ВЛИЯНИЕ ДАЛАРГИНА НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЯЗВЕННОМ КОЛИТЕ У МЫШЕЙ

Полный текст

Введение Язвенный колит представляет собой хроническое, мультифакториальное заболевание, характеризующееся взаимодействием различных этиологических факторов и патогенетических механизмов, в том числе генетических, эпигенетических, средовых и микробных [10]. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в диагностике ЯК и других воспалительных заболеваний кишечника, их лечение до настоящего времени остается во многом эмпирическим [14]. Известно, что патогенез язвенного колита связан с нарушением барьера слизистой оболочки толстого кишечника, пенетрацией патогенной и комменсальной микрофлоры из просвета кишечника в толщу его стенки, последовательной активацией нейтрофилов, макрофагов, лимфоцитов, развитием гиперергического воспаления [13]. Ранее показано, что активация мононуклеарных клеток сопровождается развитием дисбаланса про- и противовоспалительных цитокинов, нарушением продукции ростовых факторов и матриксных металлопротеиназ [8, 15, 20]. Важную роль в развитии язвенного колита играют нарушения состава микробиома, что подтверждается терапевтическим эффектом трансплантации фекальной микробиоты [2]. Общепризнано, что восстановление гомеостаза в стенке толстого кишечника невозможно без элиминации патогенных микробов. В то же время динамика фагоцитарной активности нейтрофилов при язвенном колите остается недостаточно исследованной. Ранее показано, что даларгин обладает корригирующим действием при экспериментальном язвенном колите, что проявляется снижением индекса активности болезни, распространенности язв и инфильтратов в стенке толстого кишечника [7], а также модулирующим эффектом на содержание провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в ткани ободочной кишки [8]. Хорошо известен антиоксидантный эффект даларгина [1], при этом общепризнано, что активация свободно-радикального окисления является одним из ведущих факторов формирования различных форм патологии толстого кишечника [19], включая состояние микробиоты толстого кишечника [3]. Целью работы явилось изучение эффектов даларгина на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови у мышей с экспериментальным язвенным колитом. Методика Исследование выполнено на 104 мышах-самцах линии Balb/C весом 21-23 г. из филиала «Столбовая» Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства». Для выполнения исследования были сформированы следующие группы: 1) интактная (8 животных без экспериментального язвенного колита и инъекций); 2) контрольная №1 (24 мыши с экспериментальным язвенным колитом и подкожным введением физраствора); 3) контрольная №2 (24 мыши с экспериментальным язвенным колитом и внутрижелудочным введением физраствора); 4) опытная №1 (24 мыши с экспериментальным язвенным колитом и введением даларгина); 5) опытная №2 (24 мыши с экспериментальным язвенным колитом и введением сульфасалазина). Язвенный колит моделировали заменой питьевой воды 5% раствором декстрана сульфата натрия (Mr=40000, «PanReac-AppliСhem», ФРГ) в кипяченой воде на 5 суток [11]. Животных выводили из эксперимента на 5, 7 сутки (острый колит) и на 28 сутки (хронический колит) цервикальной дислокацией под хлоралгидратным наркозом. Даларгин (Тир-D-Ала-Гли-Фен-Лей-Арг) (НПО «Микроген», РФ) растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия, применяли подкожно в объеме 0,1 мл в дозе 100 мкг/кг массы тела 1 раз в сутки в течение 7 дней с начала моделирования язвенного колита. По данным литературы даларгин проявляет высокую фармакологическую активность при его использовании в указанной дозе [6]. Сульфасалазин («КРКА», Словения) применяли в качестве препарата сравнения и вводили мышам внутрижелудочно в виде суспензии в физиологическом растворе в дозе 200 мг/кг массы тела в объеме 0,3 мл в течение 7 суток с начала моделирования язвенного колита [9]. При терапии экспериментального язвенного колита у крыс внутрижелудочным введением сульфасалазина в дозе 200 мг/кг установлено уменьшение индекса активности болезни, площади язв и кровоизлияний в прямой кишке, содержания индуцированной NO-синтазы, ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНОα в гомогенате прямой кишки [9]. Контрольная группа животных с экспериментальным язвенным колитом состояла из 48 особей, 24 из которых физраствор вводили подкожно, 24 - внутрижелудочно. Физраствор вводили 1 раз в сутки в течение 7 дней с начала моделирования язвенного колита в объеме 0,1 мл подкожно или 0,3 мл внутрижелудочно. Для определения фагоцитарной активности