ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СЫРЬЯ ГАРМАЛЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (PEGANUM HARMALA), СОБРАННОЙ В АХТУБИНСКОМ РАЙОНЕ АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ

Полный текст

Введение Гармала обыкновенная (Peganum harmala L.) - растение семейства Парнолистниковые (Zygophyllaceae), распространенный в аридном поясе Евразии от Средиземноморья до Монголии и Тибета [6, 22]. В составе Гармалы обыкновенной содержатся хиназолиновые (пеганин) и β-карболиновые алкалоиды (гармин, гарман) и их производные [3]. Пеганин обладает противопаркинсоническим, гипертензивным, миорелаксантным, стимулирующим дыхание, антисекреторным и цитопротекторным действием, и чаще всего применяется в неврологической практике, а также при бронхиальной астме, обладая способностью расслаблять бронхиальную стенку [7, 23]. Дезоксипеганина гидрохлорид, препарат на основе сырья Гармалы обыкновенной является антихолинэстеразным средством и применяется при миастении и миопатоподобных синдромах, при гемиплегии, гемипарезе [2]. Гармин обладает большим количеством фармакологических свойств, основные из них: противовоспалительное, нейропротекторное, противовирусное и антибактериальное [24]. Некоторые работы указывают на ингибирующее действие гармина и гармана на процесс агрегации тромбоцитов, а также антидепрессантное воздействие за счет ингибирования моноаминооксидазы [9]. В настоящее время гармин включен в Перечень наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю в Российской Федерации [10, 18]. Гармин входит в состав препарата «Ново-Пассит», включеного в Государственный реестр, отпускаемого без рецепта [13]. В Советском союзе заготовки сырья Гармалы обыкновенной травы велись на территории Казахской ССР, Киргизской ССР и Узбекской ССР. В настоящее время данное сырье является импортируемым. Качество сырья регламентируется ВФС 42-879-79 [19]. В целях обеспечения импортозамещения и лекарственной безопасности поиск отечественных источников лекарственного растительного сырья является важной задачей фармации. В Российской федерации Гармала обыкновенная распространена на территории Волгоградской, Астраханской областей, в республиках Калмыкия и Дагестан [3, 4]. Ее популяции, произрастающие в данных регионах, могут стать альтернативными источниками для сырья «Гармалы обыкновенной трава». Цель исследования - изучение сырья Гармалы обыкновенной трава, заготовленного в популяциях, произрастающих в Нижнем Поволжье, для оценки возможности импортозамещения данного вида сырья. Методика Материалом для выполнения работы послужило сырье «Гармалы обыкновенной трава», собранное на территории Астраханской области в Ахтубинском районе в июле 2023 г. Макроскопический анализ лекарственного растительного сырья «Гармалы обыкновенной трава» проводили c использованием стереомикроскопа Bresser Advance ICD 10х-160x в соответвии со стандартными методами согласно ОФС 1.5.1.0002 «Травы» [14]. Описание микроскопических признаков составляли, используя ОФС 1.5.3.0003 «Микроскопический и микрохимический анализ лекарственного растительного сырья и лекарственных средств растительного происхождения» Государственной фармакопеи Российской Феерации XV издания [15]. Микропрепараты изучали с помощью микроскопа Zeiss «Primo Star». Снимки изготовленных микропрепаратов были сделаны с помощью цифрового фотоаппарата Zeiss «Axiocam 105 color». Содержание дубильных веществ определяли методом пермангонатометрического титрования, согласно ОФС.1.5.3.0008 (Метод 1) [16]. Количественное определение содержания флавоноидов проводилось методом дифференциальной спектрофотометрии. Метод, основывался на получении комплекса с алюминия хлоридом, и снятии спектров на спектрофотометре при длине волны 390-450 нм. Экстракция проводилась 70% спиртом, соотношение 1:50 [8]. Количественное определение содержания алкалоидов было проведено двумя методами: 1) Спектрофотометрическим методом, этот метод рекомендуется для определения содержания карболиновых и хиназолиновых алкалоидов. 