Моделирование параметров работы автоматизированной системы контроля признаков контаминации агрокультур в условиях клонального размножения методами цифровой цветометрии

Полный текст

Введение

Основное направление получения оздоровленного посадочного материала – микроклональное размножение, преимущество которого заключается в возможности получения высококачественного семенного и посадочного материала культурных растений в условиях лаборатории круглый год в гораздо больших объемах. Соблюдение условий стерильности в процессе микроклонального размножения культур является важнейшим фактором его успешного проведения. Растения обладают высокой восприимчивостью к микроорганизмам, подавляющим их рост, и не способны сопротивляться инфекциям. А поскольку питательная среда, на которой выращиваются экспланты, является идеальной для роста микроорганизмов, необходимо не только исключить возможность контаминации из внешней среды, но и обеспечить эффективную стерилизацию растительного материала, так как на его поверхности и внутри тканей почти всегда присутствует посторонняя микрофлора.

В настоящее время проблема стерильности сред и растительных эксплантов в биотехнологических лабораториях стои́т достаточно остро. Причин попадания бактериальной и микотической инфекций много, но наиболее распространенные две: первая – это микроорганизмы, попадающие вместе с растением, которое вводят впервые в культуру; вторая – микроорганизмы, которые попадают при какой-либо работе с культурой ткани (чаще всего при пересеве культуры) [1].

Однако даже тщательное соблюдение протоколов способов стерилизации полностью не обеспечивает стерильность питательной среды и эксплантов in vitro. В результате возможно появление бактериальной или микотической инфекции, в короткие сроки готовое поразить весь материал растительных клеток или тканей, что приведет к отбраковке ряда образцов и снижению выхода готовой продукции растениеводства. Кроме этого, в худшем случае не исключено заражение бактериальной или микотической инфекцией всей стерильной камеры или лабораторного помещения, что не позволит реализовывать технологию микроклонального размножения растений до полного решения проблемы контаминации и приведет к производственным потерям.

Своевременное обнаружение контаминации питательной среды и эксплантов позволит не только вовремя исключить зараженный образец из стерильной камеры, но и провести оперативное вмешательство для пересева содержимого пробирки, тем самым сохранив его.

Как правило, идентификация контаминации питательной среды или экспланта осуществляется визуально подготовленными людьми, отвечающими за культивирование микрорастений и ведущими мониторинг для контроля за состоянием роста и развития продукции растениеводства в регулируемых условиях микроклимата. Тем не менее обеспечение визуальной достоверной идентификации контаминации осложнено проблемой, представленной индивидуальными и субъективными факторами, такими как низкая квалификация или ее отсутствие, недостаточный опыт работы и утомляемость исполнителей. Кроме этого, отсутствие кадров, оптимизация производства, а также политика выполнения Ведомственного проекта «Цифровое сельское хозяйство», Федеральной научно-технической программы развития сельского хозяйства на 2017 – 2025 годы («Сельскохозяйственная техника и оборудование», «Селекция и семеноводство») обязывает проводить разработку и внедрение автоматизированных цифровых систем для эффективной реализации культивирования растений на основании достоверных данных.

Решение проблемы состоит в разработке и внедрении системы обнаружения контаминации посредством технического зрения, анализа цифровых снимков с использованием библиотек машинного обучения для последующей обработки искусственными нейронными сетями.

Объекты и методы исследования

Разработка простых и дешевых средств определения состава веществ материалов в режиме реального времени – важная тенденция развития современных аналитических методов в сельскохозяйственной биотехнологии. В последнее время наблюдается устойчивый интерес к химическому анализу, основанному на регистрации электромагнитного излучения в видимом диапазоне длин волн с помощью цифровых устройств для получения цветных растровых изображений. В литературе для обозначения данного метода применяют следующие термины: цифровая или компьютерная цветометрия; видеоаналитические подходы; Digital Color Analysis (DCA), Digital Image Colorimetry (DIC), Digital Image Analysis, Computer Vision based Analytical Chemistry (CVAC) [2, 3].

Метод цифровой или компьютерной цветометрии заключается в определении количественных характеристик цвета и установлении их взаимосвязи с содержанием определяемых веществ в анализируемых объектах. Для количественной оценки цвета созданы различные цветовые системы – RGB, CMY(K), XYZ, Lab, HSB. Система RGB образована тремя основными цветами – красным (R), зеленым (G) и синим (B), которые отвечают монохроматическому излучению с длинами волн 700,0; 546,1 и 435,8 нм соответственно.

