ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ В БИОМАССЕ ХЛОРЕЛЛЫ (CHLORELLA VULGARIS IPPAS С-2019)

Полный текст

Введение В последние десятилетия внимание исследователей обращено на растения, характеризующиеся высокой способностью к образованию вторичных веществ, относящихся к полифенольным соединениям в т.ч. флавоноидам [2]. Флавоноиды (рутин, кверцетин, гесперидин, катехины) являются соединениями, которые при регулярном приеме нормализуют состояние стенок сосудов и капилляров, увеличивают их прочность и эластичность, т.е. проявляют Р-витаминную активность, также они обладают антимикробными [9], антиоксидантными, противовоспалительными эффектами [4, 10, 11]. Одними из перспективных продуцентов, способных накапливать данные вещества, является микроводоросль Chlorella, представляющая собой обширную группу эукариотических, в основном фотоавтотрофных, микроорганизмов [6]. Хлорелла способна расти в крупномасштабных условиях. Согласно данным библиографических источников, микроводоросль хлорелла содержат различные классы флавоноидов, такие как изофлавоны, флавонолы, флаваноны и дигидрохалконы [6, 8]. Штаммы микроводоросли Chlorella отличаются высокой скоростью роста и проявляют хорошо выраженные антагонистические свойства при плотности клеток в культуре более 10 млн./мл, гибель бактерий наступает через 6-10 часов культивирования [7]. Несмотря на значительное количество исследований в области изучения флавоноидов микроводорослей, разработка метода количественного определения данных веществ является актуальным. Одним из наиболее простых, точных, быстрых и дешевых методов определения флавоноидов является дифференциальная спектрофотометрия [1, 3, 8]. В связи со сложившейся ситуацией в стране и мире, поиск новых отечественных, экономически выгодных источников флавоноидов является перспективным направлением исследований. Целью исследования явилась разработка методики количественного определения суммы флаваноидов в биомассе Chlorella vulgaris IPPAS С-2019. Методика Объектом исследования являлась биомасса штамма Chlorella vulgaris Beyerinck ИФР C-2019. Биомассу сушили при температуре не выше 40 °С в сушильном шкафу. Измельчение биомассы производили на гомогенизаторе Mikro-Dismembrator. В порошке альгомассы присутствуют частицы размером от 0,125 до 0,5 мм, причем большинство частиц порошка биомассы имеет размеры 0,125-0,160 мм. Для получения извлечений использовались: 95% этиловый спирт, гексан, ацетон, гептан, петролейный эфир. Для доказательства присутствия флавоноидов проводили качественные реакции [5] с экстрактами биомассы хлореллы, полученными методом мацерации при температуре 25 °С, соотношении 1:30 и продолжительности 180 мин. Основной специфической реакцией на флавоноиды, является цианидиновая проба (проба Шинода): к 500 мкл экстрактов хлореллы добавляли порошок магния и конц. HCl, появление красного окрашивания свидетельствует о наличии флавоноидов. Реакция с гидроксидом натрия: 500 мкл экстракта растворяли в 1 мл 10% NaOH и добавляли несколько капель концентрированного HCl. На присутствие флавоноидов указывало появление желтого окрашивания. Реакция с хлоридом алюминия: к 500 мкл экстрактов добавляли 2-3 капли 3% спиртового раствора хлорида алюминия, наблюдается реакция комплексообразования и появление желтого окрашивания с яркой зеленой флуоресценцией в УФ-лучах. Количественное содержание суммы флавоноидов проводили спектрофотометрическим методом на Спектрофотометре СФ-201 (ЗАО «НПКФ Аквилон», Россия). Для количественного определения суммы флавоноидов аналитическую навеску сырья, примерно 1 г биомассы, помещали в колбу со шлифом, вместимостью 100 мл и заливали 50 мл экстрагента. Колбу закрывали пробкой и взвешивали на лабораторных весах, с точностью до 10 мг. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане 60 мин. Затем колбу охлаждали в течение 30 мин, закрывали той же пробкой, снова взвешивали и восполняли недостающий экстрагент до первоначальной массы колбы. Извлечения фильтровали через бумажный беззольный фильтр (красный). 2 мл извлечения (раствор А) количественно переносили в мерную колбу на 25 мл, прибавляли 2 мл раствора алюминия хлорида 3% в спирте 95% и через 10 мин. - 2 капли разведенной уксусной кислоты. Объем раствора доводили до метки экстрагентом и оставляли на 30 мин. (раствор Б). В качестве раствора сравнения использовали раствор, приготовленный при тех же условиях, но без алюминия хлорида. Приготовление раствора СО рутина: 20 мг (точная навеска) рутина, помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, взвешивали и растворяли при нагревании на водяной бане в 50 мл спирта 95%, охлаждали, взвешивали, недостающий объем раствора восполняли спиртом этиловым 95% и перемешивали (раствор А СО рутина). 