое и разностороннее применение в медицине [6‒10], биомедицине [10], в пищевой промышленности [11, 12], фармакологии [6], косметике, биотехнологии и биоинженерии [13‒15]. Одним из самых универсальных природных материалов, который образует гидрогели, является натриевая соль альгиновой кислоты [16, 17, 18]. Альгинат натрия – это линейный неразветвленный полисахарид, получаемый из морских водорослей, который содержит в составе полимолекулы повторяющиеся звенья 1,4-связанной b-D-маннуроновой кислоты и a-L-гулуроновой кислоты. Он способен быстро формировать обратимые гидрогели в мягких условиях (нейтральный pH и умеренные температуры) [19‒21]. Полимерные гидрогели на его основе нетоксичны, биосовместимы, биодеградируемы и обладают мукоадгезионными свойствами, что делает их перспективными для создания гидрогелей биомедицинского применения, в том числе для систем доставки лекарственных веществ с регулируемым высвобождением [7, 22‒25]. Необходимо отметить, что альгинат используется для получения микросфер-биоконтейнеров для клеточного материала, которые должны обладать максимальной стабильностью для сохранения его жизнеспособности и функциональной активности [21].

В основе образования альгинтаных гидрогелей лежит ионно-индуцированное взаимодействие карбоксильных групп альгиновой кислоты с положительно заряженными ионами [3]. Молекулы полимера координируются вокруг центра/ядра, роль которого выполняет подходящий по химическим свойствам ион металла, с образованием металл-альгинатного комплекса. Природа и тип сшивающего иона во многом определяет конечные свойства гидрогеля, его характеристики и соответственно область применения [26, 27]. Как правило, в качестве сшивающих центров для сборок полимерных гидрогелей используют катионы двухвалентных металлов. Наиболее часто встречающиеся в литературе – катионы Ba²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺. Эти системы достаточно хорошо изучены как с точки зрения механизма гелеобразования и внешних факторов, влияющих на него, так и конечных свойств геля [19, 28‒33]. В случае нахождения микросфер из таких гидрогелей в живом организме сшивающие ионы могут вымываться из геля, что будет приводить к ухудшению его физико-механических свойств, вплоть до полного разрушения. Использование трехвалентных и четырехвалентных металлов Al³⁺, Fe³⁺, Cr³⁺ [19, 29] и Ti⁴⁺ и Zr⁴⁺ [34] в качестве сшивающих катионов позволяет формировать гидрогели с более высокой по сравнению с двухвалентными металлами степенью сшивки и соответственно стабильностью.

Особый интерес вызывают трехвалентные ионы лантаноидов (Nd, Gd, Ce и Yb), проявляющие высокую координационную способность в ионно-индуцированной сшивке альгината натрия [35‒37]. Гибридные полимерные материалы на их основе обладают уникальными флуоресцентными свойствами ионов лантаноидов и характеризуются уникальной механической гибкостью и высокой химической стабильностью [37].

В рамках дальнейшего изучения применения ионов необычного строения несомненный интерес вызывают комплексные соединения, представляющие класс полиядерных аланингидроксиматных металламакроциклических соединений ‒ металлакраунов, структурно напоминающих краун-эфиры [38‒42], которые известны своим широким спектром биологической активности [43, 44]. Особенность их строения – наличие плоского металламакроцикла, состоящего из ионов меди(II) и аланингидроксиматных лигандов, а также координационно связанного центрального иона металла. Ниже приведена молекулярная структура металлакраунов: M = Ca(II), Sr(II), La(III).

 

 

Такая структура обеспечивает потенциальную возможность для аксиальной координации дополнительных анионов, что может позволить использовать металлакрауны в качестве центров сшивки альгината натрия.

В настоящей работе впервые исследована способность альгината натрия к образованию гидрогелей в присутствии водорастворимых гетероядерных металламакроциклических комплексов Sr(II)‒Cu(II), Са(II)‒Cu(II), La(III)‒Cu(II) в качестве новых сшивающих агентов. Интерес к таким исследованиям обусловлен возможностью получения нового гибридного полимерного материала с перспективными свойствами за счет биологически активных аланингидроксиматных металлакраунов и нетоксичной природы гидрогеля альгината-Na.