нейтрофилов в пробирку с 0,5 мл гепаринизированной крови экспериментального животного добавляли бактериальную взвесь Staphylococcus aureus (109 микробных тел/мл) из расчета 10 микробов на 1 нейтрофил. Кровь, смешанную с бактериями, инкубировали 30 минут в термостате при температуре 370С. Приготовленные мазки фиксировали этанолом и окрашивали по Романовскому-Гимза. Фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови оценивали по следующим показателям: фагоцитарный индекс (ФИ) - количество активно фагоцитирующих нейтрофилов из 100 клеток; фагоцитарное число (ФЧ) - среднее число микробных тел, захваченных 1 фагоцитирующим нейтрофилом, опсоно-фагоцитарный индекс (ОФИ) - среднее количество поглощенных микробных тел в расчете на 100 нейтрофилов. Исследование выполнено в лаборатории доклинических исследований лекарственных средств НИИ экспериментальной медицины Курского государственного медицинского университета с соблюдением принципов гуманного отношения к лабораторным животным [4, 5], положений Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном отношении к лабораторным животным (2000 г.), директивы Европейского Парламента и Совета от 22 сентября 2010 года (86/609 ЕС) и Правил надлежащей лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ №199н от 01.04.2016 г.). Проведение экспериментов по теме диссертационного исследования было одобрено Региональным этическим комитетом (протокол заседания секции доклинических исследований РЭК №1 от 03.04.2023). При статистической обработке полученных результатов нормальность распределения оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка, а гомогенность дисперсий по критерию Левена. Проверку статистических гипотез проводили с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Применение непараметрической статистики было связано с небольшим размером выборок, разным характером распределения в вариационных рядах и неравенством дисперсий при сравнении групп. Материал представлен как медиана (Me) нижний (Ql) и верхний (Q3) квартили. В ходе проведения статистического анализа нулевая гипотеза отвергалась при p≤0,05. Статистическая обработка проводилась с помощью программного обеспечения Statistica версия 10. Результаты исследования При сравнении двух контрольных групп не установлено статистически значимых различий по показателям фагоцитарной активности нейтрофилов (p>0,05). У мышей Balb/C с экспериментальным язвенным колитом установлено повышение фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови на 5 и 7 сутки эксперимента (табл.). Так, на 5 сутки показано увеличение ФИ на 29,7-52,2% (P=0,0019), ФЧ - на 65,5% (P=0,0009), ОФИ - в 2,2-2,3 (P=0,0009) раза у животных контрольных групп по сравнению с интактными. Спустя 7 суток у мышей с острым колитом отмечается повышение ФИ на 57,1% (P=0,0009), ФЧ - на 69,0-75,9% (P=0,0009), ОФИ - в 2,7-2,8 (P=0,0009) раза. У животных с хроническим язвенным колитом на 28 сутки эксперимента не установлено различий по показателям, характеризующим фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови (p>0,05). Применение даларгина мышам с экспериментальным язвенным колитом оказывало корригирующее влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов, что проявлялось снижением ФИ на 32,4%, ФЧ - на 16,7%, ОФИ - на 39,8% на 5 сутки и на 22,4%, 17,6%, 36,6% соответственно на 7 сутки (P=0,0009-0,0063). На 28 сутки даларгин не оказывал статистически значимого влияния на фагоцитарную активность нейтрофилов по сравнению, как с контрольной группой, так и с интактными мышами (p>0,05). Внутрижелудочное введение сульфасалазина в дозе 200 мг/кг массы тела вызывало снижение ФЧ на 14,6% (P=0,0046), ОФИ - на 28,4% (P=0,0046), но не влияло на ФИ (p>0,05) на 5 сутки наблюдения. На 7 сутки эксперимента установлено уменьшение всех 3 изучаемых показателей у мышей с язвенным колитом, которым применяли сульфасалазин: ФИ - на 16,7% (P=0,0016), ФЧ - на 10,2% (P=0,0028), ОФИ - на 25,3% (P=0,0009). Как и в группе язвенный колит+даларгин, не выявлено изменений изучаемых показателей на 28 сутки у мышей группы язвенный колит+сульфасалазин (p>0,05). При сравнении эффектов даларгина и сульфасалазина на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей с экспериментальным язвенным колитом не установлено статистически значимых различий по показателям ФЧ, ФИ и ОФИ (p>0,05). Таблица Влияние даларгина на фагоцитарный индекс, фагоцитарное число и опсоно-фагоцитарный индекс нейтрофилов периферической крови мышей с язвенным колитом Показатели Группа Срок эксперимента Значение фагоцитарного индекса, n Значение