Применение ВЭЖХ-масс-спектрометрии для количественного анализа нейроактивных аминокислот в гомогенатах головного мозга крыс после дериватизации с 9-флуоренилметилхлорформиатом


Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Актуальность. Важной составляющей механизма действия психотропных лекарственных средств является их влияние на обмен нейроактивных аминокислот. Изменение содержания аминокислот в структурах головного мозга крыс может выступать в роли фармакодинамического маркера, а также диагностического признака при изучении патогенеза заболеваний центральной нервной сиситемы. Цель исследования - разработка ВЭЖХ-МС/МС методики количественного определения нейроактивных аминокислот в гомогенатах головного мозга крыс после дериватизации с 9-флуоренилметилхлорформиатом. Материал и методы. Исследовали гомогенат мозговой ткани крыс. Выделение аминокислот из мозга крыс осуществляли с помощью гомогенизатора Поттера-Эльвейема. Депротеинизацию и дериватизацию проводили путем добавления к образцам раствора 9-флуоренилметилхлорформиата в ацетонитриле. Детектирование производных аминокислот выполняли с помощью масс-спектрометра Sciex 3200, для хроматографического разделения использовали ВЭЖХ Agilent 1260 Infinity II. Элюирование осуществляли смесью ацетонитрила и воды в градиентном режиме. Результаты. Пробоподготовка представляла собой смешивание 100 мкл гомогената мозговой ткани крыс, 100 мкл боратного буфера, 20 мкл 1 мМ раствора норвалина и 250 мкл 12 мМ раствора Fmoc-Cl в ацетонитриле с последующим центрифугированием в течение 10 мин. Для разделения Fmoc-производных аминокислот использовали хроматографическую колонку InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 4,6x100 мм, 2,7 мкм. Общее время хроматографического анализа - 10 мин, время удерживания Fmoc-производных глицина, ГАМК, аспарагиновой и глутаминовой кислот, аспарагина и глутамина - 6,7; 6,8; 6,4; 6,4; 6,2 и 6,1 мин соответственно. Аналитический диапазон методики для каждой аминокислоты составил от 0,05 до 50 нмоль в 1 мл гомогената. Апробация методики была произведена путем анализа содержания аминокислот в головном мозге шести интактных крыс Wistar. Заключение. Разработана хромато-масс-спектрометрическая методика количественного определения глутамина, аспарагина, глицина, ГАМК, глутаминовой и аспарагиновой кислоты в гомогенатах головного мозга крыс. Для повышения чувствительности анализа была проведена предколоночная дериватизация аминокислот с 9-флуоренилметилхлорформиатом.

Об авторах

Н. С. Попов

ФГБОУ ВО «Тверской государственный медицинский университет Минздрава России»

Email: education@tvgmu.ru

к.фарм.н., зав. научно-исследовательской лабораторией

г. Тверь, Россия

В. Ю. Балабаньян

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: education@tvgmu.ru

д.фарм.н., доцент, вед. науч. сотрудник, лаборатория трансляционной медицины, факультет фундаментальной медицины

Москва, Россия

М. Б. Петрова

ФГБОУ ВО «Тверской государственный медицинский университет Минздрава России»

Автор, ответственный за переписку.
Email: education@tvgmu.ru

д.б.н., профессор, зав. кафедрой биологии

г. Тверь, Россия

Н. Ю. Колгина

ФГБОУ ВО «Тверской государственный медицинский университет Минздрава России»

Email: education@tvgmu.ru

к.м.н., доцент, зав. кафедрой фармакологии и клинической фармакологии

г. Тверь, Россия

Г. А. Петров

ФГБОУ ВО «Тверской государственный медицинский университет Минздрава России»

