УРОВНИ НЕЙРОСПЕЦИФИЧЕСКИХ БЕЛКОВ У НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ С ИЗОИММУНИЗАЦИЕЙ ПО СИСТЕМАМ АВО И РЕЗУС

Полный текст

Введение Нейроспецифические белки, как маркеры повреждения головного мозга привлекают все большее внимание и исследуются по всем направлениям заболеваний центральной нервной системы (ЦНС). Инфекция ЦНС, травма, гипоксия, воспаление или дегенерация приводят к повреждению клеток и скоплению продуктов распада во внеклеточной жидкости головного мозга, а также к повышению проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Проникая в спинномозговую жидкость и в кровоток, эти белки могут быть измерены доступными способами. Степень повышения концентрации этих биомаркеров отражает тяжесть травмы; клеточная специфичность намекает на характер и, возможно, на место повреждения; а последовательный отбор проб дает информацию об эволюции повреждения [3]. Одним из ключевых биомаркеров с высоким диагностическим потенциалом является нейронспецифическая енолаза (NSE). Это диагностически значимый маркер гипоксически-ишемических, инфекционных и опухолевых повреждений центральной нервной системы как у взрослых, так и у детей, не зависящим от пола и возраста пациента [6]. Гипоксия у недоношенных детей проявляется выраженным угнетением дыхательной активности митохондрий и снижении активности аэробных ферментов. Повреждение мембран нейронов приводит к повышению NSE, концентрация которой коррелирует со степенью тяжести поражения ЦНС [5]. В то же время уровни нейронспецифических биомаркеров повреждения головного мозга у новорожденных с изоиммунизацией мало изучались. Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) - это белок из класса цитокинов, семейства факторов роста и подсемейства нейротрофинов; выявляется в глиальных и преимущественно в нейрональных клетках. Нейротрофический, от греческого нейро и трофос, примерно переводится как «жизненно важное питание для мозга» [8]. На определенных этапах функционального развития головного мозга BDNF может выполнять различные функции: как способствовать разрушению избыточных нейронов (апопотоз) и синаптических связей (синаптический прунинг), что необходимо для нормального развития мозга ребенка, так и осуществлять нейропротекторную функцию, в тех случаях, когда мозг подвергается действию неблагоприятных факторов (ишемия, гипогликемия, нейротоксичность), которые могут привести к повреждению нервных клеток. Нейротрофины имеют отношение к любому повреждению нервной ткани, в том числе ишемическому, и контролируют процессы гибели, выживаемости и пластичности нейронов. Данные, показывающие основополагающую роль BDNF в опосредовании нейропротекции против тяжелого неонатального повреждения головного мозга, позволяют предположить, что введение экзогенного BDNF может быть новым терапевтическим вариантом для улучшения результатов этого трудноизлечимого расстройства [1]. Участие BDNF в нейрогенезе и синаптической пластичности предполагает важность нейротрофина для таких когнитивных функций, как обучение и память. Изменения уровней BDNF в меконии, пуповинной крови или в сыворотке крови матери или новорожденного может использоваться в качестве дополнительных маркеров повреждения головного мозга у плода или новорожденного [2]. Во время роста плода аномалии в синтезе BDNF могут нарушить регуляцию развития ЦНС и, в частности, развития лимбической системы с длительным воздействием на нейронные связи [2]. BDNF играет решающую роль в таких процессах, как замедление клеточной гибели, воспаления, астроглиоза и развития постгеморрагической гидроцефалии, а также улучшении нейрогенеза и миелинизации при внутрижелудочковых кровоизлияниях [1]. Белки S100 являются регуляторами роста и дифференцировки клеток. В ЦНС в высоких концентрациях определяется субьединица S100B, которая синтезируется астроцитами, олигодендроцитами и шванновскими клетками [4]. Основными функциями этого белка являются межклеточные коммуникации, рост клеток, передача внутриклеточных сигналов, а также в развитие и поддержание ЦНС [6]. Повреждение гематоэнцефалического барьера приводит к попаданию белка S100B в спинномозговую жидкость и кровоток [6]. При этом повышение концентрации S100B