The use of HPLC-MS/MS for the quantitative analysis of neuroactive amino acids in rat brain homogenates after derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate


Citar

Texto integral

Acesso aberto Acesso aberto
Acesso é fechado Acesso está concedido
Acesso é fechado Somente assinantes

Resumo

Relevance. The effect on the metabolism of neuroactive amino acids is the most important component of the mechanism of action of psychotropic drugs. Variation of substance of amino acids in the structures of the rat brain can act as a pharmacodynamic marker diagnostic sign in the study of the pathogenesis of diseases of the central nervous system. Purpose of the study. development of HPLC-MS / MS method for quantitative determination of neuroactive amino acids in rat brain homogenates after derivatization with 9-fluorenylmethylchloroformate. Material and methods. For the detection of amino acids from the rat brain was used a Potter-Elvehjem homogenizer. Deproteinization and derivatization were performed by adding a solution of 9-fluorenylmethylchloroformate in acetonitrile to the samples. Amino acid derivatives were detected using a Sciex 3200 mass spectrometer. For chromatographic separation was used an Agilent 1260 Infinity II HPLC. Elution was carried out with a mixture of acetonitrile and water in a gradient mode. Results. Sample preparation includes mixing 100 gl of rat brain tissue homogenate, 100 gl of borate buffer, 20 gl of 1 mM norvaline solution and 250 gl of 12 mM Fmoc-Cl solution in acetonitrile, followed by centrifugation for 10 minutes. For the separate Fmoc-derived amino acids was used hromatographic column InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7 gm. The total time of chromatographic analysis was 10 minutes, the retention time of Fmoc derivatives of glycine, GABA, aspartic and glutamic acids, asparagine and glutamine was 6.7; 6.8; 6.4; 6.4; 6.2 and 6.1 minutes, respectively. The analytical range of the method for each amino acid was from 0.05 to 50 nmol in 1 ml of homogenate. The method was tested by analyzing the amino acid content in the brain of 6 intact Wister rats. Conclusion. A chromatography-mass spectrometric method for the quantitative determination of glutamine, asparagine, glycine, GABA, glutamic and aspartic acids in rat brain homogenates has been developed. Precolumn derivatization of amino acids with 9-fluorenylmethylchloroformate was carried out to increase the sensitivity of the analysis.

Sobre autores

N. Popov

Tver State Medical University

Email: education@tvgmu.ru

Ph.D. (Pharm.), Head of Research Laboratory

Tver, Russia

V. Balabanyan

M.V. Lomonosov Moscow State University

Email: education@tvgmu.ru

Dr.Sc. (Pharm.), Associate Professor, Leading Research Scientist, Laboratory of Translational Medicine, Faculty of Fundamental Medicine

Moscow, Russia

M. Petrova

Tver State Medical University

Autor responsável pela correspondência
Email: education@tvgmu.ru

Dr.Sc. (Biol.), Professor, Head of Department of Biology

Tver, Russia

N. Kolgina

Tver State Medical University

Email: education@tvgmu.ru

Ph.D. (Med.), Associate Professor, Head of Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology

Tver, Russia

G. Petrov

Tver State Medical University

Email: education@tvgmu.ru

Ph.D. (Med.), Associate Professor, Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology

