Ионно-индуцированное гелеобразование альгината в присутствии аланингидроксиматных металлакраунов Sr(II), Са(II) И La(III)

全文:

Введение

Гелеобразование биополимеров активно исследуется для получения прочных и не растворимых в воде и в водных растворах полимерных комплексов – гидрогелей [1‒5]. Гидрогели на основе биополимеров, благодаря своим уникальным механическим и физико-химическим свойствам, а также высокой биосовместимости и нетоксичности, находят широкое и разностороннее применение в медицине [6‒10], биомедицине [10], в пищевой промышленности [11, 12], фармакологии [6], косметике, биотехнологии и биоинженерии [13‒15]. Одним из самых универсальных природных материалов, который образует гидрогели, является натриевая соль альгиновой кислоты [16, 17, 18]. Альгинат натрия – это линейный неразветвленный полисахарид, получаемый из морских водорослей, который содержит в составе полимолекулы повторяющиеся звенья 1,4-связанной b-D-маннуроновой кислоты и a-L-гулуроновой кислоты. Он способен быстро формировать обратимые гидрогели в мягких условиях (нейтральный pH и умеренные температуры) [19‒21]. Полимерные гидрогели на его основе нетоксичны, биосовместимы, биодеградируемы и обладают мукоадгезионными свойствами, что делает их перспективными для создания гидрогелей биомедицинского применения, в том числе для систем доставки лекарственных веществ с регулируемым высвобождением [7, 22‒25]. Необходимо отметить, что альгинат используется для получения микросфер-биоконтейнеров для клеточного материала, которые должны обладать максимальной стабильностью для сохранения его жизнеспособности и функциональной активности [21].

В основе образования альгинтаных гидрогелей лежит ионно-индуцированное взаимодействие карбоксильных групп альгиновой кислоты с положительно заряженными ионами [3]. Молекулы полимера координируются вокруг центра/ядра, роль которого выполняет подходящий по химическим свойствам ион металла, с образованием металл-альгинатного комплекса. Природа и тип сшивающего иона во многом определяет конечные свойства гидрогеля, его характеристики и соответственно область применения [26, 27]. Как правило, в качестве сшивающих центров для сборок полимерных гидрогелей используют катионы двухвалентных металлов. Наиболее часто встречающиеся в литературе – катионы Ba²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺. Эти системы достаточно хорошо изучены как с точки зрения механизма гелеобразования и внешних факторов, влияющих на него, так и конечных свойств геля [19, 28‒33]. В случае нахождения микросфер из таких гидрогелей в живом организме сшивающие ионы могут вымываться из геля, что будет приводить к ухудшению его физико-механических свойств, вплоть до полного разрушения. Использование трехвалентных и четырехвалентных металлов Al³⁺, Fe³⁺, Cr³⁺ [19, 29] и Ti⁴⁺ и Zr⁴⁺ [34] в качестве сшивающих катионов позволяет формировать гидрогели с более высокой по сравнению с двухвалентными металлами степенью сшивки и соответственно стабильностью.

Особый интерес вызывают трехвалентные ионы лантаноидов (Nd, Gd, Ce и Yb), проявляющие высокую координационную способность в ионно-индуцированной сшивке альгината натрия [35‒37]. Гибридные полимерные материалы на их основе обладают уникальными флуоресцентными свойствами ионов лантаноидов и характеризуются уникальной механической гибкостью и высокой химической стабильностью [37].

В рамках дальнейшего изучения применения ионов необычного строения несомненный интерес вызывают комплексные соединения, представляющие класс полиядерных аланингидроксиматных металламакроциклических соединений ‒ металлакраунов, структурно напоминающих краун-эфиры [38‒42], которые известны своим широким спектром биологической активности [43, 44]. Особенность их строения – наличие плоского металламакроцикла, состоящего из ионов меди(II) и аланингидроксиматных лигандов, а также координационно связанного центрального иона металла. Ниже приведена молекулярная структура металлакраунов: M = Ca(II), Sr(II), La(III).

 

 

Такая структура обеспечивает потенциальную возможность для аксиальной координации дополнительных анионов, что может позволить использовать металлакрауны в качестве центров сшивки альгината натрия.