может оказывать нейротоксическое действие, индуцируя апоптоз, вызывая высвобождение провоспалительных цитокинов, а также оксида азота из клеток астроглии и способствуя окислительному стрессу [4, 6, 7]. Таким образом, белок S100B указывает не только на повреждение центральной нервной системы, но и может усугубить его. Уровень S100B изучался у пациентов с черепно-мозговой травмой, инфекции ЦНС (в том числе и у новорожденных), при болезни Альцгеймера, деменции, инфаркте головного мозга, внутричерепных кровоизлияниях. Поскольку белок S100B легко определяется в различных биологических жидкостях - спинномозговой жидкости, крови, моче, он может использоваться в качестве биомаркера повреждения гематоэнцефалического барьера и патологии ЦНС [6]. В то же время уровень данного протеина у новорожденных с изоиммунизацией не изучался. Цель исследования - изучение уровней нейроспецифических белков сыворотки крови у новорожденных детей с изоиммунизацией по системам АВО и резус. Методика Для выполнения поставленной цели нами было обследовано 73 новорожденных детей, из которых были сформированы группы: 36 пациентов с изоиммунизацией по Rh-фактору и системе АВО в возрасте от 6 до 14 дней, 10 пациентов с неонатальной желтухой в возрасте от 6 до12 дней, 10 пациентов с гипоксически-ишемической энцефалопатией в возрасте от 5 до 10 дней и 17 человек контрольной группы - условно здоровых новорожденных в возрасте от 2 до 3 дней. Согласно протоколам МЗ РБ детям проводились следующие диагностические тесты: 1. Сбор данных анамнеза (анализ течения беременности и родов у матери, акушерско-гинекологического анамнеза и соматического здоровья матери, анализ физического развития, течения периода адаптации новорожденного); 2. Клиническое обследование по органам и системам; 3. Стандартные лабораторные методы (общий клинический анализ крови (уровень гемоглобина, количество эритроцитов, гематокритное число, количество ретикулоцитов, цветовой показатель, скорость оседания эритроцитов, количество тромбоцитов, уровень лейкоцитов с подсчетом лейкоцитарной формулы), общий анализ мочи, копрограмма, биохимический анализ крови (глюкоза, билирубин общий, прямой и непрямой, общий белок, альбумин, электролиты, СРБ, креатинин, мочевина), определение группы крови и Rh-фактора, прямая проба Кумбса, желатиновая проба; 4. Инструментальные методы исследования (УЗИ головного мозга, сердца и органов брюшной полости). Клиническое наблюдение за пациентами включало оценку неврологического и соматического статусов. В результате клинического обследования было установлено, что срок гестации у пациентов с изоиммунизацией по Rh-фактору и системе АВО составил 38; 38-39 недель, у пациентов с неонатальной желтухой - 39; 38-40 недель, у пациентов с гипоксически-ишемической энцефалопатией 38; 38-38 недель, у условно здоровых новорожденных 39; 38-39 недель. Группы статистически значимо не различаются (p> 0,05). Балл по шкале Апгар на 1 минуте у пациентов с изоиммунизацией по Rh-фактору и системе АВО составил 8; 6 -8, у пациентов с неонатальной желтухой - 8; 8 - 8, у пациентов с гипоксически-ишемической энцефалопатией 8; 6 - 8, у условно здоровых новорожденных 8; 8 - 8. Группы статистически значимо не различаются (p> 0,05). Балл по шкале Апгар на 5 минуте у пациентов с изоиммунизацией по Rh-фактору и системе АВО составил 8; 7 - 8, у пациентов с неонатальной желтухой - 8; 8 - 8,5, у пациентов с гипоксически-ишемической энцефалопатией 8; 7 - 8, у условно здоровых новорожденных 9; 8 - 9. Группы статистически значимо не различаются (p> 0,05) Также было установлено, что масса тела у пациентов с изоиммунизацией по Rh-фактору и системе АВО составил 3160; 2490 - 3500 г, у пациентов с неонатальной желтухой - 3500; 3235 - 3890 г, у пациентов с гипоксически-ишемической энцефалопатией 2795; 2460 - 3520 г, у условно здоровых новорожденных 3040; 2550 - 3350 г. Группы статистически значимо не различаются (p> 0,05). Уровень общего билирубина у пациентов с изоиммунизацией по Rh-фактору и системе АВО составил 144,4; 107 - 207 мкмоль/мл, у пациентов с неонатальной желтухой - 260,65; 237,95 - 301,95 мкмоль/мл, у пациентов с гипоксически-ишемической энцефалопатией 131,35; 104,7 - 154 