2) Методом, основанным на алкалиметрическом титровании. Методика была взята из ФС.2.5.0096.18, так как в термопсисе ланцетовидном также содержатся алкалоиды хиназолиновой группы [20]. Результаты исследования и их обсуждение Исследуемое сырье Гармалы обыкновенной трава представляет собой цельные густооблиственные стебли с плодами. Стебли бороздчатые, цилиндрические, ребристые, желтовато-зеленого цвета, длиной от 5 до 80 мм, толщиной до 8 мм. Листья сидячие, очередные, длиной 4-5 см, дважды перисто-рассеченные, хрупкие, в сырье они часто ломаются и представлены отдельными линейными сегментами. Жилкование целого листа - перистое, отдельного сегмента листа - параллельное. Плод представляет собой шаровидную трехгнездную коробочку с многочисленными семенами. Семена коричневые или буровато-серые, клиновидные, трехгранные, длиной 3-4 мм, с бугорчатой поверхностью (рис. 1). Рис. 1. Сырье Гармалы обыкновенной трава: а - общий вид сырья; б - стебель; в - сегменты листа; г - плод; д - сегмент листа; е - плод (вид снизу); ж - семя Внешние признаки исследуемого сырья Гармалы обыкновенной трава (Peganum Harmala herbae) полностью соответствуют описанию в ВФС 42-879-79, а также ряду литературных источников [10, 11, 13]. Микроскопические признаки. Эпидермис листа состоит из двух типов клеток, которые образуют перемежающиеся полосы, вытянутые вдоль сегмента листовой пластинки: мелких полигональных изодиаметричных и крупных вытянутых. В полосах с изодиаметричными клетками, располагаются многочисленные устьица аномоцитного типа, окруженые 3-5 околоустьичными клетками. Устьица крупные, эллиптические, размер составляет около 30 мкм. Кутикула толстая, возле устьиц образует складки. На верхнем эпидермисе, у оснований сегментов листовой пластинки встречаются редкие, простые, одноклеточные волоски. В мезофиле листа встречаются группы идиобластов со скоплениями мелких игольчатых кристаллов оксалата кальция, часто образующих сростки. Поскольку основную массу сырья составляют стебли и плоды, было проведено микроскопическое исследование этих частей растения. При микроскопическом анализе плодов рассматривали микропрепараты кожицы и мякоти околоплодника. Клетки эпидермиса полигональной формы с характерными простыми поровыми каналами, покрытые толстым слоем кутикулы. Стенки клеток эпидермиса плода очень толстые. Устьица аномоцитного типа. Устьичная щель сверху прикрыта кутикулой, образующей радиальные складки вокруг устьица. Мякоть околоплодника состоит из паренхимных клеток, между которыми расположены группы каменистых клеток из брахисклереид. На поперечном срезе стебля наблюдается вторичное беспучковое строение, характерное для двудольных растений. Под эпидермисом 1-2 слоя пластинчатой колленхимы. Ассимилирующая паренхима без межклетников. Эндодерма состоит из крупных эллиптических клеток со слегка извилистыми стенками, вытянутых вдоль границы центрального осевого цилиндра. Перицикл представлен сплошным склеренхимным кольцом. Флоэма, камбий и ксилема расположены сплошными слоями, образовавшимися в результате слияния первичных открытых коллатеральных пучков (рис. 2). Рис. 2. Фрагменты микроскопии сырья Гармалы обыкновенной трава. а - лист Гармалы обыкновенной; б - клетка мезофилла с мелкими игольчатыми кристаллами; в - одноклеточный простой волосок; г - клетки эпидермиса с характерными поровыми каналами; д - каменистые клетки; е - поперечный срез стебля. Определение содержания флавоноидов проводили методом дифференциальной спектрофотометрии, который основан на образовании комплекса с алюминия хлоридом [17]. Сырье измельчали и просеивали через сито с отверстиями 2 мм. В колбу помещали 1,0 г сырья, прибавляли 50 мл спирта 70%, и нагревали на водяной бане с обратным холодильником 30 мин., затем охлаждали и фильтровали в колбу вместимостью 100 мл, а затем доводили до метки спиртом 70% (раствор А). Далее в колбу вместимостью 25 мл, помещали 2 мл полученного раствора А и 2 мл алюминия хлорида и доводили до метки 70% спиртом. Выдерживали