Экспериментальная часть

Материалы

Натриевая соль альгиновой кислоты из бурых водорослей (альгинат натрия) была приобретена у “Sigma” (А1112, низкая вязкость, η = 4–12 сП, 1% в H₂O при 25°C)). Аланингидроксиматные металлакрауны (МС(M)), где M = Ca(II), Sr(II), La(III) были получены ранее по методикам [45, 46].

Формирование МС(М)-альгинатных гидрогелевых микросфер

Гелеобразующие растворы готовили из кристаллических металлакраунов и дистиллированной воды (концентрация 50, 25 и 12.5 мг/мл). Альгинат натрия растворяли в дистиллированной воде в концентрации 20 мг/мл. Для формирования гидрогелевых микросфер полученный раствор в объеме 2 мл добавляли капельно через инъекционную иглу (маркировка 21G, скорость подачи 0.023 мл/с) к гелеобразующим растворам объемом 10 мл при непрерывном умеренном перемешивании (Т = 25 °С).

Полученные микросферы выдерживали в гелеобразующем растворе в течение 45 мин в режиме постоянного перемешивания на магнитной мешалке для предотвращения возможного слипания. Для определения количества МС(М) вошедшего в гидрогель в ходе гелеобразования через заданные промежутки времени из гелеобразующего раствора металлакрауна отбирали пробы по 0.2 мл, разбавляли дистиллированной водой до объема, равного 3 мл, и определяли концентрацию МС(М) в них спектрофотомерчески. Спектр поглощения исходного гелеобразующего раствора снимали до начала экструзии раствора альгинта натрия. Первый отбор производили через 30 с после прекращения экструзии, затем брали пятнадцать проб каждые две минуты, после этого временные интервалы между пробами составляли 5 мин.

Массу вошедшего в гидрогель МС(М) (m_in) определяли по убыли концентрации МС(М) в гелеобразующем растворе:

$m_{in}=\left(C_0-C_{end}\right)·V_0-\left(\sum _{i=1}^N{C}_i-N·C_{end}\right)·\Delta V$ ,(1)

Здесь С₀, С_end – исходная и конечная концентрации МС(М) в гелеобразующем растворе, С_i – концентрации МС(М) в пробе, V₀ = 10 мл – исходный объем гелеобразующего раствора, ΔV = 0.2 мл – объем отбираемых проб, N – количество проб. Стоит отметить, что второе слагаемое в выражении учитывает уменьшение объема гелеобразующего раствора за счет отбора проб для спектрофотометрического анализа.

Считая, что весь альгинат натрия переходит в гидрогель, и пренебрегая изменением его объема, концентрацию вошедшего в гидрогель МС(М) (C_in) можно найти из выражения

$C_{in}=\frac{m_{in}}{V_{Alg}}$  ,(2)

где V_Alg = 2 мл – объем альгинта натрия, добавленого в гелеобразующий раствор.

После завершения гелеобразования образовавшийся гидрогель отделяли от гелеобразующих растворов и помещали в 20 мл дистиллированной воды. Концентрацию вышедшего из гидрогеля МС(М) определяли также методом спектрофотометрии. Спектры поглощения регистрировали через определенные промежутки времени в течение 60 мин до постоянного значения оптической плотности раствора. Первый спектр снимали через 30 с после помещения гидрогеля в воду, последующие ‒ через неэквидистантные промежутки времени, которые при этом фиксировались. Массу МС(М) (m_out), вышедшего из гидрогеля в ходе промывания, определяли следующим образом:

${\mathrm{m}}_{\mathrm{out}}= {\mathrm{C}}_{\mathrm{wash}}·{\mathrm{V}}_{\mathrm{wash}}$  ,(3)

где С_wash – установившаяся концентрации МС(М) в промывочном растворе, V_wash = 20 мл – объем промывочного раствора.