мкмоль/мл, у условно здоровых новорожденных 135; 97 - 173 мкмоль/мл. У пациентов с неонатальной желтухой наблюдаются статистически значимо более высокие уровни билирубина, по сравнению с остальными группами (p<0,05), пациенты с изоиммунизацией, энцефалопатией и условно здоровые новорожденные статистически значимо не различались между собой (p> 0,05). Из особенностей акушерско-гинекологического анамнеза матерей установлено, что новорожденные с изоиммунизацией по Rh-фактору и системе АВО родились от 2; 1 - 4 беременности, пациенты с неонатальной желтухой - родились от 2; 1 - 2 беременности, новорожденные с гипоксически-ишемической энцефалопатией родились от 2; 1 - 3 беременности, практически здоровые новорожденные родились от 2; 1 - 2 беременности. Группы статистически значимо не различаются (p> 0,05). В анамнезе у матерей пациентов группы изоиммунизации наблюдались: хроническая гипоксия плода у 17 (46%) человек, фетоплацентарная недостаточность у 9 (24,3%), сахарный диабет у 4 (10,8%), артериальная гипертензия у 8 (21,6%), гестоз у 3 (8,1%). В группе неонатальной желтухи: хроническая гипоксия плода у 1 (10%) человека, фетоплацентарная недостаточность у 1 (10%), артериальная гипертензия у 1 (10%), сахарный диабет и гестоз - не наблюдались. У пациентов в группе гипоксически-ишемической энцефалопатии: хроническая гипоксия плода у 6 (60%) человек, фетоплацентарная недостаточность у 4 (40%), артериальная гипертензия у 1 (10%), гестоз у 2 (20%) сахарный диабет - не наблюдался. По акушерскому анамнезу группа пациентов с изоиммунизацией по Rh-фактору и системе АВО статистически значимо не различается от пациентов с гипоксически-ишемической энцефалопатией (p> 0,05), и в то же время установлена более высокая частота хроническая гипоксия плода по сравнению с неонатальной желтухой и условно здоровыми новорожденными (p<0,05). В качестве биологического материала использовали сыворотку крови. Для получения сыворотки крови в стерильные маркированные пробирки с оранжевыми крышками собирали периферическою венозную кровь пациента натощак в условиях процедурного кабинета. Кровь в закрытых пробирках выдерживали при комнатной температуре от 30 до 60 минут до образования сгустка. Кровь центрифугировали в течение 10 мин с угловой скоростью вращения ротора 1000 - 1500 оборотов в мин при комнатной температуре. С помощью автоматической пипетки со стерильными наконечниками, не касаясь слоя форменных элементов, переносили надосадочную жидкость (сыворотку крови) в маркированные пробирки типа «Эппендорф». Сыворотка крови замораживалась и хранилась при температуре не выше минус 70 оС. Для исследования использовали сыворотку крови, размороженную не более одного раза. Исследование концентрации нейроспецифических белков выполнялось методом твердофазного ИФА с использованием набора Human NSE Elisa Kit, Human Neuron specific Enolase ELISA Kit, S100B Human ELISA Kit (Elabscience ©). Результаты обрабатывались с помощью пакетов программ «Statistica» (Version 10, StatSoftInc., США, лицензия №STAФ999K347156W). Поскольку изучаемые показатели имели распределение отличное от нормального (р для критерия Шапиро-Уилка и Лиллиефорса во всех перечисленных группах <0,05) использовались непараметрические методы статистики. Вычисляли медиану (Ме), нижний 25-й (LQ) и верхний 75-й квартили (UQ). Данные представляли в виде: Медиана (Ме); нижний квартиль (LQ) - верхний квартиль (UQ). Для сравнения статистической значимости межгрупповых различий применялся U-критерий Манна-Уитни. Наличие корреляции оценивалось с использованием метода Спирмена, коэффициент корреляции представлялся в виде r. Значение коэффициента корреляции r=0,7-0,99 расценивали как сильную корреляцию, r=0,3-0,69 - корреляцию средней силы, r=0-0,29 - слабую корреляцию. Различия считались статистически значимыми при p<0,05. Работа выполнена при поддержке внутриуниверситетского стартап-гранта для молодых ученых ВГМУ. Результаты исследования Уровни NSE у пациентов с изоиммунизацией по системам АВО и резус. Результаты определения исследования представлены в табл. 1. Таблица 1. Концентрации нейрон-специфической енолазы в исследуемых группах Группа Ме LQ HQ P 1. Изоиммунизация (n=36) 2,371426 2,036191 