В настоящей работе впервые исследована способность альгината натрия к образованию гидрогелей в присутствии водорастворимых гетероядерных металламакроциклических комплексов Sr(II)‒Cu(II), Са(II)‒Cu(II), La(III)‒Cu(II) в качестве новых сшивающих агентов. Интерес к таким исследованиям обусловлен возможностью получения нового гибридного полимерного материала с перспективными свойствами за счет биологически активных аланингидроксиматных металлакраунов и нетоксичной природы гидрогеля альгината-Na.

Экспериментальная часть

Материалы

Натриевая соль альгиновой кислоты из бурых водорослей (альгинат натрия) была приобретена у “Sigma” (А1112, низкая вязкость, η = 4–12 сП, 1% в H₂O при 25°C)). Аланингидроксиматные металлакрауны (МС(M)), где M = Ca(II), Sr(II), La(III) были получены ранее по методикам [45, 46].

Формирование МС(М)-альгинатных гидрогелевых микросфер

Гелеобразующие растворы готовили из кристаллических металлакраунов и дистиллированной воды (концентрация 50, 25 и 12.5 мг/мл). Альгинат натрия растворяли в дистиллированной воде в концентрации 20 мг/мл. Для формирования гидрогелевых микросфер полученный раствор в объеме 2 мл добавляли капельно через инъекционную иглу (маркировка 21G, скорость подачи 0.023 мл/с) к гелеобразующим растворам объемом 10 мл при непрерывном умеренном перемешивании (Т = 25 °С).

Полученные микросферы выдерживали в гелеобразующем растворе в течение 45 мин в режиме постоянного перемешивания на магнитной мешалке для предотвращения возможного слипания. Для определения количества МС(М) вошедшего в гидрогель в ходе гелеобразования через заданные промежутки времени из гелеобразующего раствора металлакрауна отбирали пробы по 0.2 мл, разбавляли дистиллированной водой до объема, равного 3 мл, и определяли концентрацию МС(М) в них спектрофотомерчески. Спектр поглощения исходного гелеобразующего раствора снимали до начала экструзии раствора альгинта натрия. Первый отбор производили через 30 с после прекращения экструзии, затем брали пятнадцать проб каждые две минуты, после этого временные интервалы между пробами составляли 5 мин.

Массу вошедшего в гидрогель МС(М) (m_in) определяли по убыли концентрации МС(М) в гелеобразующем растворе:

$m_{in}=\left(C_0-C_{end}\right)·V_0-\left(\sum _{i=1}^N{C}_i-N·C_{end}\right)·\Delta V$ ,(1)

Здесь С₀, С_end – исходная и конечная концентрации МС(М) в гелеобразующем растворе, С_i – концентрации МС(М) в пробе, V₀ = 10 мл – исходный объем гелеобразующего раствора, ΔV = 0.2 мл – объем отбираемых проб, N – количество проб. Стоит отметить, что второе слагаемое в выражении учитывает уменьшение объема гелеобразующего раствора за счет отбора проб для спектрофотометрического анализа.

Считая, что весь альгинат натрия переходит в гидрогель, и пренебрегая изменением его объема, концентрацию вошедшего в гидрогель МС(М) (C_in) можно найти из выражения

$C_{in}=\frac{m_{in}}{V_{Alg}}$  ,(2)

где V_Alg = 2 мл – объем альгинта натрия, добавленого в гелеобразующий раствор.

После завершения гелеобразования образовавшийся гидрогель отделяли от гелеобразующих растворов и помещали в 20 мл дистиллированной воды. Концентрацию вышедшего из гидрогеля МС(М) определяли также методом спектрофотометрии. Спектры поглощения регистрировали через определенные промежутки времени в течение 60 мин до постоянного значения оптической плотности раствора. Первый спектр снимали через 30 с после помещения гидрогеля в воду, последующие ‒ через неэквидистантные промежутки времени, которые при этом фиксировались. Массу МС(М) (m_out), вышедшего из гидрогеля в ходе промывания, определяли следующим образом:

${\mathrm{m}}_{\mathrm{out}}= {\mathrm{C}}_{\mathrm{wash}}·{\mathrm{V}}_{\mathrm{wash}}$  ,(3)

где С_wash – установившаяся концентрации МС(М) в промывочном растворе, V_wash = 20 мл – объем промывочного раствора.