Концентрацию участвующего в образовании МС(М)-альгинтного комплекса МС(М) (С_gel) вычисляли по формуле

${\mathrm{C}}_{\mathrm{gel}}=\frac{{\mathrm{m}}_{\mathrm{in}}-{\mathrm{m}}_{\mathrm{out}}}{{\mathrm{V}}_{\mathrm{Alg}}}$ .(4)

Средний диаметр сформировавшихся МС(М) альгинатных микросфер (MC(М)-Alg) определяли по фотографиям, сделанным с помощью оптического микроскопа МСП-1 (LOMO). Для каждого эксперимента выборка микросфер составляла не менее 20 штук.

Все спектрофотометрические исследования проводили на приборе СФ-56 (LOMO).

Результаты и их обсуждение

Для выявления способности металлакраунов индуцировать сшивку альгината натрия по ионному механизму была исследована возможность формирования альгинатных гидрогелевых микросфер в присутствии МС(М) методом экструзии (рис. 1). В этом случае гелеобразование альгината натрия протекает по внешнему механизму [39]. Сначала сшивается полимер, находящийся на периферии капли, с образованием внешней оболочки микросферы. Затем ионы сшивающего агента проникают внутрь альгинатной капли, формируя устойчивую гидрогелевую микросферу. Соответственно, при использовании в качестве сшивающих центров МС(М) процесс гелеобразования альгинатных микросфер должен проходить аналогично. На способность к сшиванию альгината натрия были исследованы три металлакрауна, различающиеся природой центрального иона: МС(Ca), МС(Sr), МС(La). Количество металлакрауна, вошедшего в гидрогель, определялось по разнице исходной (С₀) и конечной (С_end) концентрации МС(М) в гелеобразующем растворе. После завершения процесса гелеобразования получившийся гидрогель помещали в дистиллированную воду. При этом не участвующий в ионно-индуцированном сшивании МС(М) диффундирует в промывочный раствор. Количество последнего определяли по его концентрации в промывочном растворе (С_wash). Количество МС(М), связанного с молекулами альгината, вычисляли как разницу вошедшего в гидрогель и вымытого из него МС(М).

 

Рис. 1. Схема эксперимента: 1 – шприц, 2 – раствор альгината натрия, 3 – альгинатные микрокапли, 4 – емкость с гелеоразующим раствором МС(М), 5 – магнитная мешалка, 6 – гидрогелевые микросферы, 7 – емкость с промывочным раствором. Цветные рисунки можно посмотреть в электронной версии.

 

Значения максимумов оптической плотности D для металлакраунов МС(Ca), МС(Sr) и МС(La) соответствуют длине волн λ = 550, 555 и 570 нм. На примере МС(Sr) приведены характерные изменения спектров поглощения проб гелеобразующего раствора в ходе желирования альгината (рис. 2а). Видно, что положение максимального значения оптической плотности не смещается, а само значение уменьшается, что свидетельствует о снижении содержания МС(М) в гелеобразующем растворе. При промывании полученных микросфер в дистиллированной воде значение D наоборот увеличивается, что свидетельствует о росте концентрации МС(М) в промывочном растворе (рис. 2б).

 

Рис. 2. Изменение спектров поглощения растворов МС(Sr) гелеобразующего (а) и промывочного (б) растворов. Время 0 (1), 0.5 (2), 6 (3) и 20 мин (4) (а); 0.5 (1), 2 (2), 6 (3) и 20 мин (4) (б).

 

Исследование процесса желирования альгинатных капель показало, что в течение первых 10‒15 мин концентрация МС(Са) в гелеобразующем растворе уменьшается (рис. 3а, кривая 1), далее её изменения незначительны. При исходной концентрации MC(Ca) в гелеобразующем растворе С₀(MC(Ca) = 50 мг/мл содержание металлакрауна уменьшается до постоянного значения С_end(MC(Ca) = 41.3 мг/мл. При этом образуются не слипающиеся друг с другом гидрогелевые микросферы каплевидной формы со средним диаметром d = 2.3 мм (рис. 4а). При помещении готовых микросфер в дистиллированную воду молекулы МС(Са), которые не участвуют ионно-индуцированном сшивании альгината, вымываются из гидрогеля в течение 20–30 мин (рис. 3б, кривая 1). После этого концентрация МС(Са) в промывочном растворе стабилизируется и составляет 1.7 мг/мл.