2,652674 p1-2<0,05 p1-3>0,05 p1-4<0,001 p2-3>0,05 p2-4>0,05 p3-4<0,01 2. Неонатальная желтуха (n=10) 2,013157 1,834100 2,059224 3. Энцефалопатия (n=10) 2,177257 2,105812 2,548555 4. Контрольная (n=17) 1,856092 1,705280 2,013157 Было установлено, что у пациентов с изоиммунизацией по системам АВО и резус и гипоксически-ишемической энцефалопатией уровень NSE статистически значимо выше, чем в группе практически здоровых новорожденных (p<0,05, p<0,01, соответственно). У пациентов с изоиммунизацией по системам АВО и резус концентрации нейронспецифической енолазы выше, чем в группе неонатальной желтухи (p<0,001). В то же время не выявлено статистически значимых различий концентраций NSE в сыворотке крови у пациентов с изоиммунизацией и гипоксически-ишемической энцефалопатией (р>0,05), у пациентов с энцефалопатией и неонатальной желтухой (p>0,05) и пациентов с неонатальной желтухой и контрольной группой (p>0,05), (рис. 1). Рис. 1. Сравнение уровней NSE в исследуемых группах NSE коррелировал с повышением уровня эозинофилов (r= 0,45, p<0,05), с уровнем АЛТ (r= 0,42, p<0,05), снижением парциального давления кислорода в крови (r= -0,53, p<0,05), был повышен у пациентов, которым потребовалась кислородотерапия и зависел от FiO2 (r= 0,52, p<0,05). Уровни BDNF у пациентов с изоиммунизацией по системам АВО и резус. При определении нейротропного фактора головного мозга было установлено, что у пациентов с изоиммунизацией и гипоксически-ишемической энцефалопатией уровни BDNF статистически значимо ниже, чем у пациентов с неонатальной желтухой и контрольной группы (p<0,05). В то же время, статистически значимых различий концентраций BDNF в сыворотке крови у пациентов с неонатальной желтухой и контрольной группой не выявлено (p>0,05). Уровень BDNF у пациентов с неонатальной желтухой сопоставим с контрольной группой (табл. 2, рис. 2). Таблица 2. Концентрации нейротропного фактора в исследуемых группах Группа Медиана LQ HQ p 1. Изоиммунизация (N=34) 7121,407 6661,729 7537,138 p1-2<0,05 p1-3>0,05 p1-4<0,05 p2-3<0,05 p2-4>0,05 p3-4<0,05 2. Неонатальная желтуха (N=13) 7743,213 7540,341 8009,497 3. Энцефалопатия (N=14) 7034,975 1434,533 8106,829 4. Контрольная группа (N=17) 7901,970 7375,612 8298,796 Рис. 2. Сравнение уровней BDNF в исследуемых группах BDNF коррелировал с уровнем NSE (r= 0,41, p<0,05), общего белка (r= -0,46, p<0,05) и калия (r= -0,55, p<0,05). Нет статистически значимых различий уровней BDNF у пациентов с изоиммунизацией и гипоксически-ишемической энцефалопатией (p>0,05). На основании этого можно сделать вывод, что у пациентов с изоиммунизацией также имеется повреждение головного мозга. Статистически значимые различия концентраций BDNF в группах изоиммунизацией и неонатальной желтухи могут свидетельствовать о повреждении головного мозга у пациентов с изоиммунизацией факторами, не связанными исключительно с повышением билирубина. Уровни белка S100B у пациентов с изоиммунизацией по системам АВО и резус. Результаты исследования представлены в табл. 3. Таблица 3. Концентрации белка S100B в исследуемых группах Группа Ме LQ HQ P 1. Изоиммунизация (n=31) 0,00 0,00 32,72 p1-2<0,05 p1-3<0,05 p1-4<0,05 p2-3>0,05 p2-4>0,05 p3-4>0,05 2. Неонатальная желтуха (n=13) 0,00 0,00 0,00 3. Энцефалопатия (n=14) 0,00 0,00 0,00 4. Контрольная (n=17) 0,00 0,00 0,00 Было установлено, что у пациентов с неонатальной желтухой, гипоксически-ишемической энцефалопатией и практически здоровых новорожденных белок S100B в сыворотке крови не определяется (ниже уровня чувствительности метода - 18,75 пг/мл). В то же время, у пациентов с изоиммунизацией концентрация белка S100B составила 0; 0 - 32,72 пг/мл, что статистически значимо достоверно, чем у пациентов вышеперечисленных групп (p<0,05, рис. 3). S100В коррелировал с антропометрическими показателями, Апгар на 5 минуте (r= -0,38, p<0,05), с наличием предыдущих беременностей у матери (r=0,44, p<0,05), наличием хронической гипоксией плода (r= 0,42, p<0,05), был повышен у пациентов, которым потребовалась кислородотерапия (r= 0,52, p<0,05), а также у новорожденных с судорожным синдромом (r= 0,39, p<0,05). Обсуждение результатов исследования Поскольку различными авторами подтверждено повышение уровня