в темноте 40 мин., а затем с помощью спектрофотометра снимали спектры при длине волны 390-450 нм. Анализ спектра показал, что полученные результаты близки к значению спектров комплекса гиперозид - алюминия гидрохлорид. В литературных источниках определение флавоноидов в сырье «Гармалы обыкновенной трава» также приводится в пересчете на гиперозид [12]. Для расчетов была использована формула, взятая из ФС.2.5.0061 [21]. , , где A - оптическая плотность раствора А испытуемого раствора; - удельный показатель поглощения комплекса гиперозида с алюминия хлоридом при длине волны 410 нм, равный 380; a - навеска сырья, г; W - влажность сырья, %. В результате проведенного исследования, количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид в сырье Гармалы обыкновенной составило 0,25%. По нормативной документации содержание алкалоидов в сырье «Гармалы обыкновенной трава» проводится гравиметрическим методом с использованием летучих органических растворителей, кислот и щелочей, которые являлись не безопасными для применения, а процесс выделения достаточно длительный и трудоемкий, и в настоящее время не соответствует требованиям GMP [1]. В ряде источников приводятся 2 более современных и менее трудоемких метода: спектрофотометрии и алкалиметричекого титрования [8]. Было проведено определение алкалоидов двумя этими методами. При определении суммы алкалоидов спектрофотометрическим методотом навеска сырья помещалась в колбу, заливалась 2% раствором хлороводородной кислоты (в соотношении 1:30). Колбу ставили на водяную баню в течение 30 мин. Затем извлечение охлаждалось и фильтровалось. Сырье, которое осталось в колбе, заливали экстрагентом (1:30) и повторяли экстракцию снова. Затем извлечения объединялись и являлись объектом исследования. Далее с помощью метода прямой спектрофотометрии, были сняты УФ-спектры, при длине волны в диапазоне 200-500 нм, т.к в этом диапазоне находятся экстремумы спектров карболиновых и хинализиновых алкалоидов. При анализе спектров были получены результаты 314,5 нм (характерная длина волны для гармина) и 263 нм (характерная для пеганина). Расчеты проводились с использованием закона аддитивности Бугера-Ламберта-Бэра. Была использована система двух линейных уравнений: , где E1 и E2- коэффициент поглощения пеганина и гармина при 263 и 315 нм, C1 и C2 - содержание (%) пеганина и гармина в исследуемом растворе. Далее учитывая коэффициент поглощения при длинах волн 263 и 315 нм, линейное уравнение приобрело вид: Затем по методу Крамера были найдены корни уравнений и получены результаты. Содержание пеганина составило 1,6%, а содержание гармина - 0,15% [8]. Данный метод оказался неудобным, так как снятие спектров оказалось затруднительным процессом, вследствие достаточно темного цвета извлечения и массы случайных пиков сопутствующих веществ, которые влияют на показания спектрофотометра, вызывая неточность. При определении суммы алкалоидов методом алкалиметрического титрования, мы использовали методику, приведенную в ФС.2.5.0096.18 [20]. Для получения извлечения были использованы: 10,0 г сырья, 100 мл хлороформа и 5 мл аммиака 25%, оставлено на 15 ч., а затем профильтровано через вату (раствор А). Далее в 50 мл раствора А осуществляли отгонку органической фазы, прибавляли 2 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия, 8 мл воды и 10 мл 0,1 М хлористоводородной кислоты, оставляли на 10 мин. и фильтровали (раствор Б). Затем к 10,0 мл раствора Б, прибавляли 10 мл воды, 2 капли метилового красного и титровали 0,1 М раствором натрия гидроксида до желтого окрашивания. Параллельно проводили контрольный опыт. Расчет результатов проводился по формуле: , где: 0,018 - количество алкалоидов в пересчете на пеганин (рассчитанное с учетом молекулярной массы), соответствующее 1 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты, г; Vo - объем 0,1 М раствором натрия гидроксида, пошедшего на титрование контрольного опыта, г; V - объем 0,1 М раствором натрия гидроксида, пошедшего на титрование испытуемого