EVALUATION OF THE BIOSTIMULATING EFFECT OF THE INFUSION OF THE COLLECTION WITH SEDATIVE ACTION IN VITRO USING THE PARAMECIUM CAUDATUM TEST SYSTEM

Full Text

Введение В последнее время большое внимание уделяется вопросам разработки и увеличения производства отечественных лекарственных средств [15]. В реализации данного направления немаловажную роль играет получение новых достаточно эффективных и безопасных лекарственных средств на основе растительного сырья [21], которые остаются весьма востребованными потребителями. Лекарственные растительные препараты и БАД на основе растительного сырья могут быть представлены как монокомпонентными, так и многокомпонентными составами, причем, последние за счет наличия нескольких активных ингредиентов, подобранных в оптимальном соотношении, имеют ряд преимуществ, включая проявления синергизма фармакологических эффектов однонаправленного действия. Опытным путем разработан уникальный многокомпонентный состав сбора, содержащего каштана конского цветки, горца щавелелистного траву, зверобоя траву, синюхи голубой траву в определенном соотношении, пригодный для разработки лекарственных растительных препаратов или БАД седативного действия [2]. Компоненты указанного сбора согласно известным данным (табл. 1) [5, 6, 9, 11, 17, 18] обладают антиоксидантным и противовоспалительным действием, а так же проявляют синергизм в отношении седативного эффекта, венотонизирующей и капилляропротекторной активности. Исходя из известных сведений о химическом составе следует предположить наличие мембранопротекторного и/или биостимулирующего действия за счет наличия флавоноидов и витаминов во всех компонентах состава (Табл. 1), однако при этом наличие сапонинов в составе каштана конского цветков и синюхи голубой травы, дубильных веществ в составе горца щавелелистного травы и зверобоя травы может напротив способствовать изменению проницаемости мембран и проявлениям биоцидного действия. В связи с вышеизложенным, актуальна оценка in vitro биоцидного или биостимулирующего действия настоя отдельных компонентов растительного сырья и настоя сбора седативного действия многокомпонентного состава, содержащего каштана конского цветки, горца щавелелистного траву, зверобоя траву, синюхи голубой траву в определенном соотношении, что может подтвердить безопасность в отношении клеточной in vitro тест-системы и выявить компоненты прямого биостимулирующего действия в модельных условиях. Целью работы являлась первичная оценка биоцидного или биостимулирующего действия настоя отдельных компонентов и настоя сбора седативного действия, содержащего каштана конского цветки, горца щавелелистного траву, зверобоя траву, синюхи голубой траву в определенном соотношении in vitro с использованием тест-системы Paramecium caudatum при помощи автоматизированного аппаратно-программного комплекса «БиоЛат 3.2». Методика Объектами исследования выступали отдельные виды растительного сырья и их комбинация в виде настоя сбора седативного действия, содержащего каштана конского цветки, горца щавелелистного траву, зверобоя траву, синюхи голубой траву в определенном соотношении 1:1:2:2. Сведения о химическом составе и известных фармакологических эффектах объектов исследования приведены в таблице (табл. 1). Настои каштана конского цветков, горца щавелелистного травы, зверобоя травы, синюхи голубой травы и настой их комбинации многокомпонентного состава получали согласно общим принципам, изложенным в ОФС ГФ РФ XV «Настои и отвары» [8]. Сухой остаток 1,66 г/100 мл. Сырье для приготовления настоев было заготовлено самостоятельно и приобретено в аптечной организации, а именно использовали: каштана цветки, растительное сырье, не является лекарственным средством и БАД, производитель ООО «Русские корни», Россия; зверобоя траву, лекарственный растительный препарат, АО «Красногорсклексредства», Россия; синюхи голубой траву, растительное сырье, напитки чайные серии «Дары природы», производитель ООО «Лекра-СЭТ», Россия. Горец щавелелистный был заготовлен самостоятельно во время массового цветения, высушен до остаточной влажности 9,5% [10]. Для проведения экспериментов in vitro полученные настои подвергались четырехкратному