 

Рис. 3. Изменение концентраций МС(Ca) в пробах гелеобразующего раствора (С_i) (a) и в промывочном растворе (С_wash) (б). Концентрация МС(Ca) в исходных растворах 50 (1), 25 (2) и 12.5 мг/мл (3).

 

Рис. 4. Альгинатные микросферы, сшитые МС (Ca) в гелеобразующих растворах концентрации 50 (а), 25 (б) и 12.5 мг/мл (в).

 

С уменьшением С₀(MC(Ca) с 50 до 25 мг/мл времена диффундирования МС(Ca) внутрь микросфер в процессе их желирования и из них при промывании не меняются. Конечная концентрация оставшегося в растворе МС(Ca) равна 20.7 мг/мл (рис. 2а, кривая 2), а концентрация МС(Са) в промывочном растворе – 1.2 мг/мл (рис. 2б, кривая 2). Средний диаметр формирующихся микросфер – 2.5 мм (рис. 4б).

При желировании альгинатных микросфер в гелеобразующем растворе с С₀(MC(Ca) = 12.5 мг/мл содержание металлакрауна также снижается и достигает значения 10.0 мг/мл (рис 2а, кривая 3). Однако в этом случае альгинатные капли практически сразу же разрушаются при перемешивании, и образуются бесформенные гелевые сгустки (рис. 4в). По всей видимости, этой концентрации МС(Ca) недостаточно для образования прочной стабильной гидрогелевой микросферы. Эксперименты по определению количества вышедшего МС(Ca) показали, что концентрация МС(Ca) в промывочном растворе сразу достигает максимального значения 9 мг/мл (рис. 3б, кривая 3).

Замена центрального иона в структуре металлакрауна с Са(II) на Sr(II) не приводит к существенным изменениям в процессе образования гидрогелевых микросфер. Изменения концентраций МС(Sr) в гелеобразующих растворах наблюдаются в течение первых 10–15 мин, а затем они не меняются (рис. 5а). При исходных концентрациях С₀(МС(Sr) 50 и 25 мг/мл получаются стабильные микросферы со средним диаметром 2.3 и 2.6 мм, соответственно (рис. 6а и 6б). При этом концентрация МС(Sr) в гелеобразующих растворах уменьшается с 50 до 41.8 мг/мл и с 25 до 20.4 мг/мл. После промывания сшитых микросфер в промывочном растворе устанавливаются следующие концентрации МС(Sr): С_wash(MC(Sr) = 1.0 мг/мл при сшивании альгината в растворе с C₀(МС(Sr) = 50 мг/мл и С_wash(MC(Sr) = 0.8 мг/мл при C₀(МС(Sr) = 25 мг/мл (рис. 5б). С умень шением концентрации МС(Sr) в гелеобразующем растворе до 12.5 мг/мл в ходе гелеобразования устанавливается концентрация С_end(МС(Sr) = 9.7 мг/мл, при этом, как и в случае использования раствора МС(Са) низкой концентрации, образуются бесформенные гидрогелевые образования (сгустки) (рис. 5в). При помещении последних в промывочный раствор там устанавливается концентрация 10 мг/мл (рис. 5б, кривая 3).

 

Рис. 5. Изменение концентраций МС(Sr) в пробах гелеобразующего раствора (С_i) (a) и в промывочном растворе (С_wash) (б). Концентрация МС(Sr) в исходных растворах 50 (1), 25 (2) и 12.5 мг/мл (3).

 

Рис. 6. Альгинатные микросферы, сшитые МС(Sr) в гелеобразующих растворах концентрации 50 (а), 25 (б) и 12.5 мг/мл (в).