2 мл раствора СО рутина (раствора) количественно переносили в мерную колбу на 25 мл, прибавляли 2 мл спиртового раствора алюминия хлорида 2% и через 10 мин - 1 каплю разведенной уксусной кислоты 30%. Объем раствора доводили до метки спиртом этиловым 95% и оставляли на 30 мин. (раствор Б СО рутина). В качестве раствора сравнения использовали раствор, приготовленный при тех же условиях, но без алюминия хлорида. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X), вычисляли по формуле: Х =, где: A - оптическая плотность испытуемого раствора; A0 - оптическая плотность раствора СО рутина; m0 -масса СО рутина, г; m - масса сырья, г; W - потеря в массе при высушивании, %. Результаты исследования и их обсуждение Биомассу штамма Chlorella vulgaris ИФР C-2019 экстрагировали пятью различными растворителями. Все экстракты микроводорослей в своем составе содержали флавоноиды (табл. 1). Известно, что реакции на флавоноиды основаны на образовании окрашенных комплексных соединений. В качестве основной специфической реакции на флавоноиды использовалась цианидиновая проба (проба Шинода). При добавлении порошка магния и конц. HCl к экстрактам хлореллы, появлялось красное окрашивание, свидетельствующее о наличии флавоноидов. При добавлении гидроксида натрия к экстрактам хлореллы наблюдали появление желтого окрашивания. В реакции с хлоридом алюминия: наблюдалась реакция комплексообразования и появление желтого окрашивания с яркой зеленой флуоресценцией в УФ-лучах. Таким образом, все тесты дали положительные результаты, следовательно, все экстракты хлореллы штамма С-2019 содержат флавоноиды. Таблица 1. Результаты качественных реакций на флаваноиды с экстрактами из биомассы хлореллы Экстракт Проба Шинода: Mg + HCl NaOH AlCl3 Ацетоновый ++ ++ ++ Спиртовой +++ ++ +++ Гептановый + ++ + Гексановый + + + Петролейный +++ ++ +++ Примечание: высокая интенсивность окраски (+++), Умеренная интенсивность окраски (++), Низкая интенсивность окраски (+) и отсутствие (-) Так как на сегодняшний день состав фенольных соединений биомассы хлореллы штамма С-2019 еще не изучен, при разработке методов определяли сумму веществ (флавоноидов) в полученных экстрактах. Разработку методики количественного определения флавоноидов в сырье хлореллы штамма С-2019 проводили в несколько этапов. На первом этапе было показано, что спектры поглощения извлечений биомассы хлореллы имеют максимумы поглощения спектральных кривых при 337 нм., характерных для веществ флавоноидной природы. Следует отметить, что при использовании различных экстрагентов, данные параметры были неизменны. Было установлено, что в присутствии алюминия хлорида наблюдался батохромный сдвиг электронного спектра поглощения экстрактов хлореллы с максимумом поглощения, аналогичным раствору СО рутина (413 нм), (рис. 1). Рис. 1. Спектры поглощения извлечений с добавлением алюминия хлорида (1 - спиртовой раствор рутина; 2 - спиртовое извлечение; 3 - петролейное извлечение) Поэтому, при проведении количественного определения суммы флавоноидов в экстрактах из биомассы хлореллы, в качестве стандартного образца нами был выбран рутин. Следующим этапом было проведение эксперимента по определению экстрагента. Наиболее полное извлечение флавоноидов наблюдалось при использовании в качестве экстрагента, петролейного эфира и спирта этилового 95% (рис. 1). На третьем этапе было определено оптимальное соотношение «сырье-экстрагент» (1:50). Затем были определены временные параметры экстракции, обнаружено, что в течение 60 минут происходит максимальное извлечение флавоноидов из сырья (табл. 2). Таблица 2. Оптимальные показатели экстрагирования суммы флавоноидов из биомассы хлореллы С-2019 при длине волны 413 нм Экстрагент Соотношение «сырье: экстрагент» Время экстракции, мин Степень измельчения, мм Значение оптической плотности, D Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, % Тип экстрагента Ацетон 1:50 45 0,125-0,160 0,16 0,72±0,011 Спирт этиловый 1:50 45 0,125-0,160 0,45 1,49±0,031 Гептан 1:50 45 0,125-0,160 0,20 1,12±0,023 Гексан 1:50 45 0,125-0,160 0,01 0,04±0,002 Петролейный эфир 1:50 45 0,125-0,160 0,32 1,41±0,036 Время экстракции Спирт этиловый 1:50 45 0,125-0,160 0,44 1,11±0,010 Спирт