разбавлению водой очищенной. Таблица 1. Характеристика объектов исследования Состав каштана конского цветки [11] горца щавелелистного трава [9] зверобоя трава [18] синюхи голубой трава [17] Соотношение компонентов в составе сбора 1 1 2 2 Химический состав Сапонины + + Антоциановые соединения + Флавоноиды + + + + Полисахариды + + + + Витамины + + + + Дубильные вещества + + Холин + Антраценпроизвондые (гиперицин) + Фармакологические эффекты Антиоксидантный + + + + Венотонизирующий + + Противовоспалительный + + + + Седативный + + Антидепрессивный + Капилляропротекторный + + + Первичная оценка биостимулирующего и биоцидного действия изучаемых настоев отдельных видов растительного сырья и сбора седативного действия проведена с соблюдением известных требований [3] в лаборатории доклинических исследований кафедры фармакологии и клинической фармакологии ФГБОУ ВО ВГУ с использованием тест-системы инфузорий Parametium caudatum. Исследования проведены с использованием автоматизированного аппаратно-программного комплекса «БиоЛат 3.2» производства ООО «Европолитест», Россия. В основе работы прибора лежит принцип преобразования видеоизображения лунки с тест-организмами в цифровой сигнал, который передается на компьютер через порт USB. Использование инфузорий Parametium caudatum широко распространено на этапе первичной скрининговой оценки безопасности и биостимулирующего действия различных объектов, в том числе растительного сырья, предлагаемого для разработки продуктов фармацевтического назначения, в связи с универсальностью данной тест-системы, сочетающей свойства отдельной клетки и целого организма, отличающейся простотой культивирования, быстрым воспроизведением культуры, возможностью использования современных методов обработки данных эксперимента и др. [4, 7, 11, 14, 16, 19-21]. Для проведения эксперимента приготовлена среда для культивирования тест-системы инфузорий Parametium caudatum [4] - среда Лозина-Лозинского согласно ГОСТ Р 57166-2016. Инфузории Parametium caudatum культивировались в течении 7 сут. в термостате при температуре 21±1°С при 10 часовом искусственном освещении. Для нормирования начального состояния тест-системы культуру инфузорий промывали раствором Лозина-Лозинского и проводили синхронизацию культуры посредством метода тепловых шоков: культуру нагревали на водяной бане до +35°С и быстро остужали в воде со льдом до +5°С, повторяя данную процедуру 3 раза. После этого культуру инкубировали в течении 2 суток в термостате в чистой среде. Для эксперимента использовали инфузорий, которые равномерно плавают в объеме среды, не оседая на дно пробирки [4]. Исследования проведены согласно утвержденным производителем оборудования «Методическим рекомендациям к автоматизированному методу оценки токсичности продуктов животного происхождения, кормов и объектов окружающей среды на инфузориях Paramecium Caudatum и Tetrahymena Pyriformis». Для проведения эксперимента использовали 3-х дневную культуру в стационарной фазе роста. Количество настоя отдельных видов растительного сырья или настоя сбора седативного действия для внесения в опытную пробу определяли исходя из известных рекомендаций по применению настоев в клинической практике из расчета на среднего взрослого массой тела 70 кг. В результате расчетов установили, что количество настоя на объем лунки опытной пробы составляет 6 мкл разбавленного настоя на 294 мкл среды (0,8 мг/мл из расчета по сухому остатку) с инфузориями. Исследования проводили параллельно в контрольной и опытных пробах. В контрольные пробы вносили 6 мкл воды очищенной на 294 мкл среды с инфузориями. Каждая из контрольной и опытных проб выполнена при 5 повторностях измерений, что позволило получить статистически достоверную выборку. Критерий оценки - количество инфузорий в пробе, шт, определялось при помощи специализированного программного обеспечения AutoCiliata. Подсчет осуществляется в режиме реального времени непрерывно по определенному алгоритму. Измерения количества инфузорий в каждой лунке проводили сразу же после добавления в пробу изучаемых настоев (0 мин., исходно), время экспозиции - 10000 мс, время между последующими повторными измерениями - 10000 мс. Для