ВОЗРАСТ-АССОЦИИРОВАННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА ГЛЮКОЗЫ И АДЕНОЗИНА

Полный текст

Введение Патофизиологические механизмы старения разнообразны [4]. Старение является биологическим процессом, который сопровождается морфофункциональными изменениями висцеральных и соматических органов, ухудшением условий их кровоснабжения, доставки кислорода и питательных веществ [1]. Возрастные изменения кровообращения сопровождаются нарушениями окислительно-восстановительных процессов, развитием тканевой гипоксии [2, 12], увеличением активных форм кислорода, активацией процессов перекисного окисления белков и липидов, изменениями липидного и углеводного состава крови [1-3, 7, 12, 14]. Согласно литературным данным, характерным для стареющего организма является снижение интенсивности гемопоэза [9, 10], угасание иммунитета. Также отмечается снижение количества эритроцитов и содержание гемоглобина, изменение периода их жизни и стойкости при старении. Некоторые функции лимфоцитов, такие как рост клонов, синтез антител, зависят от внутри- и внеклеточного и оксидант/антиоксидантного балланса. Высокой информативностью для исследования метаболизма лимфоцитов и эритроцитов обладают окислительно-восстановительные ферменты, в т.ч. обмена глюкозы, используемой в качестве первичного источника топлива [15]. В отличие от лимфоцитов, зрелые эритроциты энуклеированы и, следовательно, неспособны экспрессировать новый белок. Таким образом, уровни энзимов постепенно снижаются в течение продолжительности их жизни [13]. Важнейшая роль в поддержании функций эритроцитов принадлежит двум путям окисления глюкозы - пентозофосфатном пути (ПФП) и гликолитическом. Для лимфоцитов эти пути метаболизма глюкозы также важны. Для Т-лимфоцитов характерен эффект Варбурга, а дефицит ЛДГ вызывает дефектную их активацию. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (ГДГ) катализирует первую реакцию пентозофосфатного пути, участвует в образовании восстановленного НАДФН и защищает клетки от окислительного стресса [12]. Эритроциты нуждаются в ГДГ, как единственном источнике НАДФН для защиты от окислительного повреждения и гемолиза. ГДГ также необходима для других клеток крови, и в случае дефицита эти клетки также повреждаются. Активность ГДГ взаимосвязана с тяжестью заражения коронавирусной болезнью 2019 года [13]. Фосфопентозы, как продукты ПФП могут участвовать в запасном пути синтеза нуклеотидов. Активность терминального фермента гликолиза характеризует интенсивность энергетического обмена, уровень кофермента НАДН, образования сигнальной молекулы лактата и регуляторной молекулы - 2,3-дифосфоглицерата [12, 14]. Активность дезаминазы сигнального аденозина косвенно отражает обмен аденилатов. В эритроцитах нуклеозид управляет уровнем 2,3-дифосфоглицерата и взаимосвязан с циркуляцией патологических форм клеток. В лимфоцитах аденозин угнетает их функции. Таким образом, нарушения метаболизма глюкозы и аденозина в эритроцитах, лимфоцитах могут приводить к ухудшению функций клеток, способствуя развитию патологии при старении [12, 15]. Активность сывороточной ЛДГ - биомаркер слабости, показатель старения [9], клеточного лизиса [6]. Цель исследования - изучить влияние возрастного фактора на активность дегидрогеназ обмена глюкозы и дезаминазы аденозина в эритроцитах, лимфоцитах и плазме крови здоровых доноров. Методика Исследовали эритроциты, лимфоциты и плазму крови 52 условно здоровых лиц (16 женщин и 36 мужчин) в возрасте от 20 до 79 лет. Предварительно донорами было подписано информированное согласие на использование крови для дальнейших исследований. Как правило, это были лица, проходившие плановое грыжесечение и пластику на базе отделений хирургического профиля ДОКТМО им. М.И. Калинина г. Донецка. Эксперименты проводились в соответствии с этическими стандартами комитета Хельсинской декларации 1975 г. и ее пересмотренного варианта 2000 г. Для исследования влияния возраста, на показатели ферментативной активности обследуемые группы контроля были разделены на 3 возрастные группы согласно критерию ВОЗ (2017 г.): 1-я - 20-44 лет, 2-я - 45-59 лет и 3-я - 60-74 лет. В 3-й группе присутствовала возрастная патология: гипертоническая болезнь, варикозная болезнь. Метаболизм глюкозы оценивали по активности ключевых ферментов: пентозофосфатного пути - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (ГДГ, КФ: 1.1.1.49) и гликолиза - лактатдегидрогеназы (ЛДГ, КФ: 1.1.1.27). Метаболизм аденозина оценивали по активности аденозиндезаминазы (АД, К.