Датчик определения цвета TCS230 представляет собой преобразователь интенсивности светового потока в частоту высокого разрешения, снабженный четырьмя группами фотодиодов без светофильтра и со светофильтрами: красным, зеленым, синим [4] (рис. 1).

 

Рис. 1. Датчик определения цвета TCS230

а – общий вид; б – процесс регистрации цветовых характеристик объекта

 

Рассматриваемый датчик является программируемым конвертером, объединяющим кремниевые фотодиоды и преобразователь тока в частоту в одном монолитном CMOS-кристалле (Complementary Metal–Oxide–Semiconductor). Выходной сигнал представляет собой квадраты (прямоугольный сигнал с заполнением 50 %), частота которого прямо пропорциональна интенсивности светового потока (освещенности). Полное разрешение выходной частоты может быть изменено с помощью двух управляющих выводов (выводы S0 и S1, с помощью которых можно установить масштаб частоты выходного сигнала на 12, 120 и 600 кГц). Цифровые входы и выходы осуществляют прямое подключение к микроконтроллерным или логическим цепям. Инверсный вход разрешения работы переключает выходы устройства в состояние высокого входного сопротивления («третье состояние»), что позволяет присоединять на один вход микроконтроллера несколько датчиков.

Преобразователь освещенности в частоту содержит матрицу 8 × 8 фотодиодов. Шестнадцать фотодиодов снабжены синими светофильтрами. Шестнадцать других– зелеными и еще 16 – красными, оставшиеся 16 фотодиодов не имеют фильтров. Четыре типа фотодиодов (по светофильтрам) транспозированы для снижения влияния неравномерности освещения датчика и засветки. Все 16 фотодиодов одного типа соединены в параллельную цепь, выбор группы осуществляется через два входных вывода выбора цвета (выводы S2 и S3 позволяют выбрать красную, зеленую, синюю или бесцветную группы).

Предлагается использовать принцип цифровой цветометрии при определении признаков бактерицидной, фунгицидной, а также спороцидной зараженности питательных сред и эксплантов растений при их микроклональном размножении. Так, при посадке эксплантов на агаризованную питательную среду Мурасиге – Скуга в индивидуальные стерильные пробирки соблюдается единообразие внешнего вида, в частности цвета, для всей партии приготовленной питательной среды, в зависимости от ее компонентов и их количества. Как правило, при клональном микроразмножении картофеля базовая агаризованная питательная среда имеет равномерный молочно-серый оттенок (рис. 2, а).

 

Рис. 2. Посадочный материал растений, полученный путем микроклонального размножения in vitro (пример):

а – стерильный растительный эксплант; б – растительный эксплант, пораженный грибковой инфекцией [1]

 

Наличие признаков зараженностей четко выражается изменением цветовых характеристик как экспланта, так и самой питательной среды (рис. 2, б), что необходимо обнаружить как можно быстрее для предотвращения потери образца.

Предлагаемая измерительная система автоматизированного модуля контроля признаков контаминации растений при клональном микроразмножении будет выполнена на базе датчика определения цвета TCS230 и микроконтроллера AVR / ARM Cortex-архитектуры или Intel Galileo Gen. 2 на основе Intel Quark SoC X1000, 32-битного Intel Pentium процессора.

Результаты исследований

Для разработки критериев качества работы предлагаемого автоматизированного модуля рассмотрим кибернетическую модель «черного ящика» процесса, предусматривающую анализ факторов, оказывающих влияние на работу системы, а именно одного из критериев, определяющего ее эффективность.

В качестве входных управляемых величин (рис. 3), влияющих на процесс эффективного определения цвета посредством датчика определения цвета TCS230, выделены факторы:

Х₁ – уровень освещения рабочей камеры;

Х₂ – цветовая температура освещения рабочей камеры (холодная, теплая и др.);

Х₃ – форма поверхности контролируемых образцов;

Х₄ – наличие световых пятен (блики) поверхности контролируемых образцов;

Х₅ – время на обнаружения цветовых характеристик;

Х₆ – программные настройки чувствительности и калибровки датчика.