оценки биостимулирующего действия проводили оценку влияния изучаемых настоев на интенсивность размножения Paramecium caudatum. Для этого осуществляли инкубацию культуры инфузорий с добавлением настоев из исследуемых объектов в течение 24 ч при Т=28°С в термостате при постоянной температуре и искусственном освещении. Инкубацию контрольных проб без добавления изучаемых настоев осуществляли в тех же условиях среды параллельно. Через 24 ч по 300 мкл среды инфузорий опытной и контрольной пробы помещали в лунку прибора БиоЛат и проводили измерения. Математическую обработку данных проводили общепринятыми методами медико-биологической статистики с определением средних значений, ошибки среднего и достоверности различий с использованием методов параметрической статистики. Обсуждение результатов исследования Установлено, что в контрольных пробах количество инфузорий при первоначальном исходном тестировании значительно различалось, составив в среднем по 5 сериям опытов (20 повторностей) 105,28±4,654 шт. - показатель контрольная проба (среднее) (табл. 2). Инкубация в течение 24 ч приводила к повышению количества инфузорий в контрольных пробах во всех сериях опытов в диапазоне от 17,8% и максимально на 97,7% по сравнению с исходными значениями контрольных проб (0 мин, исходно) в каждой из серий опытов, что закономерно связано прежде всего с благоприятными условиями для размножения при термостатировании тест-системы. Зверобоя продырявленного травы настой при исходном тестировании сразу после добавления в опытную пробу (0 мин., исходно) вызывал умеренное снижение количества инфузорий на 14,8% по сравнению с контрольной пробой в данной серии опытов (контрольная проба 1) и на 19,45% по сравнении со средним исходным значением контрольной пробы (табл.2). Указанный результат согласуется с известными данными о высоком содержании дубильных веществ (10-13%) в траве зверобоя, таким образом проявления биоцидного действия вероятно следует связывать с наличием антраценпроизводных и дубильных веществ, обладающих известным вяжущим и антимикробным действием за счет прямого влияния на клеточные стенки бактерий и простейших и других механизмов, включая блокирование ферментов метаболизма, влияние на экспрессию генов факторов вирулентности, подавление биопленкообразования, подвижности и др., противомикробный эффект известен и для гиперфорина, являющегося одним из основных компонентов зверобоя [12, 18]. При этом, 24-часовая инкубация инфузорий опытной пробы с настоем зверобоя, продырявленного травы напротив обеспечила значительное достоверное повышение количества инфузорий на 34,7% по сравнению с исходным по данной опытной пробе значением, а также на 8,49% по сравнению со средним исходным значением контрольной пробы, что вероятно следует связывать с известным высоким содержанием флавоноидов. Каштана конского цветков настой сразу после добавления в опытную пробу (0 мин, исходно) вызывал значительное достоверное снижение количества инфузорий на 44,9% по сравнению со средним исходным значением контрольной пробы, в опытных пробах было выявлено снижение активности и уменьшение количества выживших инфузорий в средней части капли, хотя при сравнении с контрольной пробой данной серии (контрольная проба 2) различия являлись минимальными (меньше на 2,2%). Инкубация 24 ч уменьшила выраженность данного эффекта, разница со средним исходным значением контрольной пробы составила 28,61% и разница с контрольной пробой данной серии 17,9% в меньшую сторону. Указанный эффект снижения количества инфузорий под влиянием каштана конского цветков настоя вероятно следует связывать с известным наличием в составе тритерпеновых сапонинов (эсцина и др.) [11], способных переходить в настой, и, за счет поверхностно-активных свойств, вызывать изменение проницаемости мембран клеток. Важно отметить, что при сравнении с исходным по данной опытной пробе значением, через 24 ч. инкубации выявлено достоверное повышение количества инфузорий на 65,9%, что может характеризовать защитно-приспособительные реакции тест-системы, реализуемые за счет наличия в составе антоцианов и флавоноидов, обладающих антиоксидантным действием, а так же полисахаридов и