раствора, мл; a - навеска сырья, г; W - влажность сырья, %. Расчет результатов по формуле показал, что содержание алкалоидов в пересчете на пеганин составило 2,4%. Метод алкалиметрического титрования оказался наиболее удобным, простым при расчете результатов и более точным, чем метод спектрофотометрии. Количественное содержание дубильных веществ проводилось в соответствии с методикой, указанной в ОФС.1.5.3.0008 (Метод 1). Применялось пермангонатометрическое титрование до золотисто-желтого окрашивания, индикатор - индигосульфокислота, параллельно проводился контрольный опыт. Для расчетов использовалась формула: , где V - объём калия перманганата раствора 0,02 М, израсходованного на титрование водного извлечения, мл; V1 - объём калия перманганата раствора 0,02 М, израсходованного на титрование в контрольном опыте, мл; a - навеска испытуемого образца, г; W - влажность испытуемого образца, %; 0,00415 - количество дубильных веществ, соответствующее 1 мл калия перманганата раствора 0,02 М (в пересчёте на танин), г. В результате содержание дубильных веществ в пересчете на катехин составило 2,02%. Сырье Гармалы обыкновенной трава, произрастающее на территории Киргизии, содержит дубильных веществ 2,1%. На территории Астраханской области (окрестности г. Астрахани) 2,06%. По ВФС 42-879-79 сумма алкалоидов в сырье должна быть не ниже 1,5%. В литературных источниках приводятся данные определенные методом алкалиметрического титрования для сырья, заготовленного в Киргизии - 3,8%, в Узбекистане - от 1,5% до 3,5%, в Астраханской области (окрестности г. Астрахани) - 3,98% [5, 11, 12]. Исследуемое сырье содержит 2,4% алкалоидов, определенных алкалиметрическим титрованием. При использовании метода спектрофотометрии в сырье заготовленном в Киргизии определено содержание алкалоидов в пересчете на гармин 0,05%, в пересчете на пеганин 1,62% [8]. Исследуемое сырье содержит алкалоидов в пересчете на гармин 0,15% и в пересчете на пеганин 1,6%. Таким образом содержание алкалоидов в исследуемом сырье сопоставимо с таковым в сырье, собранном в других популяциях и соответствует требованиям нормативной документации. Выводы 1. Сырье «Гармалы обыкновенной трава» заготовленное в популяциях, произрастающих в Астраханской области не уступает по своим показателям зарубежному по содержанию флавоноидов (в пересчете на гиперозид 0,25%), дубильных веществ (2,02%), алкалоидов (в пересчете на пеганин 2,4% методом алкалиметрического титрования), методом спектрофотометрического титрования пеганина - 1,6%, гармина - 0,15% и может рассматриваться как альтернатива импорту. 2. При определении подлинности сырья, помимо микроскопии листьев, которая ранее приводилась в нормативной документации целесообразно также проводить микроскопический анализ плодов и стеблей, поскольку они имеют характерные признаки, которые позволяют точнее идентифицировать сырье, особенно если оно измельченное.

Об авторах

Анастасия Руслановна Макарова

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
студентка ФГБОУ ВО «Волгоградского государственного медицинского университета» Минздрава России Россия, 400131, Волгоград, площадь Павших борцов, 1

Марина Юрьевна Власенко

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
студентка ФГБОУ ВО «Волгоградского государственного медицинского университета» Минздрава России Россия, 400131, Волгоград, площадь Павших борцов, 1

Инна Владимировна Землянская

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
кандидат биологических наук, доцент кафедры фармакогнозии и ботаники ФГБОУ ВО «Волгоградского государственного медицинского университета» Минздрава России Россия, 400131, Волгоград, площадь Павших борцов, 1

Алла Владимировна Яницкая

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
кандидат биологических наук, заведующая кафедрой фармакогнозии и ботаники ФГБОУ ВО «Волгоградского государственного медицинского университета» Минздрава России Россия, 400131, Волгоград, площадь Павших борцов, 1

Список литературы

Дополнительные файлы