РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ЦВЕТКАХ КАШТАНА КОНСКОГО РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНОВ ПРОИЗРАСТАНИЯ

Полный текст

Введение Флавоноиды - обширная группа полифенольных антиоксидантов, являющихся вторичными метаболитами, встречающимися преимущественно в надземной части растений [17, 26-28]. Данная группа химических соединений оказывает благотворное влияние на организм человека, в частности укрепляя стенки капилляров. Данное свойство важно при лечении заболеваний вен, связанных с увеличением прοницаемости их стенки [14, 22, 23, 25]. Каштан конский (Aesculus hippocastanum L.) растение рода Конский каштан (Aesculus L.), семейства Конскокаштановые (Hippocastanaceae A.Rich.) является перспективным лекарственным растительным сырьем (ЛРС), широко используемом при различных сосудистых заболеваниях в официнальной и народной медицине многих стран [1]. Фармакопейным сырьем на данный момент являются семена каштана конского, в народной медицине используют также цветки, листья, кору, почки и коробочки каштана [15, 16, 21, 24]. Согласно литературным данным известно, что в цветках каштана конского содержатся флавоноиды, а также другие группы биологически активных веществ (БАВ). Нормативная документация на данный вид сырья в настоящее время не разработана. Следовательно, при комплексном изучении фитохимического состава цветков актуальным следует считать исследование состава флавоноидов и разработку методик их идентификации и количественного определения для последующего включения в проект ФС на данное растительное сырье. Целью работы являлась разработка и валидация методики определения флавоноидов в цветках каштана конского различных регионов произрастания. Методика Объектом исследования служили высушенные воздушно-теневым методом цветки каштана конского обыкновенного, заготовленные в Петрозаводском городском округе, Ленинградской, Московской, Воронежской, Волгоградской областях и Ставропольском крае во время цветения в 2023 г. Выбор регионов заготовки сырья был обусловлен, во-первых, традиционным естественным ареалом культивирования данного растения (рис. 1), во-вторых, необходимостью оценки влияния совокупности природных факторов окружающей среды на накопление флавоноидов в цветках. Обобщенные данные о характеристике природных условий в изучаемых регионах заготовки цветков каштана конского за последние 30 лет (на примере Европейской части РФ) приведены в табл. 1. В работе использованы данные официальных сайтов [2, 6-13, 18, 20]. Рис. 1. Природный ареал культивирования каштана конского обыкновенного на территории РФ [19] Таблица 2. Характеристика природных условий в изучаемых регионах заготовки цветков каштана конского № Климати-ческий фактор Регион заготовки Петрозаводский городской округ Ленинград-ская обл. Московская обл. Воронежская обл. Волгоград-ская обл. Ставропольский край 1 Средне-годовое количество осадков, мм в год 756 667,7 669 518 363 767 2 Тип почв Подзолы иллювиально-железистые и иллювиально-гумусовые без разделения (подзолы иллювиально-мало- и многогумусовые) Подзолы глеевые торфянистые и торфяные преимущест-венно иллювиально-гумусовые Дерново-подзолистые преимущест-венно мелко- и неглубоко подзолистые Черноземы обыкновен-ные Черноземы южные Черноземы южные и обыкновенные мицеллярно-карбонатные (черноземы глубокие карбонатные) 3 Средне-годовая температура, °С 3,8 6,3 5,8 10 12 9,9 4 Количество солнечных дней 63 85 105 138 158 140 5 Климати-ческий пояс Умеренный 6 Тип климата Атлантикоконтинентальный Умеренно континентальный Континен-тальный Умеренно континентальный 7 Средняя температура января, °С -8,7 -7,9 -9 -10 -7 -3,5 8 Средняя температура июля, °С +18,1 +17,5 +18,3 +20 +24 +22,4 Для определения суммы флавоноидов адаптировали известную фармакопейную методику их количественного анализа методом дифференциальной спектрофотометрии [3]. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ «Спектр», СПб, Россия). Валидация методики проведена в соответствии с ОФС «Валидация аналитических методик» ГФ РФ XV издания [3]. Статистическая обработка результатов проведена в Microsoft Excel 2016. Озвучивание сырья при проведении экстракции проводили на ультразвуковой бане «Град 40-35» (Россия). Обсуждение результатов исследования Вид спектров поглощения извлечений из цветков относительно растворов сравнения демонстрировал наличие выраженного пологого максимума в диапазоне 407±2 нм, что свидетельствовало о возможности использования стандартного образца рутина для проведения пересчета суммы флавоноидов (рис. 2 а и б). Рис. 2. Вид дифференциальных спектров поглощения: А - спектр поглощения комплекса флавоноидов с алюминием цветков каштана конского различных регионов произрастания; Б - спектр поглощения комплекса РСО рутина с алюминием В предыдущих исследованиях нами были подобраны оптимальные условия извлечения суммы флавоноидов из данного ЛРС [4, 5] (на примере цветков, заготовленных от растения в Воронежской области) (табл. 2). Учитывая, что изучение технологических параметров, позволяющих максимально полно извлекать биологически активные вещества из растительного сырья приобретает все большую