Email: education@tvgmu.ru

к.м.н., доцент, кафедра фармакологии и клинической фармакологии

г. Тверь, Россия

Список литературы

  1. Федеральный закон от 12 апреля 2010 г. № 61 «Об обращении лекарственных средств». М. 56 с. В ред. от 11.06.2021.
  2. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоцразвития России. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.
  3. Chen X., Broeyer F., de Kam M., Baas J., Cohen A., van Gerven J. Pharmacodynamic response profiles of anxiolytic and sedative drugs. British journal of clinical pharmacology. 2017; 83(5): 1028-1038. doi.org/10.1111/bcp.13204
  4. Sousa A., Dinis-Oliveira R.J. Pharmacokinetic and pharmacodynamic of the cognitive enhancer modafinil: Relevant clinical and forensic aspects. Substance abuse. 2020; 41(2): 155173. doi.org/10.1080/08897077.2019.1700584
  5. Mankar S.S., Turan S.P., Mankar S.S., Shelke, P.A. Antidepressant in animal models of depression and study of cognitive property. GSC Biological and Pharmaceutical Sciences. 2019; 7(3): 64-76. doi.org/10.30574/gscbps.2019.7.3.0069
  6. Bourin M. Mechanisms of Action of Anxiolytics. Psychiatry and Neuroscience Update. Springer, Cham. 2021: 195-211. doi.org/10.1007/978-3-030-61721-9_18
  7. Piras F., Vecchio D., Assogna F., Pellicano C., Ciullo V., Banaj N. Spalletta G. Cerebellar gaba levels and cognitive interference in parkinson’s disease and healthy comparators. Journal of Personalized Medicine. 2021; 11(1): 16. doi.org/10.3390/jpm11010016
  8. Li J., Chen L., Guo F., Han X. The Effects of GABAergic System under Cerebral Ischemia: Spotlight on Cognitive Function. Neural Plasticity. 2020. doi.org/10.1155/2020/8856722
  9. Procter A. W., Bowen D. M. Cerebral Biopsy in the Neurochemical Study of Alzheimer Disease. Alzheimer Disease. CRC Press. 2020: 279-294.
  10. Srinivasa Rajagopalachari N.K., Shanmugasundaram P. Analytical method validation for the determination of Ninhydrin Positive Substances in amino acids by High Performance Liquid Chromatography. Annals of the Romanian Society for Cell Biology. 2021; 25 (6): 4323-4330.
  11. Uutela P., Ketola R. A., Piepponen P., Kostiainen R.Comparison of different amino acid derivatives and analysis of rat brain microdialysates by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytica chimica acta. 2009; 633(2): 223-231. doi.org/10.1016/j.aca.2008.11.055
  12. Ziegler J., Hussain H., Neubert R. H. Abel S. Sensitive and selective amino acid profiling of minute tissue amounts by HPLC/electrospray negative tandem mass spectrometry using 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc-Cl) derivatization. Amino Acid Analysis. Humana, New York. 2019: 365-379. doi.org/10.1007/978-1-4939-9639-1_27
  13. Peng M. Z., Cai Y. N., Shao Y. X., Zhao L., Jiang M. Y., Lin Y. T., Liu L. Simultaneous quantification of 48 plasma amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry to investigate urea cycle disorders. Clinica Chimica Acta. 2019; 495: 406-416. doi.org/10.1016/j.cca.2019.05.011
  14. Minkler P., Stoll M., Ingalls S., Yang S., Kerner J., Hoppel C. Quantification of carnitine and acylcarnitines in biological matrices by HPLC electrospray ionization-mass spectrometry. Clin. Chem. 2008; 54: 1451-1462. doi.org/10.1373/clinchem.2007.099226

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Общая реакция дериватизации аминокислот с помощью 9-флуоренилметилхлорформиата

Скачать (86KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Масс-спектры ионов-продуктов Fmoc-производных аминокислот в режиме регистрации отрицательных ионов (A – аспарагин, B – аспарагиновая кислота, C – глицин, D – глутамин, E – ГАМК, F – глутаминовая кислота

Скачать (591KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Хроматограмма стандартного образца с индивидуальной концентрацией каждой аминокислоты 50 нмоль/мл (подвижная фаза – ацетонитрил и деионизированная вода с добавлением 0,1% муравьиной кислоты; режим элюирования – градиентный; хроматографическая колонка – InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 4,6×100 мм; температура колонки – 40 °C; объем ввода – 10 мкл)

Скачать (163KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Калибровочные прямые для количественного определения глицина (A), ГАМК (B), аспарагина (C), глутамина (D), аспарагиновой (E) и глутаминовой (F) кислот (по оси X представлена концентрация аминокислоты в нмоль/мл, по оси Y – отношение площади хроматографического пика Fmoc-производного соответствующей аминокислоты к площади пика Fmoc-производного норвалина)

Скачать (319KB)
Метаданные

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».