Ф: 3.5.4.4). Определение активности ферментов осуществляли спектрофотометрическим методом по описанным ранее методикам [5, 8]. Для математического анализа полученных результатов использовали лицензионную программу MedStat v. 5.2. Для сравнения независимых выборок, в случае нормального закона распределения использовался Т-критерий Стьюдента. Для выявления статистически линейной связи между признаками использовались методы корреляционного анализа, рассчитывался показатель ранговой корреляции Пирсона (r). Для выявления значимости выявленной связи проводилось сравнение расчетного значения с соответствующим критическим значением на уровне значимости p = 0,05. Результаты исследования и их обсуждение Активность дегидрогеназ прямого окисления глюкозы и терминального в эритроцитах имела возрастные особенности. Результаты корреляционного анализа показали существование умеренной связи между активностью фермента гликолиза ЛДГ в эритроцитах от возраста: r=0,634 (p=0,0006). Для активности ГДГ такая зависимость отсутствует: r=0,27 (p=0,18). Активность ГДГ имела максимальные значения во 2-й возрастной группе, по сравнению с 1-й и 3-й группами, которые не отличались между собой (рис. 1). ЛДГ эритроцитов имела однонаправленный характер изменений активности с возрастом, как и ГДГ (рис. 2). Учитывая, что эритроциты остро нуждаются в ГДГ, как единственном источнике НАДФН для защиты от окислительного повреждения [3, 13] и гемолиза [12], имеющего нарастающий характер с возрастом. Предполагаем, что изменения активности ГДГ эритроцитов в исследуемых группах показывают компенсаторное повышение активности фермента во 2-й группе в ответ на возрастание потребности клеток в продуктах ПФП. В старшей возрастной группе снижение активности ГДГ имеет дезадаптивный характер, т.к. потребность в защите от окислительного стресса не снижается. Ранее в экспериментальных работах было показано, что сверх экспрессия ГДГ приводит к более высоким уровням глутатиона и увеличению продолжительности жизни у мух и мышей [17]. ЛДГ эритроцитов имела однонаправленный характер изменений активности с возрастом, как и ГДГ (рис. 2). Активность ЛДГ эритроцитов во 2-й группе была достоверно выше значений в 1-й и в 3-й группе (р<0,05). Рис. 1. Изменение активности ГДГ в плазме, эритроцитах и лимфоцитах в разных возрастных группах, нмоль/мин·мг Согласно данным литературы, по активности ЛДГ и уровню гликолитического метаболита 2,3- ДФГ можно судить о степени гипоксических процессов [12, 14]. В тоже время, снижение активности ЛДГ в эритроцитах ассоциируют с их старением [11]. Следовательно, активация анаэробной реакции у лиц 2-й группы по сравнению с 1-й характеризует адаптивную реакцию клетки на возросшие потребности клеток в энергоресурсе, также дифосфоглицерате, который снижает сродство гемоглобина к кислороду. Собственные результаты также согласуются с утверждением, что старение сопровождается уменьшением доставки кислорода ко всем органам и тканям и снижением парциального давления кислорода в них, что приводит к развитию гипоксии [10]. Снижение активности ЛДГ в эритроцитах у пожилых людей может свидетельствовать о снижении интенсивности энергозависимых процессов мембранного транспорта, нарушении адаптационных механизмов к гемической гипоксии при старении. Рис. 2. Изменение активности ЛДГ в плазме, эритроцитах и лимфоцитах в разных возрастных группах, нмоль/мин·мг В 3-й группе активность АД была ниже в 1,4 раза (р<0,05) по сравнению со 2-й группой и в 1,7 раза ниже (р<0,05) 1-й группы. Активность АД обратно коррелировала с возрастом (r=0,932, р=0,009). Признано, что аденозин отражает энергетический потенциал эритроцитов, а также управляет уровнем 2,3-дифосфоглицерата и взаимосвязан с циркуляцией патологических форм клеток [14]. Снижение активности АД оказывает негативное влияние на функции эритроцитов. Данное утверждение доказывают результаты эксперимента, где АД применяли для лечения серповидно-клеточной анемии, для снижения уровней аденозина. При этом снижалась доля патологических клеток и гемолиз. Рис. 3. Изменение активности АД в плазме, эритроцитах и лимфоцитах в разных возрастных группах, нмоль/мин·мг Таким образом, при биологическом старении организма происходит угнетение катаболизма аденозина в клетках крови, что влияет на баланс адениловых нуклеотидов в эритроцитах. Повышение уровня аденозина в красных клетках крови согласуется с изменением активности ферментов обмена глюкозы - ГДГ и ЛДГ при биологическом старении. Некоторые функции лимфоцитов, такие как рост клонов, синтез антител, зависят от внутри- и внеклеточного и оксидант/антиоксидантного балланса. При исследовании активности ГДГ лимфоцитов достоверных изменений с возрастом не выявлено (рис. 1), что подтвердилось результатами корреляционного анализа r=-0,39 (р=0,16). Отсутствие изменений можно объяснить тем, что в поддержании пула НАДФН также принимают участие митохондриальные ферменты, в отличие от эритроцитов. Возрастная динамика активности ЛДГ показала увеличение активности анаэробной реакции в лимфоцитах при старении (рис. 2). В