Концентрацию участвующего в образовании МС(М)-альгинтного комплекса МС(М) (С_gel) вычисляли по формуле

${\mathrm{C}}_{\mathrm{gel}}=\frac{{\mathrm{m}}_{\mathrm{in}}-{\mathrm{m}}_{\mathrm{out}}}{{\mathrm{V}}_{\mathrm{Alg}}}$ .(4)

Средний диаметр сформировавшихся МС(М) альгинатных микросфер (MC(М)-Alg) определяли по фотографиям, сделанным с помощью оптического микроскопа МСП-1 (LOMO). Для каждого эксперимента выборка микросфер составляла не менее 20 штук.

Все спектрофотометрические исследования проводили на приборе СФ-56 (LOMO).

Результаты и их обсуждение

Для выявления способности металлакраунов индуцировать сшивку альгината натрия по ионному механизму была исследована возможность формирования альгинатных гидрогелевых микросфер в присутствии МС(М) методом экструзии (рис. 1). В этом случае гелеобразование альгината натрия протекает по внешнему механизму [39]. Сначала сшивается полимер, находящийся на периферии капли, с образованием внешней оболочки микросферы. Затем ионы сшивающего агента проникают внутрь альгинатной капли, формируя устойчивую гидрогелевую микросферу. Соответственно, при использовании в качестве сшивающих центров МС(М) процесс гелеобразования альгинатных микросфер должен проходить аналогично. На способность к сшиванию альгината натрия были исследованы три металлакрауна, различающиеся природой центрального иона: МС(Ca), МС(Sr), МС(La). Количество металлакрауна, вошедшего в гидрогель, определялось по разнице исходной (С₀) и конечной (С_end) концентрации МС(М) в гелеобразующем растворе. После завершения процесса гелеобразования получившийся гидрогель помещали в дистиллированную воду. При этом не участвующий в ионно-индуцированном сшивании МС(М) диффундирует в промывочный раствор. Количество последнего определяли по его концентрации в промывочном растворе (С_wash). Количество МС(М), связанного с молекулами альгината, вычисляли как разницу вошедшего в гидрогель и вымытого из него МС(М).

 

Рис. 1. Схема эксперимента: 1 – шприц, 2 – раствор альгината натрия, 3 – альгинатные микрокапли, 4 – емкость с гелеоразующим раствором МС(М), 5 – магнитная мешалка, 6 – гидрогелевые микросферы, 7 – емкость с промывочным раствором. Цветные рисунки можно посмотреть в электронной версии.

 

Значения максимумов оптической плотности D для металлакраунов МС(Ca), МС(Sr) и МС(La) соответствуют длине волн λ = 550, 555 и 570 нм. На примере МС(Sr) приведены характерные изменения спектров поглощения проб гелеобразующего раствора в ходе желирования альгината (рис. 2а). Видно, что положение максимального значения оптической плотности не смещается, а само значение уменьшается, что свидетельствует о снижении содержания МС(М) в гелеобразующем растворе. При промывании полученных микросфер в дистиллированной воде значение D наоборот увеличивается, что свидетельствует о росте концентрации МС(М) в промывочном растворе (рис. 2б).

 

Рис. 2. Изменение спектров поглощения растворов МС(Sr) гелеобразующего (а) и промывочного (б) растворов. Время 0 (1), 0.5 (2), 6 (3) и 20 мин (4) (а); 0.5 (1), 2 (2), 6 (3) и 20 мин (4) (б).

 

Исследование процесса желирования альгинатных капель показало, что в течение первых 10‒15 мин концентрация МС(Са) в гелеобразующем растворе уменьшается (рис. 3а, кривая 1), далее её изменения незначительны. При исходной концентрации MC(Ca) в гелеобразующем растворе С₀(MC(Ca) = 50 мг/мл содержание металлакрауна уменьшается до постоянного значения С_end(MC(Ca) = 41.3 мг/мл. При этом образуются не слипающиеся друг с другом гидрогелевые микросферы каплевидной формы со средним диаметром d = 2.3 мм (рис. 4а). При помещении готовых микросфер в дистиллированную воду молекулы МС(Са), которые не участвуют ионно-индуцированном сшивании альгината, вымываются из гидрогеля в течение 20–30 мин (рис. 3б, кривая 1). После этого концентрация МС(Са) в промывочном растворе стабилизируется и составляет 1.7 мг/мл.