актуальность, проведено также изучение влияния ультразвука (УЗ) на извлечение флавоноидов из цветков каштана конского. Извлечение БАВ из цветков каштана проводили, нагревая точную навеску измельченных цветков каштана со спиртом этиловым на ультразвуковой бане при температуре 450С и частотой 50 Гц, с обратным холодильником по выше описанным параметрам. Таблица 2. Выбор оптимальных условий извлечения суммы флавоноидов из цветков каштана конского Исследуемый параметр извлечения Содержание суммы флавоноидов, % Экстрагент Вода Спирт этиловый 20% 40% 50% 70% 96% 2,10±0,03 2,27±0,04 3,89±0,10 3,77±0,02 4,36±0,11 3,63±0,04 Сырье: экстрагент Однократная 1:50 Однократная 1:100 Двукратная 1:50 Двукратная 1:100 3,51±0,1 2,8±0,08 3,65±0,11 4,51±0,14 Время экстракции, мин. 30 60 90 120 3,71±0,07 4,40±0,09 4,00±0,08 3,48±0,07 Временя созревания окраски 50 мин. Стабильность комплекса флавоноидов во времени С 50 до 60 минуты после добавления комплексообразователя Оптимальное соотношение извлечения и алюминия хлорида 2% 1:1 1:2 4,53±0,1 4,78±0,11 Подкисление раствором уксусной кислоты С добавлением уксусной к-ты Без добавления уксусной к-ты 3,37±0,11 4,46±0,13 Результаты сравнительной оценки двух способов выделения флавоноидов из цветков приведены в табл. 3, из которой следует, что при использовании водяной бани (суммарно по исследуемым параметрам получения извлечения) количество извлекаемых флавоноидов в два раза выше, чем при использовании УЗ-экстракции. Таблица 3. Сравнительная характеристика способов экстракции флавоноидов из цветков каштана конского Параметр получения извлечения УЗ-баня Водяная баня Размер частиц 0,5 мм 1,0 мм 2,0 мм 3,74±0,12 2,30±0,07 1,46±0,04 3,60±0,11 5,23±0,016 1,47±0,04 Концентрация спирта 40% 50% 70% 2,37±0,07 1,85±0,05 2,30±0,07 3,40±0,11 4,37±0,14 5,23±0,16 Время экстракции 30 мин. 60 мин. 120 мин. 1,12±0,03 2,30±0,07 1,27±0,04 1,86±0,06 5,23±0,16 1,79±0,05 Методика количественного определения: Аналитическую навеску измельченной до порошкообразного состояния растительного сырья помещали в колбу конической формы (объем 100 мл), 1 грамм (точная навеска) заливали в соотношении 1:50 спиртом этиловым 70%. Экстракцию осуществляли в течение 30 минут на водяной бане с обратным холодильником. Для получения раствора А, извлечение охлаждали и фильтровали через бумажный фильтр «Белая лента» в мерную колбу на 100 мл. Сырье и фильтр возвращали в коническую колбу заливали в соотношении 1:50 спиртом этиловым 70% и повторяли экстракцию в течении 30 мин. охлаждали и фильтровали через бумажный фильтр «Белая лента» в ту же мерную колбу на 100 мл, при необходимости доводили объем спиртом этиловым 70% до метки (раствор А). Рабочий раствор готовили в мерной колбе объемом 25 мл, куда помещали 1,0 мл раствора А, и 2,0 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте этиловом, объем раствора доводили до метки 95% спиртом этиловым. Раствор сравнения: 1,0 мл раствора А, доведенного 95% спиртом этиловым до метки в мерной колбе вместимостью 25,0 мл. Оптическую плотность измеряли через 50 мин. после добавления алюминия хлорида в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно измеряли оптическую плотность РСО рутина. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 1,0 мл 0,05% раствора рутина, 2,0 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте этиловом и доводили объем раствора 95% спиртом до метки. Раствор сравнения: в мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 1,0 мл 0,05% РСО рутина и доводили объем раствора 95% спиртом до метки. Приготовление РСО рутина и алюминия хлорида проводили в соответствие с НД [3]. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин (Х) в процентах в абсолютно сухом сырье вычисляли по формуле: , где А - оптическая плотность испытуемого раствора после взаимодействия с AlCl3; Ао - оптическая плотность РСО рутина после взаимодействия с AlCl3; а - масса сырья, г; ао - масса СО рутина, г; W - потеря в массе при высушивании, %. С использованием разработанной методики было определено содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин при анализе цветков каштана конского различных регионов произрастания (табл. 4). Таблица 4. Содержание суммы флавоноидов в цветках каштана конского различных регионов произрастания, в пересчете на рутин (%) Регион произрастания Сумма флавоноидов, % Петрозаводский городской округ 3,41±0,11 Ленинградская область 4,46±0,14 Московская область 3,30±0,11 Воронежская область 3,30±0,11 Волгоградская область 3,53±0,11 Ставропольский край 4,55±0,15 Содержание флавоноидов в зависимости от региона варьировало от 3,30 до 4,55%. Наибольшее содержание флавоноидов в пересчете на рутин показали цветки, заготовленные в Ставропольском крае (4,55%), что может быть связано с самым благоприятным сочетанием климатических условий региона (табл. 1). В результате расчета метрологических характеристик разработанной методики (на примере цветков каштана конского, произрастающих на территории Воронежской области) установлено, что относительная ошибка с доверительной вероятностью 95% составляет около 3%, т.