фагоцитарного числа, n Значение опсоно-фагоцитарного индекса, n Интактная 45,5 [42, 5; 49, 0] 1,45 [1, 35; 1, 50] 64,7 [60, 8; 67, 9] Контрольная группа №1 (язвенный колит+физраствор подкожно) 5 сутки 69,5 [56, 5; 65, 5]х, P=0,0019 2,40 [2, 30; 2, 50] х, P=0,0009 145,7 [136, 0; 159, 9] х, P=0,0009 7 сутки 71,5 [68, 0; 75, 5] х, P=0,0009 2,55 [2, 45; 2, 65] х, P=0,0009 178,8 [177, 4; 187, 7] х, P=0,0009 28 сутки 47,5 [41, 5; 50, 5], P=0,8336 1,40 [1, 35; 1, 55], P=1,0000 64,9 [60, 5; 73, 1], P=0,8748 Контрольная группа №2 (язвенный колит+физраствор внутрижелудочно) 5 сутки 59,0 [51, 5; 68, 0] х, P=0,0074 2,40 [2, 25; 2, 60] х, P=0,0009 141,4 [123, 6; 166, 8] х, P=0,0009 7 сутки 71,5 [68, 0; 76, 5] х, P=0,0009 2,45 [2, 40; 2, 55] х, P=0,0009 177,7 [162, 0; 192, 4] х, P=0,0009 28 сутки 42,0 [39, 5; 50, 0], P=0,5286 1,40 [1, 25; 1, 50], P=0,6744 60,1 [54, 3; 68, 6], P=0,4309 Группа язвенный колит+даларгин в дозе 100 мкг/кг 5 сутки 47,0 [43, 5; 52, 5]*, P=0,0063 2,00 [1, 80; 2, 05]*, P=0,0023 87,7 [81, 9; 107, 6]*, P=0,0039 7 сутки 55,5 [51, 0; 61, 5]*, P=0,0009 2,10 [1, 95; 2, 25]*, P=0,0014 113,4 [99, 4; 138, 4]*, P=0,0009 28 сутки 47,0 [41, 5; 51, 0], P=0,9581 1,35 [1, 30; 1, 45] , P=0,3446 65,8 [54, 0; 71, 9] , P=0,6365 Группа язвенный колит+ сульфасалазин в дозе 200 мг/кг 5 сутки 50,5 [45, 5; 54, 0], P=0,0520 2,05 [1, 85; 2, 20]*, P=0,0046 101,2 [93, 4; 116, 1]*, P=0,0046 7 сутки 59,5 [55, 0; 63, 5]*, P=0,0016 2,20 [2, 05; 2, 25]*, P=0,0028 132,8 [114, 0; 143, 0]*, P=0,0009 28 сутки 47,0 [41, 5; 52, 0], P=0,4008 1,35 [1, 25; 1, 40], P=0,4948 62,5 [54, 3; 71, 7], P=0,7929 Примечание: х - p<0,05 по сравнению с интактной группой; * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой Обсуждение результатов исследования Полученные нами результаты подтверждают данные литературы об активном участии нейтрофилов в развитии язвенного колита [17]. Повышение функциональной активности нейтрофилов в стенке ободочной кишки при пенетрации комменсальной и патогенной микрофлоры из просвета толстого кишечника, является одним из ведущих механизмов патогенеза этого заболевания [20]. Как показано мультицентровыми исследованиями, определение индекса PICaSSO Histological Remission Index [PHRI], основанным только на определении нейтрофилов, является простым и надежным показателем ремиссии язвенного колита и коррелирует с выраженностью эндоскопическим изменений в стенке ободочной кишки [18]. Применение даларгина оказывает корригирующее влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов, что проявляется увеличением ФЧ, ФИ и ОФИ на 5 и 7 сутки эксперимента по сравнению с контрольной группой. Установлено, что опиоидные μ-рецепторы присутствуют на нейтрофилах, макрофагах, Т- и В-лимфоцитах, дендритных, эпителиальных клетках и нейронах в толстом кишечнике [12], и их экспрессия повышается при развитии язвенного колита [16]. Известно, что даларгин является аналогом лей-энкефалина и проявляет высокую аффинность в отношении опиоидных μ- и δ-рецепторов [1]. Учитывая данные об увеличении плотности опиоидных μ-рецепторов на фагоцитирующих клетках при язвенном колите, можно предположить, что корригирующий эффект даларгина на функциональную активность нейтрофилов реализуется через опиоидные μ-рецепторы на поверхности нейтрофилов. Также терапевтическое действие препарата связано, по-видимому, с уменьшением продукции провоспалительных цитокинов и увеличением секреции противовоспалительных интерлейкинов [8]. Полученные в работе данные об ингибировании фагоцитарной активности нейтрофилов у мышей с язвенным колитом подтверждают ранее полученные результаты об эффективности даларгина при терапии этого заболевания [7, 8]. Выводы 1. Развитие экспериментального язвенного колита у мышей сопровождается повышением фагоцитирующей активности нейтрофилов в острый период заболевания, что проявляется повышением ФЧ, ФИ и ОФИ. 2. Применение даларгина снижает фагоцитарную активность нейтрофилов, что является одним из механизмов противовоспалительного действия препарата у мышей с язвенным колитом.

Об авторах

Андрей Юрьевич Ляшев

Курский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
младший научный сотрудник лаборатории доклинических исследований лекарственных средств НИИ экспериментальной медицины Курского государственного медицинского университета Россия, 305041, Курск, ул. Карла Маркса, 3

Галина Сергеевна Маль

Курский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии Курского государственного медицинского университета Россия, 305041, Курск, ул. Карла Маркса, 3

Список литературы

Дополнительные файлы