 

Рис. 3. Изменение концентраций МС(Ca) в пробах гелеобразующего раствора (С_i) (a) и в промывочном растворе (С_wash) (б). Концентрация МС(Ca) в исходных растворах 50 (1), 25 (2) и 12.5 мг/мл (3).

 

Рис. 4. Альгинатные микросферы, сшитые МС (Ca) в гелеобразующих растворах концентрации 50 (а), 25 (б) и 12.5 мг/мл (в).

 

С уменьшением С₀(MC(Ca) с 50 до 25 мг/мл времена диффундирования МС(Ca) внутрь микросфер в процессе их желирования и из них при промывании не меняются. Конечная концентрация оставшегося в растворе МС(Ca) равна 20.7 мг/мл (рис. 2а, кривая 2), а концентрация МС(Са) в промывочном растворе – 1.2 мг/мл (рис. 2б, кривая 2). Средний диаметр формирующихся микросфер – 2.5 мм (рис. 4б).

При желировании альгинатных микросфер в гелеобразующем растворе с С₀(MC(Ca) = 12.5 мг/мл содержание металлакрауна также снижается и достигает значения 10.0 мг/мл (рис 2а, кривая 3). Однако в этом случае альгинатные капли практически сразу же разрушаются при перемешивании, и образуются бесформенные гелевые сгустки (рис. 4в). По всей видимости, этой концентрации МС(Ca) недостаточно для образования прочной стабильной гидрогелевой микросферы. Эксперименты по определению количества вышедшего МС(Ca) показали, что концентрация МС(Ca) в промывочном растворе сразу достигает максимального значения 9 мг/мл (рис. 3б, кривая 3).

Замена центрального иона в структуре металлакрауна с Са(II) на Sr(II) не приводит к существенным изменениям в процессе образования гидрогелевых микросфер. Изменения концентраций МС(Sr) в гелеобразующих растворах наблюдаются в течение первых 10–15 мин, а затем они не меняются (рис. 5а). При исходных концентрациях С₀(МС(Sr) 50 и 25 мг/мл получаются стабильные микросферы со средним диаметром 2.3 и 2.6 мм, соответственно (рис. 6а и 6б). При этом концентрация МС(Sr) в гелеобразующих растворах уменьшается с 50 до 41.8 мг/мл и с 25 до 20.4 мг/мл. После промывания сшитых микросфер в промывочном растворе устанавливаются следующие концентрации МС(Sr): С_wash(MC(Sr) = 1.0 мг/мл при сшивании альгината в растворе с C₀(МС(Sr) = 50 мг/мл и С_wash(MC(Sr) = 0.8 мг/мл при C₀(МС(Sr) = 25 мг/мл (рис. 5б). С умень шением концентрации МС(Sr) в гелеобразующем растворе до 12.5 мг/мл в ходе гелеобразования устанавливается концентрация С_end(МС(Sr) = 9.7 мг/мл, при этом, как и в случае использования раствора МС(Са) низкой концентрации, образуются бесформенные гидрогелевые образования (сгустки) (рис. 5в). При помещении последних в промывочный раствор там устанавливается концентрация 10 мг/мл (рис. 5б, кривая 3).

 

Рис. 5. Изменение концентраций МС(Sr) в пробах гелеобразующего раствора (С_i) (a) и в промывочном растворе (С_wash) (б). Концентрация МС(Sr) в исходных растворах 50 (1), 25 (2) и 12.5 мг/мл (3).

 

Рис. 6. Альгинатные микросферы, сшитые МС(Sr) в гелеобразующих растворах концентрации 50 (а), 25 (б) и 12.5 мг/мл (в).