витаминов, выступающих в неблагоприятных условиях в качестве факторов регуляции метаболизма и компонентов питания для инфузорий. Синюхи голубой травы настой сразу после добавления в опытную пробу (0 мин, исходно) вызывал незначительные изменения количества инфузорий в опытной пробе - на 3,26% больше по сравнению со средним исходным значением контрольной пробы, при этом показатель являлся на 7,7% меньшим по сравнению с контрольной пробой данной серии (контрольная проба 3). Однако, инкубация 24 ч. обеспечила значительное достоверное снижение количества инфузорий на 47,0% по сравнению с контрольной пробой данной серии, разница с исходным по данной опытной пробе значением и по сравнению со средним исходным значением контрольной пробы являлась незначительной. Указанный результат, аналогично влиянию каштана конского цветков настоя, вероятно следует связывать прежде всего с высоким содержанием сапонинов, проявляющих прямой и отсроченный биоцидный эффект. Известно, что сапонины, являясь положительно заряженными молекулами, способны изменять проницаемость клеточной стенки, связываться с цитоплазматической мембраной, нарушая ее целостность, что приводит к лизису клетки [1]. Горца щавелелистного травы настой сразу после добавления в опытную пробу (0 мин, исходно) вызывал достоверное повышение количества инфузорий на 12,57% по сравнению со средним исходным значением контрольной пробы, разница с контрольной пробой по данной серии являлась незначительной. Инкубация 24 ч. обеспечила значительное достоверное повышение количества инфузорий на 18,8% по сравнению с исходным по данной опытной пробе значением и на 33,72% по сравнению со средним исходным значением контрольной пробы, при этом разница с контрольной пробой данной серии (контрольная проба 4) составила 25,0% в меньшую сторону, что следует связывать с максимально высоким показателем контрольной пробы данной серии в сравнении с остальными контрольными пробами. Биостимулирующее действие горца щавелелистного травы настоя следует связывать с наличием флавоноидов, обладающих известным антиоксидантным действием, полисахаридов и витаминов, а также холина, обладающих способностью регулировать клеточный обмен веществ и являться факторами питания простейших. Настой сбора седативного действия сразу после добавления в опытную пробу (0 мин, исходно) вызывал незначительное повышение количества инфузорий на 1,4% по сравнению с контрольной пробой данной серии (контрольная проба 5), при этом результат являлся на 30,13% меньшим в сравнении с исходным показателем средней контрольной пробы, что, однако не являлось достоверным. Инкубация с настоем сбора седативного действия в течение 24 ч. обеспечила значительное достоверное повышение количества инфузорий на 28,3% по сравнению с контрольной пробой данной серии (контрольная проба 5), на 44,06% в сравнении с исходным показателем средней контрольной пробы и максимальное достоверное повышение количества инфузорий на 104,4% или в 2,04 раза по сравнению с исходным по опытной пробе показателем, что значительно превосходило максимальный результат в контрольных пробах по всем сериям опытов и свидетельствует о значительном биостимулирующем действии изучаемого настоя сбора. Результаты наглядно представлены на рисунке (рис.). Рис. Оценка биостимулирующего действия некоторых видов растительного сырья и настоя сбора седативного действия in vitro с использованием тест-системы Paramecium caudatum Выявленный биостимулирующий эффект настоя сбора седативного действия дополняет представления о механизмах действия на клеточном уровне и связан с эффектами компонентов, содержащих как было вышеупомянуто, флавоноиды, обладающие известным антиоксидантным действием, полисахариды, витамины и витаминоподобные вещества, обладающие способностью регулировать клеточный обмен веществ и являться факторами питания, при этом нивелируются влияние на проницаемость мембраны дубильных веществ и сапонинов, способных оказывать биоцидный эффект, обеспечивая в целом синергестическое действие, что может являться важным в отношении защиты клеточных мембран, в том числе нейронов, и создания благоприятных условий для регенерации и размножения живых клеток. Таблица 