этиловый 1:50 60 0,125-0,160 0,66 1,62±0,025 Спирт этиловый 1:50 90 0,125-0,160 0,38 0,83±0,012 Спирт этиловый 1:50 120 0,125-0,160 0,29 0,61±0,011 Сырье:экстрагент Спирт этиловый 1:30 60 0,125-0,160 0,25 1,32±0,032 Спирт этиловый 1:50 60 0,125-0,160 0,48 1,58±0,028 Спирт этиловый 1:100 60 0,125-0,160 0,45 1,45±0,033 В ходе статистической обработки данных пяти параллельных измерений выявлено, что содержание суммы флавоноидов, в пересчете на рутин, составляет 1,55-1,6%. Прецизионность методики (уровень повторяемости) оценивали путем анализа исследуемого образца лекарственного растительного сырья в 5-кратной повторности (табл. 3). Таблица 3. Результаты оценки прецизионности методики количественного определения суммы флавоноидов в биомассе хлореллы С-2019 Метрологические характеристики f Х, % S2 S Р, % t (табл.) ΔХ, % ε, % 5 0,56 0,00017 0,0131 95 2,776 0,079 2.9 Для оценки внутрилабораторной прецизионности количественный анализ спиртового экстракта проводился другим аналитиком в другие дни с использованием того же оборудования (табл. 4). Каждый аналитик проводил исследования в пяти повторности. Для каждого образца проводились исследования в количестве пяти повторности. Из таблицы 4 видно, что ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет не более 2,77% при определении суммы флавоноидов методом прямой спектрофотометрии в пересчете на рутин. Следовательно, дисперсии результатов анализа обоих химиков статистически эквивалентны и различия между полученными значениями являются случайными. Таблица 4. Валидацонная оценка внутрилабораторной прецизионности методики определения суммы флавоноидов в биомассе хлореллы С-2019 Аналитик 1 Аналитик 2 Метрологические характеристики Х, % Х, % Аналитик 1 Аналитик 2 0,55 0,55 Х, % = 0,554 Х, % = 0,550 0,54 0,57 S2 = 0,00013 S2 = 0,00015 0,56 0,54 S = 0,011 S = 0,012 0,57 0,55 ΔХ = 0,081 ΔХ = 0,078 0,55 0,54 ε, % = 2,56 ε, % = 2,77 Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки разработанной методики и позволяют предложить ее для количественного определения суммарного содержания флавоноидов в биомассе хлореллы штамма С-2019 в пересчете на рутин. Заключение В результате проведенных качественных реакций, было доказано наличие флавоноидов в экстрактах хлореллы С-2019. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в экстрактах хлореллы методом спектрофотомерии, с использованием стандартного образца рутина при аналитической длине волны 413 нм. Определено содержание флавоноидов в экстрактах хлореллы, которое варьирует от 0,1% до 1,62 %. Установлены оптимальные параметры экстракции флавоноидов из биомассы хлореллы штамма С-2019 (экстрагент - спирт этиловый 95%, соотношение «сырье-экстрагент» 1:50, при температуре 95 °С и продолжительности 60 мин. на кипящей водяной бане). Проведена валидационная оценка разработанной методики по показателям прецизионность (уровень повторяемости), внутрилабораторная прецизионность, правильность в соответствии с ГФ РФ XIV издания. Исходя из результатов валидационной оценки результатов эксперимента, можно говорить о пригодности использования данной методики для количественной оценки суммы флавоноидов в пересчете на рутин, в биомассе хлореллы.

Об авторах

Александр Владимирович Митишев

Пензенский государственный университет

Email: email@example.com
старший преподаватель кафедры «Общая и клиническая фармакология» ФГБОУ ВО «Пензенский государственный университет» Россия, 440026, Пенза, ул. Красная, 40

Евгений Евгеньевич Курдюков

Пензенский государственный университет

Email: email@example.com
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры «Общая и клиническая фармакология» ФГБОУ ВО «Пензенский государственный университет» Россия, 440026, Пенза, ул. Красная, 40

Елена Федоровна Семенова

Медицинская академия имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского»

Email: email@example.com
кандидат биологических наук, профессор кафедры «Фармация» Медицинской академии имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского» Россия, 295007, Республика Крым, Симферополь, проспект Академика Вернадского, 4

А. С Феднина

Пензенский государственный университет

Email: email@example.com
Россия, 440026, Пенза, ул. Красная, 40

Алена Игоревна Евтушенко

Пензенский государственный университет

Email: email@example.com
студентка стоматологического факультета ФГБОУ ВО «Пензенский государственный университет» Россия, 440026, Пенза, ул. Красная, 40

Список литературы

Дополнительные файлы