 

При использовании МС(La) в качестве сшивающего агента наблюдаемые изменения концентрации МС(La) в гелеобразующем растворе имеет ту же тенденцию, как и в случаях с МС(Ca) и МС(Sr). Уменьшение концентрации МС(La) происходит в течение первых 10–15 мин (рис. 7), дальнейшие изменения концентрации металлакрауна в растворе незначительны. При последовательном уменьшении исходной концентрации МС(La) в гелеобразующем растворе с 50 до 25 и 12.5 мг/мл конечное содержание металлакрауна составило 41.8, 17.0 и 5.8 мг/мл, соответственно. По мере прикапывания альгината натрия в раствор MC(La) наблюдается формирование МС(М)-альгинатных микросфер, однако образующиеся гидрогелевые микросферы неустойчивые, при перемешивании раствора практически сразу же разрушаются для всех использованных концентраций MC(La). В результате образуются гидрогелевые сгустки (рис. 8). Проследить за динамикой вымывания металлакрауна из сшитого гидрогеля в случае использования MC(La) нет возможности, так как получающиеся гидрогелевые сгустки осаждаются на дно кюветы очень медленно и преграждают путь лучу анализирующего излучения спектрофотометра. В связи с этим была определена только конечная концентрация металлакрауна в промывочном растворе. Она составляла около 28–30 мг/мл для всех исходных концентраций МС(La).

 

Рис. 7. Изменение концентраций МС(La) в пробах гелеобразующего раствора (С_i). Концентрация МС(La) в исходных растворах 50 (1), 25 (2) и 12.5 мг/мл (3).

 

Рис. 8. Альгинатные микросферы, сшитые МС(La) в гелеобразующем растворе концентрации 50 мг/мл.

 

Для наглядного сравнения сшивающей способности металлакраунов с различными центральными ионами металла (Ca, Sr и La) экспериментальные результаты были сведены в табл. 1. Для каждого случая приведены следующие данные: исходная и конечная концентрации МС(М) в гелеобразующем растворе (C₀ и C_end), концентрация МС(М) в гидрогеле до и после промывания в дистиллированной воде (C_in и C_gel).

 

Таблица 1. Концентрация МС(М) в гелеобразующих растворах и гидрогелях

MC	Исходная концентрация МС(М) в гелеобразующем растворе C0, мг/мл	Конечная концентрация МС(М) в гелеобразующем растворе Cend, мг/мл	Концентрация МС(М), вошедшего в гидрогель Cin, мг/мл	Концентрация МС(М), участвующего в гелеобразовании Сgel, мг/мл
MC(Ca)	50.0	41.3	44	26
	25.0	20.7	21	10
	12.5	10.0	13	9
MC(Sr)	50.0	41.8	41	30
	25.0	20.4	23	15
	12.5	9.7	14	10
MC(La)	50.0	41.8	41	28
	25.0	17.0	40	30
	12.5	5.8	33	29

 

Сравнивая МC(Ca) и МС(Sr) можно отметить, что при желировании концентрация металлакрауна, вошедшего в гидрогель, всегда близка конечной концентрацией МС(М) в гелеобразующих растворах и равновесной концентрации, которая должна устанавливаться при добавлении 2 мл раствора альгината натрия к 10 мл гелеобразующего раствора (т.е. при разбавлении в 1.2 раза). При этом после промывки получающихся микросфер в дистиллированной воде в гидрогелях на основе MC(Sr) по сравнению с MC(Ca) остается больше ионов металлакруна. Соответственно в этих гидрогелях образуется больше стабильных центров сшивки.