2. Результаты оценки влияния настоев некоторых видов растительного сырья и настоя сбора седативного действия in vitro с использованием тест-системы Paramecium caudatum Наименование пробы, объект Количество инфузорий в пробе, шт 0 мин (исходно) 24 ч Контрольная проба (среднее) 105,28±4,654 Зверобоя продырявленного травы настой Контрольная проба 1 99,48±2,156 117,19±4,899## Разница с исходным, % - +17,8 Опытная проба 84,80±3,290*** 114,22±4,758### Разница с исходным, % - +34.7 Разница с контрольной пробой 1, % -14,8 -2,5 Разница с контрольной пробой (среднее), % -19,45 +8,49 Каштана конского цветков настой Контрольная проба 2 59,28±1,004 117,19±4,899### Разница с исходным, % - +97,7 Опытная проба 58,00±0,922+++ 96,22±2,814***,+,### Разница с исходным, % - +65,9 Разница с контрольной пробой 2, % -2,2 -17,9 Разница с контрольной пробой (среднее), % -44,9 -28,61 Синюхи голубой травы настой Контрольная проба 3 110,28±3,085 187,63±8,381### Разница с исходным, % - +70,1 Опытная проба 101,84±3,645++ 99,41±3,231***,+ Разница с исходным, % - -2,4 Разница с контрольной пробой 3, % -7,7 -47,0 Разница с контрольной пробой (среднее), % +3,26 +5,57 Горца щавелелистного травы настой Контрольная проба 4 123,72±4,438 187,63±8,381### Разница с исходным, % - +51,7 Опытная проба 118,52±4,193+++ 140,78±5,841*,+,## Разница с исходным, % - +18,8 Разница с контрольной пробой 4, % -4,2 -25,0 Разница с контрольной пробой (среднее), % +12,57 +33,72 Настой сбора седативного действия Контрольная проба 5 72,56±2,664 117,19±4,899### Разница с исходным, % - +61,5 Опытная проба 73,56±2,325 150,38±5,389***,+,### Разница с исходным, % - +104,4 Разница с контрольной пробой 5, % +1,4 +28,3 Разница с контрольной пробой (среднее), % -30,13 +44,06 Примечание: * - Р<0,05; ** - Р<0,01, *** - Р<0,001 достоверность различий при сравнении показателей между контрольной и опытной пробами; + - Р<0,05; ++ - Р<0,01, +++ - Р<0,001 достоверность различий при сравнении показателей между контрольной пробой (среднее) и опытными пробами, # - Р<0,05; ## - Р<0,01, ### - Р<0,001 достоверность различий при сравнении показателей в контрольной и опытных пробах с исходным значением 0 мин (исходно) Заключение С использованием автоматизированного аппаратно-программного комплекса in vitro на тест-системе Paramecium caudatum установлено, что настой сбора седативного действия, содержащий каштана конского цветки, горца щавелелистного траву, зверобоя траву, синюхи голубой траву в соотношении 1:1:2:2 характеризуется низкой токсичностью в отношении клеточной in vitro тест-системы и проявляет биостимулирующее действие, что подтверждается значительным достоверным повышением количества инфузорий на 44,06% по сравнению с показателем усредненной контрольной пробы и в 2,04 раза по сравнению с исходным показателем опытной пробы при инкубации 24 ч.

About the authors

A. S Bolgov

Voronezh State University

Author for correspondence.
Email: abolgov00@mail.ru
аспирант кафедры фармацевтической ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» 1, University Square, 394006, Voronezh, Russia

T. D Esipenko

Voronezh State University

Email: osyafss@yandex.ru
студентка фармацевтического факультета ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет». 1, University Square, 394006, Voronezh, Russia

A. A Gudkova

Voronezh State University

Email: al.f84@mail.ru
доктор фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» 1, University Square, 394006, Voronezh, Russia

A. S Chistyakova

Voronezh State University

Email: anna081189@yandex.ru
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» 1, University Square, 394006, Voronezh, Russia

E. A Aleksenko

Voronezh State University

Email: buzlama@pharm.vsu.ru
доктор медицинских наук, заведующая кафедрой фармакологии и клинической фармакологии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» 1, University Square, 394006, Voronezh, Russia

A. V Buzlama

Voronezh State University

Email: alexenko.egor@mail.ru
преподаватель кафедры фармакологии и клинической фармакологии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» 1, University Square, 394006, Voronezh, Russia

References

Supplementary files