 

При использовании МС(La) в качестве сшивающего агента наблюдаемые изменения концентрации МС(La) в гелеобразующем растворе имеет ту же тенденцию, как и в случаях с МС(Ca) и МС(Sr). Уменьшение концентрации МС(La) происходит в течение первых 10–15 мин (рис. 7), дальнейшие изменения концентрации металлакрауна в растворе незначительны. При последовательном уменьшении исходной концентрации МС(La) в гелеобразующем растворе с 50 до 25 и 12.5 мг/мл конечное содержание металлакрауна составило 41.8, 17.0 и 5.8 мг/мл, соответственно. По мере прикапывания альгината натрия в раствор MC(La) наблюдается формирование МС(М)-альгинатных микросфер, однако образующиеся гидрогелевые микросферы неустойчивые, при перемешивании раствора практически сразу же разрушаются для всех использованных концентраций MC(La). В результате образуются гидрогелевые сгустки (рис. 8). Проследить за динамикой вымывания металлакрауна из сшитого гидрогеля в случае использования MC(La) нет возможности, так как получающиеся гидрогелевые сгустки осаждаются на дно кюветы очень медленно и преграждают путь лучу анализирующего излучения спектрофотометра. В связи с этим была определена только конечная концентрация металлакрауна в промывочном растворе. Она составляла около 28–30 мг/мл для всех исходных концентраций МС(La).

 

Рис. 7. Изменение концентраций МС(La) в пробах гелеобразующего раствора (С_i). Концентрация МС(La) в исходных растворах 50 (1), 25 (2) и 12.5 мг/мл (3).

 

Рис. 8. Альгинатные микросферы, сшитые МС(La) в гелеобразующем растворе концентрации 50 мг/мл.

 

Для наглядного сравнения сшивающей способности металлакраунов с различными центральными ионами металла (Ca, Sr и La) экспериментальные результаты были сведены в табл. 1. Для каждого случая приведены следующие данные: исходная и конечная концентрации МС(М) в гелеобразующем растворе (C₀ и C_end), концентрация МС(М) в гидрогеле до и после промывания в дистиллированной воде (C_in и C_gel).

 

Таблица 1. Концентрация МС(М) в гелеобразующих растворах и гидрогелях

MC	Исходная концентрация МС(М) в гелеобразующем растворе C0, мг/мл	Конечная концентрация МС(М) в гелеобразующем растворе Cend, мг/мл	Концентрация МС(М), вошедшего в гидрогель Cin, мг/мл	Концентрация МС(М), участвующего в гелеобразовании Сgel, мг/мл
MC(Ca)	50.0	41.3	44	26
	25.0	20.7	21	10
	12.5	10.0	13	9
MC(Sr)	50.0	41.8	41	30
	25.0	20.4	23	15
	12.5	9.7	14	10
MC(La)	50.0	41.8	41	28
	25.0	17.0	40	30
	12.5	5.8	33	29

 

Сравнивая МC(Ca) и МС(Sr) можно отметить, что при желировании концентрация металлакрауна, вошедшего в гидрогель, всегда близка конечной концентрацией МС(М) в гелеобразующих растворах и равновесной концентрации, которая должна устанавливаться при добавлении 2 мл раствора альгината натрия к 10 мл гелеобразующего раствора (т.е. при разбавлении в 1.2 раза). При этом после промывки получающихся микросфер в дистиллированной воде в гидрогелях на основе MC(Sr) по сравнению с MC(Ca) остается больше ионов металлакруна. Соответственно в этих гидрогелях образуется больше стабильных центров сшивки.