 

Рис. 3. Модель процесса эффективного определения цвета посредством датчика цвета TCS230

 

В качестве выходного показателя принят фактор Y, учитывающий эффективность работы системы, а именно достоверность определения конкретного цвета датчиком.

Датчик TCS230 определяет цветовые характеристики объекта по трем каналам R, G, B и программно обеспечивает установку калибровочных значений для каждого из каналов, что необходимо при подготовке автоматизированного устройства контроля признаков контаминации к новым условиям эксплуатации (к примеру, изменение уровня освещенности в рабочей камере с растительными образцами). В результате, конечные итоговые значения составляющих аддитивной цветовой модели находятся следующим образом:

$R_p+R_{kal}=R_s$; (1)

$G_p+G_{kal}=G_s$; (2)

$B_p+B_{kal}=B_s$, (3)

где R_s, G_s, B_s – итоговые значения составляющих R, G, B; R_p, G_p, B_p – показания от датчика по составляющим R, G, B; R_kal, G_kal, B_kal – калибровочные значения по составляющим R, G, B (задается из меню системы управления).

Также в алгоритме и реализованном программном коде можно устанавливать значения «чувствительности», то есть порог минимального срабатывания датчика на R-, G-, B-составляющие. В итоге, согласно условиям RGB-модели цифровой цветометрии, с учетом использования датчика определения цвета TCS230 для предлагаемого устройства автоматизированного контроля признаков контаминации растений при клональном микроразмножении, получаем следующие условия определения конкретных цветов (табл. 1).

 

Таблица 1. Условия определения конкретных цветов для аддитивной цветовой RGB-модели

Цвет	Условие обнаружения конкретного цвета – значения составляющих аддитивной цветовой модели RGB
	R	G	B
Красный	Rch < Rs	Gs < Gch	Bs < Bch
Зеленый	Rs < Rch	Gch < Gs
Синий		Gs < Gch	Bch < Bs
Белый	Rch < Rs	Gch < Gs
Желтый			Bch > Bs
Розовый		Gch > Gs	Bch < Bs
Лазурный	Rch > Rs	Gch < Gs
Черный		Gch > Gs	Bch > Bs

Примечание:  – порог минимального значения, превышение которого принимается как срабатывание обнаружения цвета «красный» / «зеленый» / «синий», составляющей аддитивной цветовой модели RGB (чувствительность – задается из меню системы управления).

 

Таблица 2. Таблица истинности срабатывания оповещения об идентификации контаминации модулем контроля признаков контаминации растений при клональном микроразмножении

Номер состояния	Контролируемый цвет
	Красный		Зеленый		Синий		Белый
	Ф	М	Ф	М	Ф	М	Ф	М
	Х16	Х15	Х14	Х13	Х12	Х11	Х10	Х9
	Вес разряда
	215	214	213	212	211	210	29	28
1	1	1	0	0	0	0	0	0
2	0	0	1	1	0	0	0	0
3	0	0	0	0	1	1	0	0
4	0	0	0	0	0	0	1	1
5	0	0	0	0	0	0	0	0
6	0	0	0	0	0	0	0	0
7	0	0	0	0	0	0	0	0
8	0	0	0	0	0	0	0	0
Номер состояния	Контролируемый цвет
	Желтый		Розовый		Лазурный		Черный
	Ф	М	Ф	М	Ф	М	Ф	М
	Х8	Х7	Х6	Х5	Х4	Х3	Х2	Х1
	Вес разряда
	27	26	25	24	23	22	21	20
1	0	0	0	0	0	0	0	0
2	0	0	0	0	0	0	0	0
3	0	0	0	0	0	0	0	0
4	0	0	0	0	0	0	0	0
5	1	1	0	0	0	0	0	0
6	0	0	1	1	0	0	0	0
7	0	0	0	0	1	1	0	0
8	0	0	0	0	0	0	1	1

Примечание: Ф – факт наличия контролируемого цвета среди образцов; М – выбор обнаружения контролируемого цвета в меню программы.