NSE при гипоксически-ишемической энцефалопатии и наши данные согласуются с этим, можно сделать вывод, что у пациентов с гемолитической болезнью новорожденных также имеется повреждение головного мозга. Статистически значимые различия концентраций NSE в группах изоиммунизации и неонатальной желтухи могут свидетельствовать о повреждении головного мозга у пациентов с изоиммунизацией по системам АВО и резус факторами, не связанными исключительно с повышением билирубина. Однако, это требует подтверждения на большей выборке [5]. Рис. 3. Сравнение уровней S100B в исследуемых группах Как установлено различными авторами, BDNF замедляет клеточную гибель, процессы воспаления, а также улучшает нейрогенез и миелинизацию при различных повреждениях головного мозга. Установленное снижение уровня данного соединения у пациентов с изоиммунизацией и энцефалопатией в нашем исследовании с одной стороны указывают на значимые повреждения головного мозга при изоиммунизации и, с другой стороны, на нарушения процессов миелинизации у новорожденных [2]. Повышенные концентрации белка S100B у пациентов с изоиммунизацией по системам АВ0 и резус по сравнению с другими группами указывают на наличие повреждения нейроцитов и гематоэнцефалического барьера у пациентов с изучаемой патологией. Таким образом, данный белок может быть специфическим маркером повреждения головного мозга при изоиммунизации. Получены подобные данные другими авторами у пациентов с черепно-мозговой травмой, инфекциями ЦНС (в том числе и у новорожденных), при болезни Альцгеймера, деменции, инфаркте головного мозга, внутричерепных кровоизлияниях [4, 6, 7]. Заключение Установлено статистически значимое повышение уровня нейронспецифической енолазы сыворотки крови у пациентов с изоиммунизацией по сравнению с практически здоровыми новорожденными и пациентами с неонатальной желтухой. Уровни нейронспецифической енолазы статистически не отличаются у новорожденных с изоиммунизацией и пациентов с гипоксически-ишемической энцефалопатией. Установлено статистически значимое снижение уровня BDNF в сыворотке крови у пациентов с изоиммунизацией и энцефалопатией по сравнению с практически здоровыми новорожденными и пациентами с неонатальной желтухой (p<0,05). Уровни BDNF статистически не отличаются у новорожденных с гемолитической болезнью и пациентов с гипоксически-ишемической энцефалопатией (p>0,05). У практически здоровых новорожденных, пациентов с неонатальной желтухой и гипоксически-ишемической энцефалопатией белок S100B в сыворотке крови не определяется. В то же время установлено статистически значимое повышение уровня белка S100B в сыворотке крови у пациентов с изоиммунизацией по системам АВ0 и резус по сравнению с пациентами других групп (p<0,05). Белок S100B может быть специфическим маркером повреждения головного мозга при изоиммунизации. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что у пациентов с изоиммунизацией по системам АВО и резус имеются повреждения головного мозга. Изучение нейроспецифических белков дает дополнительные возможности для диагностики повреждений головного мозга у пациентов с изоиммунизацией, а также для прогноза раннего и отдаленного развития детей, отбора групп риска по возникновению неврологических нарушений и, впоследствии, контроля за проводимой терапией.

Об авторах

Ольга Александровна Прищепенко

Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет

Email: email@example.com
ассистент кафедры педиатрии №2, Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, Республика Беларусь Республика Беларусь 210009, Витебск, пр-т Фрунзе, 27

Вера Евгеньевна Потапова

Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет

Email: email@example.com
доцент кафедры педиатрии №2, кандидат медицинских наук, доцент, Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, Республика Беларусь Республика Беларусь 210009, Витебск, пр-т Фрунзе, 27

Вероника Алексеевна Малашкова

Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет

Email: email@example.com
студентка Витебского государственного ордена Дружбы народов медицинского университета, Республика Беларусь Республика Беларусь 210009, Витебск, пр-т Фрунзе, 27

Список литературы

Дополнительные файлы