лимфоцитах периферической крови во 2-й и 3-й группе повышена активность ЛДГ в среднем в 1,5 и 1,8 раза по сравнению с 1-й группой (p<0,05). Однако влияние возрастного фактора на активность ЛДГ лимфоцитов не подтвердилось r=0,19 (p=0,45). Тем не менее, не стоит исключать, что увеличение соотношения НАД+ /НАДН может коррелировать с возрастанием нагрузки на клетки системы иммунитета. При этом анаболические реакции в лимфоцитах нуждаются в быстром источнике АТФ, который достигается, по мнению многих авторов, активацией анаэробного гликолиза [11]. В частности, для Т-лимфоцитов характерен эффект Варбурга, а дефицит ЛДГ вызывает дефектную их активацию. Возрастная динамика активности фермента обмена аденозина отражает его снижение после 60 лет (рис. 3). В 1-й и 2-й группе активность АД лимфоцитов не отличалась (р>0,05). В 3-й группе активность АД лимфоцитов была на 49% ниже, чем в 1-й группе. Корреляционная зависимость между активностью АД и возрастом не установлена (r=-0,08, р=0,83). Однако принимая во внимание, что в лимфоцитах аденозин угнетает их функции [8], то можно предположить, что снижение активности АД в пожилом возрасте показывает угасание реакций клеточного звена иммунитета. Таким образом, нарушения метаболизма глюкозы и аденозина в эритроцитах, лимфоцитах могут приводить к ухудшению функций клеток, способствуя развитию патологии при старении [12, 16]. Изменения активности ферментов в плазме крови зависят от возраста. Так, активность ГДГ с возрастом росла и была максимально высокой в 3-й группе (рис. 1). Для активности ЛДГ также характерен пик активности в пожилом возрасте (рис. 2). Активность ГДГ в 1-й и 2-й группах достоверно не отличалась, а в 3-й была на 35% выше по сравнению со 2-й группой. Активность АД в плазме крови имела свои особенности. Активность фермента была максимально высокой во 2-й группе, а в 3-й была на 33% ниже, чем во 2-й (рис. 3). В 1-й группе активность фермента не отличалась от значений активности в 3-й группе (р>0,05) и ниже значения активности во 2-й на 26% (р<0,05). Для исследуемых ферментов плазмы крови была подтверждена возрастная зависимость: для ЛДГ (r=0,404, p= 0,002), для ГДГ (r=-0,47, p= 0,001) и для АД (r=0,303, p=0,004). Повышение сывороточной активности ферментов принято ассоциировать с клеточным лизисом, в частности ЛДГ - биомаркер слабости, показатель старения [9], клеточного лизиса [6]. Нарастание активности ферментов обмена глюкозы в плазме крови пожилых людей, учитывая преимущественно эритроцитарное происхождение энзимов, вероятно связано с гемолизом. Заключение Изменение активности изучаемых ферментов в эритроцитах, лимфоцитах и плазме крови имеет возрастной характер. Установлено, что наиболее выраженные ферментативные сдвиги в углеводном и нуклеотидном обменах в клетках крови проявляются после 60 лет - в возрастной группе 60-74 года. Соответственно клетки испытывают дефицит энергии, угнетение глутатионового звена антирадикальной защиты, реакции пластического обмена, репарации и накопление аденозина. В плазме крови повышалась активность всех изученных ферментов - гликолиза, ПФП и катаболизма аденозина с возрастом. Активность ферментов углеводного и нуклеотидного обменов в плазме крови была максимально высокой у лиц зрелого возраста (45-59 лет). При проведении корреляционного анализа исследуемых ферментов в эритроцитах и лимфоцитах в зависимости от возраста было установлено, что безъядерные клетки наиболее чувствительны к возрастным изменениям. Анализируя особенности активности изучаемых ферментов в клетках крови в зависимости от возраста, установлена интенсификация гликолиза, однонаправленное снижение активности ГДГ и АД, ферментов чувствительных к гипоксии и возросшим уровням АФК, обусловливающих функциональную способность клеток крови при старении. Повышение активности внутриклеточных ферментов углеводного обмена в плазме крови с возрастом объясняется, как правило, нарушением целостности клеточных мембран, вероятно, обусловленных накоплением АФК. Данные показатели можно использовать как ферментативные тесты дезадаптационных процессов важнейших клеток крови при старении и мониторинга терапевтических антивозрастных мероприятий.

Об авторах

Ксения Александровна Миронова

Сургутский государственный университет

Email: email@example.com
кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры химии Института Естественных и технических наук БУ ВО ХМАО-Югры «Сургутский государственный университет» Россия, 628408, Сургут, Энергетиков 22

Елена Михайловна Бакурова

Донецский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
доктор медицинских наук, доцент кафедры биологической химии ФГБОУ ВО «Донецкий государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 83003, Донецк, пр. Ильича 16

Список литературы

Дополнительные файлы