Tver, Russia

Bibliografia

  1. Федеральный закон от 12 апреля 2010 г. № 61 «Об обращении лекарственных средств». М. 56 с. В ред. от 11.06.2021.
  2. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоцразвития России. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.
  3. Chen X., Broeyer F., de Kam M., Baas J., Cohen A., van Gerven J. Pharmacodynamic response profiles of anxiolytic and sedative drugs. British journal of clinical pharmacology. 2017; 83(5): 1028-1038. doi.org/10.1111/bcp.13204
  4. Sousa A., Dinis-Oliveira R.J. Pharmacokinetic and pharmacodynamic of the cognitive enhancer modafinil: Relevant clinical and forensic aspects. Substance abuse. 2020; 41(2): 155173. doi.org/10.1080/08897077.2019.1700584
  5. Mankar S.S., Turan S.P., Mankar S.S., Shelke, P.A. Antidepressant in animal models of depression and study of cognitive property. GSC Biological and Pharmaceutical Sciences. 2019; 7(3): 64-76. doi.org/10.30574/gscbps.2019.7.3.0069
  6. Bourin M. Mechanisms of Action of Anxiolytics. Psychiatry and Neuroscience Update. Springer, Cham. 2021: 195-211. doi.org/10.1007/978-3-030-61721-9_18
  7. Piras F., Vecchio D., Assogna F., Pellicano C., Ciullo V., Banaj N. Spalletta G. Cerebellar gaba levels and cognitive interference in parkinson’s disease and healthy comparators. Journal of Personalized Medicine. 2021; 11(1): 16. doi.org/10.3390/jpm11010016
  8. Li J., Chen L., Guo F., Han X. The Effects of GABAergic System under Cerebral Ischemia: Spotlight on Cognitive Function. Neural Plasticity. 2020. doi.org/10.1155/2020/8856722
  9. Procter A. W., Bowen D. M. Cerebral Biopsy in the Neurochemical Study of Alzheimer Disease. Alzheimer Disease. CRC Press. 2020: 279-294.
  10. Srinivasa Rajagopalachari N.K., Shanmugasundaram P. Analytical method validation for the determination of Ninhydrin Positive Substances in amino acids by High Performance Liquid Chromatography. Annals of the Romanian Society for Cell Biology. 2021; 25 (6): 4323-4330.
  11. Uutela P., Ketola R. A., Piepponen P., Kostiainen R.Comparison of different amino acid derivatives and analysis of rat brain microdialysates by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytica chimica acta. 2009; 633(2): 223-231. doi.org/10.1016/j.aca.2008.11.055
  12. Ziegler J., Hussain H., Neubert R. H. Abel S. Sensitive and selective amino acid profiling of minute tissue amounts by HPLC/electrospray negative tandem mass spectrometry using 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc-Cl) derivatization. Amino Acid Analysis. Humana, New York. 2019: 365-379. doi.org/10.1007/978-1-4939-9639-1_27
  13. Peng M. Z., Cai Y. N., Shao Y. X., Zhao L., Jiang M. Y., Lin Y. T., Liu L. Simultaneous quantification of 48 plasma amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry to investigate urea cycle disorders. Clinica Chimica Acta. 2019; 495: 406-416. doi.org/10.1016/j.cca.2019.05.011
  14. Minkler P., Stoll M., Ingalls S., Yang S., Kerner J., Hoppel C. Quantification of carnitine and acylcarnitines in biological matrices by HPLC electrospray ionization-mass spectrometry. Clin. Chem. 2008; 54: 1451-1462. doi.org/10.1373/clinchem.2007.099226

Arquivos suplementares

Arquivos suplementares
Ação
1. JATS XML
Baixar
2. Fig. 1. General reaction of amino acid derivatization with 9-fluorenylmethylchloroformate

Baixar (86KB)
Metadados
3. Fig. 2. Mass spectra of ion-products of Fmoc-derived amino acids in the negative ion registration mode (A - asparagine, B - asparagic acid, C - glycine, D - glutamine, E - GABA, F - glutamic acid

Baixar (591KB)
Metadados
4. Fig. 3. Chromatogram of a reference sample with an individual concentration of each amino acid of 50 nmol/ml (mobile phase: acetonitrile and deionized water with 0.1% formic acid; elution mode: gradient; InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 4.6 × 100 mm column; column temperature: 40 °C; injection volume: 10 µl)

Baixar (163KB)
Metadados
5. Fig. 4. Calibration straight lines for quantitative determination of glycine (A), GABA (B), asparagine (C), glutamine (D), asparagine (E), and glutamic acid (F) (X-axis represents amino acid concentration in nmol/ml, Y-axis is the ratio of chromatographic peak area of Fmoc-derivative of corresponding amino acid to peak area of Fmoc-derivative of norvaline)

Baixar (319KB)
Metadados

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».