е. находится в пределах случайной ошибки (табл. 5). Таблица 5. Метрологическая характеристика методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в цветках каштана конского (P=95 %; n=6) Xср S2 S Sxср ∆X ∆Xср ε, % εср , % 3,29743 0,010377 0,10187 0,04159 0,26181 0,10688 7,94 3,24 Валидация, как завершающий этап разработанной методики, была проведена на примере сырья, заготовленного в Воронежской области. Принятое опорное значение 3,32×10-4 г/мл извлечения. При установлении специфичности методики использовался метод добавок. К извлечению добавляли 0,5 мл 0,05% РСО рутина, что сопровождалось гиперхромным смещением максимума поглощения комплекса флавоноидов цветков каштана конского с алюминия хлоридом на дифференциальном спектре (рис. 3). Рис. 3. Вид дифференциальных спектров поглощения комплексов алюминия с флавоноидами каштана конского при оценке специфичности методики Для установления области линейности методики измеряли оптическую плотность 6 аликвот извлечения из цветков каштана конского обыкновенного в диапазоне от 70 до 130% от номинального значения, в результате чего была получена градуировочная зависимость (рис. 4). Рис. 4. Градуировочная зависимость величины оптической плотности от содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин в анализируемом растворе При определении показателя предел обнаружения установлено, что наименьшее количество определяемого вещества в образце, которое может быть обнаружено по разработанной методике, составило 0,2×10-5 г/мл. Оценку правильности разработанной методики проводили методом «введено-найдено» на четырех уровнях концентраций в 3 повторностях каждый (табл. 6). Процент восстановления методики соответствовал требованиям к данному показателю (100±5%). Таблица 6. Определение правильности методики количественного определения суммы флавоноидов в цветках каштана конского Было (принятое опорное значение) г суммы флавоноидов в извлечении Добавлено РСО рутина, г Ожидаемое содержание, г Полученное содержание, г % восстановления 0,0003323578 0,00035 0,0006823578 0,000702706 102,98 0,000705882 103,45 0,0006661420 97,62 0,00025 0,0005823578 0,000553019 95,00 0,000585186 100,50 0,000587940 100,96 0,0005 0,0008323578 0,000797561 95,82 0,000786100 95,00 0,000840623 100,99 0,000625 0,0009823578 0,000110695 112,68 0,001012886 103,11 0,001072103 109,14 Средний % восстановления методики 101,44 Прецизионность методики на этапе сходимости выявляли на 6 параллельных определениях в одних условиях на одном и том же оборудовании одним и тем оператором за один рабочий день (табл. 7). Таблица 7. Определение сходимости методики количественного определения флавоноидов в цветках каштана конского Номер опыта Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, % 1 3,27 2 3,32 3 3,18 4 3,19 5 3,40 6 3,42 Среднее значение (SD, %) 3,30 Относительное стандартное отклонение (RSD), % 3,09 Таким образом, в результате исследования установлена валидность разработанной методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в цветках каштана конского (табл. 8). Таблица 8. Валидационные характеристики методики количественного определения в цветках каштана конского обыкновенного суммы флавоноидов в пересчете на рутин Характеристика Значение Правильность R = 101,44% Сходимость RSD = 3,09% Линейность y=0,1363x+0,148, R2 = 0,9895 Минимальное значение, % 3,18 Максимальное значение, % 3,42 Среднее значение, % 3,30 Значение доверительного интервала (Р=95%), % 3,30±0,10688 Область линейности 0,66-3,99×10-5 г/мл извлечения Предел обнаружения 0,2×10-5 г/мл извлечения Заключение Таким образом, разработана и валидирована методика количественного содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в цветках каштана конского методом дифференциальной спектрофотометрии. Полученные результаты валидации позволяют рекомендовать методику для количественного определения флавоноидов в цветках каштана конского. Определена вариабельность накопления данной группы БАВ в сырье (от 3,30 до 4,55%) в зависимости от совокупности эколого-географических факторов региона произрастания. На основании проведенных исследований можно рекомендовать унифицированный критерий оценки качества данного сырья для будущего проекта ФС «Цветки каштана конского обыкновенного» по показателю «Количественное определение» суммы флавоноидов в пересчете на рутин не менее 2%.

Об авторах

Александр Денисович Дунилин

Воронежский государственный университет

Email: email@example.com
аспирант 1-го года обучения кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет», инженер-химик 394006, Россия, Воронеж, Университетская пл., 1

Ольга Валерьевна Тринева

Воронежский государственный университет

Email: email@example.com
доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» 394006, Россия, Воронеж, Университетская пл., 1

Татьяна Юрьевна Ковалева

Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России» (Сеченовский университет)

Email: email@example.com
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтического естествознания Института фармации им. А.П. Нелюбина ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России» (Сеченовский университет) 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, 8, стр. 2

Список литературы

Дополнительные файлы