В случае использования в качестве гелеобразующего агента MC(La) при C₀(МС(La) = 50 мг/мл в гидрогель входит столько же МС(La), что и других рассмотренных MC, т.е. устанавливается равновесная концентрация. При C₀(МС(La) = 25 мг/мл концентрация MC(La), вошедшего в гидрогель (C_in), превосходит его конечную концентрацию в гелеобразующем растворе в 2 раза (С_in(МС(La) = 40 мг/мл, С_end(МС(La) =17.0 мг/мл). А при C₀(МС(La) = 12.5 мг/мл C_in больше С_end более чем в 5 раз. После промывки таких гидрогелей концентрация МС(La) в них превышает аналогичные величины для гидрогелей, полученных с использованием других металлакраунов. Концентрация МС(La) участвующего в гелеобразовании составляет 28–30 мг/мл, причем она практически не зависит от исходной концентрации МС(La) в гелеобразующем растворе. Следовательно, из всех рассмотренных металлакраунов MC(La) наиболее эффективно образует МС(М)-альгинатный комплекс, и образующийся при этом гидрогель имеет очень высокую плотность сшивки. Это подтверждает и экспериментально наблюдаемое разрушение микросфер при желировании альгинатных капель в растворе MC(La) (рис. 8). При попадании капель в гелеобразующий раствор, по-видимому, образуется плотная внешняя оболочка, которая замедляет дальнейшую диффузию молекул МС(La) внутрь альгинатной сферы и тем самым препятствует сшивке ядра. Это приводит к разрушению образующихся микросфер даже при их умеренном перемешивании в гелеобразующей среде. При механическом разрыве оболочки свободный альгинат натрия выходит из микросферы и, попадая в гелеобразующий раствор, сшивается с образованием гелевых сгустков (рис. 8).

Таким образом, все три рассмотренных металлакрауна способны индуцировать сшивку альгината натрия по ионному механизму и могут использоваться в качестве сшивающих агентов. При помещении альгинатных капель в водные растворы MC(Ca) и MC(Sr) образуются гидрогелевые микросферы, причем MC(Sr) обладает несколько большей сшивающей способностью по сравнению с MC(Ca). При применении MC(La) эффективность сшивки настолько велика, что для получения стабильных гидрогелевых микросфер необходим более тщательный подбор условий их формирования.

Заключение

Впервые продемонстрирована возможность ион-индуцированного сшивания молекул альгината натрия водорастворимыми гетероядерными металламакроциклическими комплексами Sr(II)‒Cu(II), Са(II)‒Cu(II), La(III)‒Cu(II). Методом экструзии синтезированы гидрогелевые альгинатные микросферы c применением металлакраунов в качестве сшивающих агентов. Экспериментально установлено, что по своим способностям к ион-индуцированному сшиванию альгината натрия рассматриваемые металллакрауны располагаются в следующий ряд МС(La) > МС(Sr) > МС(Ca). Получено, что при использовании из гелеобразующих растворов на основе МС(Ca) и МС(Sr) формируются гидрогелевые микросферы размером 2.3–2.6 мм, которые устойчивы к внешнему механическому воздействию. При сшивании альгинатных капель в растворе на основе МС(La) образуется плотная внешняя оболочка, которая лимитирует дальнейшую диффузию молекул МС(La) внутрь формирующейся гелевой микросферы. Альгинат натрия, находящийся внутри микросферы, остается свободным, т.е. формируется неустойчивая к механическим воздействиям микросфера. В этом случае для получения стабильных гидрогелевых микросфер, вероятно, нужно уменьшать их размер или подбирать более деликатные условия формирования.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект 23-13-00139) (https://rscf.ru/project/23-13-00139/).

Исследования проводили с использованием оборудования центра коллективного пользования “Аналитический центр Института металлоорганической химии Российской академии наук”.

Об авторах

М. А. Батенькин

Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: batenkinmax@iomc.ras.ru
Россия, 603137, г. Нижний Новгород, ул. Тропинина, 49

Н. Д. Анисимова

Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук

Email: batenkinmax@iomc.ras.ru
Россия, 603137, г. Нижний Новгород, ул. Тропинина, 49

М. Ю. Захарина

Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук

Email: batenkinmax@iomc.ras.ru
Россия, 603137, г. Нижний Новгород, ул. Тропинина, 49

Г. С. Забродина

Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук

Email: batenkinmax@iomc.ras.ru
Россия, 603137, г. Нижний Новгород, ул. Тропинина, 49

М. А. Каткова

Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук

Email: batenkinmax@iomc.ras.ru
Россия, 603137, г. Нижний Новгород, ул. Тропинина, 49

С. А. Чесноков

Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук

Email: batenkinmax@iomc.ras.ru
Россия, 603137, г. Нижний Новгород, ул. Тропинина, 49

Список литературы

Дополнительные файлы