В случае использования в качестве гелеобразующего агента MC(La) при C₀(МС(La) = 50 мг/мл в гидрогель входит столько же МС(La), что и других рассмотренных MC, т.е. устанавливается равновесная концентрация. При C₀(МС(La) = 25 мг/мл концентрация MC(La), вошедшего в гидрогель (C_in), превосходит его конечную концентрацию в гелеобразующем растворе в 2 раза (С_in(МС(La) = 40 мг/мл, С_end(МС(La) =17.0 мг/мл). А при C₀(МС(La) = 12.5 мг/мл C_in больше С_end более чем в 5 раз. После промывки таких гидрогелей концентрация МС(La) в них превышает аналогичные величины для гидрогелей, полученных с использованием других металлакраунов. Концентрация МС(La) участвующего в гелеобразовании составляет 28–30 мг/мл, причем она практически не зависит от исходной концентрации МС(La) в гелеобразующем растворе. Следовательно, из всех рассмотренных металлакраунов MC(La) наиболее эффективно образует МС(М)-альгинатный комплекс, и образующийся при этом гидрогель имеет очень высокую плотность сшивки. Это подтверждает и экспериментально наблюдаемое разрушение микросфер при желировании альгинатных капель в растворе MC(La) (рис. 8). При попадании капель в гелеобразующий раствор, по-видимому, образуется плотная внешняя оболочка, которая замедляет дальнейшую диффузию молекул МС(La) внутрь альгинатной сферы и тем самым препятствует сшивке ядра. Это приводит к разрушению образующихся микросфер даже при их умеренном перемешивании в гелеобразующей среде. При механическом разрыве оболочки свободный альгинат натрия выходит из микросферы и, попадая в гелеобразующий раствор, сшивается с образованием гелевых сгустков (рис. 8).

Таким образом, все три рассмотренных металлакрауна способны индуцировать сшивку альгината натрия по ионному механизму и могут использоваться в качестве сшивающих агентов. При помещении альгинатных капель в водные растворы MC(Ca) и MC(Sr) образуются гидрогелевые микросферы, причем MC(Sr) обладает несколько большей сшивающей способностью по сравнению с MC(Ca). При применении MC(La) эффективность сшивки настолько велика, что для получения стабильных гидрогелевых микросфер необходим более тщательный подбор условий их формирования.

Заключение

Впервые продемонстрирована возможность ион-индуцированного сшивания молекул альгината натрия водорастворимыми гетероядерными металламакроциклическими комплексами Sr(II)‒Cu(II), Са(II)‒Cu(II), La(III)‒Cu(II). Методом экструзии синтезированы гидрогелевые альгинатные микросферы c применением металлакраунов в качестве сшивающих агентов. Экспериментально установлено, что по своим способностям к ион-индуцированному сшиванию альгината натрия рассматриваемые металллакрауны располагаются в следующий ряд МС(La) > МС(Sr) > МС(Ca). Получено, что при использовании из гелеобразующих растворов на основе МС(Ca) и МС(Sr) формируются гидрогелевые микросферы размером 2.3–2.6 мм, которые устойчивы к внешнему механическому воздействию. При сшивании альгинатных капель в растворе на основе МС(La) образуется плотная внешняя оболочка, которая лимитирует дальнейшую диффузию молекул МС(La) внутрь формирующейся гелевой микросферы. Альгинат натрия, находящийся внутри микросферы, остается свободным, т.е. формируется неустойчивая к механическим воздействиям микросфера. В этом случае для получения стабильных гидрогелевых микросфер, вероятно, нужно уменьшать их размер или подбирать более деликатные условия формирования.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект 23-13-00139) (https://rscf.ru/project/23-13-00139/).

Исследования проводили с использованием оборудования центра коллективного пользования “Аналитический центр Института металлоорганической химии Российской академии наук”.

作者简介

М. Батенькин

Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук

编辑信件的主要联系方式.
Email: batenkinmax@iomc.ras.ru
俄罗斯联邦, 603137, г. Нижний Новгород, ул. Тропинина, 49

Н. Анисимова

Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук

Email: batenkinmax@iomc.ras.ru
俄罗斯联邦, 603137, г. Нижний Новгород, ул. Тропинина, 49

М. Захарина

Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук

Email: batenkinmax@iomc.ras.ru
俄罗斯联邦, 603137, г. Нижний Новгород, ул. Тропинина, 49

Г. Забродина

Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук

Email: batenkinmax@iomc.ras.ru
俄罗斯联邦, 603137, г. Нижний Новгород, ул. Тропинина, 49

М. Каткова

Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук

Email: batenkinmax@iomc.ras.ru
俄罗斯联邦, 603137, г. Нижний Новгород, ул. Тропинина, 49

С. Чесноков

Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева Российской академии наук

Email: batenkinmax@iomc.ras.ru
俄罗斯联邦, 603137, г. Нижний Новгород, ул. Тропинина, 49

参考

补充文件