 

Для срабатывания оповещения обнаружения признаков контаминации образцов необходимо условие, чтобы выявленный по алгоритму цвет совпал с цветом, заданным из меню системы управления. В таблице 2 представлены состояния системы, при котором выходной сигнал равен единице. Логическая функция, описывающая условия, при которых выходной сигнал равен единице представлена в виде совершенной дизъюнктивной нормальной формы (СДНФ) (4):

$$\begin{gathered} y=x_{16}{x}_{15}{\overline{x}}_{14}{\overline{x}}_{13}{\overline{x}}_{12}{\overline{x}}_{11}{\overline{x}}_{10}{\overline{x}}_9{\overline{x}}_8{\overline{x}}_7{\overline{x}}_6{\overline{x}}_5{\overline{x}}_4{\overline{x}}_3{\overline{x}}_2{\overline{x}}_1+{\overline{x}}_{16}{\overline{x}}_{15}{x}_{14}{x}_{13}{\overline{x}}_{12}{\overline{x}}_{11}{\overline{x}}_{10}{\overline{x}}_9{\overline{x}}_8{\overline{x}}_7{\overline{x}}_6{\overline{x}}_5{\overline{x}}_4{\overline{x}}_3{\overline{x}}_2{\overline{x}}_1+ \\ +{\overline{x}}_{16}{\overline{x}}_{15}{\overline{x}}_{14}{\overline{x}}_{13}{x}_{12}{x}_{11}{\overline{x}}_{10}{\overline{x}}_9{\overline{x}}_8{\overline{x}}_7{\overline{x}}_6{\overline{x}}_5{\overline{x}}_4{\overline{x}}_3{\overline{x}}_2{\overline{x}}_1+{\overline{x}}_{16}{\overline{x}}_{15}{\overline{x}}_{14}{\overline{x}}_{13}{\overline{x}}_{12}{\overline{x}}_{11}{x}_{10}{x}_9{\overline{x}}_8{\overline{x}}_7{\overline{x}}_6{\overline{x}}_5{\overline{x}}_4{\overline{x}}_3{\overline{x}}_2{\overline{x}}_1+ \end{gathered}$$

$$\begin{gathered} +{\overline{x}}_{16}{\overline{x}}_{15}{\overline{x}}_{14}{\overline{x}}_{13}{\overline{x}}_{12}{\overline{x}}_{11}{\overline{x}}_{10}{\overline{x}}_9{x}_8{x}_7{\overline{x}}_6{\overline{x}}_5{\overline{x}}_4{\overline{x}}_3{\overline{x}}_2{\overline{x}}_1+{\overline{x}}_{16}{\overline{x}}_{15}{\overline{x}}_{14}{\overline{x}}_{13}{\overline{x}}_{12}{\overline{x}}_{11}{\overline{x}}_{10}{\overline{x}}_9{\overline{x}}_8{\overline{x}}_7{x}_6{x}_5{\overline{x}}_4{\overline{x}}_3{\overline{x}}_2{\overline{x}}_1+ \\ +{\overline{x}}_{16}{\overline{x}}_{15}{\overline{x}}_{14}{\overline{x}}_{13}{\overline{x}}_{12}{\overline{x}}_{11}{\overline{x}}_{10}{\overline{x}}_9{\overline{x}}_8{\overline{x}}_7{\overline{x}}_6{\overline{x}}_5{x}_4{x}_3{\overline{x}}_2{\overline{x}}_1+{\overline{x}}_{16}{\overline{x}}_{15}{\overline{x}}_{14}{\overline{x}}_{13}{\overline{x}}_{12}{\overline{x}}_{11}{\overline{x}}_{10}{\overline{x}}_9{\overline{x}}_8{\overline{x}}_7{\overline{x}}_6{\overline{x}}_5{\overline{x}}_4{\overline{x}}_3{x}_2{x}_1. \end{gathered}$$ (4)

По представленным условиям работы предлагается алгоритм автоматизированного контроля контаминации в питательной среде / растительном объекте (отклонений от регламентированных показателей по цветовым характеристикам) [5, 6] (рис. 4).

 

Рис. 4. Алгоритм автоматизированного контроля контаминации в питательной среде / растительном объекте, характеристик питательной среды (отклонений от регламентированных показателей)

 

Изменение цвета среды по сравнению с регламентированным (может быть вызвано отклонениями pH среды или ростом контаминантов): изменение цвета и появление мути может свидетельствовать о бактериальном или грибковом заражении (контаминации). Если цвет сдвигается в сторону малинового – это может быть связано с отсутствием размножения клеток, недостаточным количеством для данного объема или их гибелью.

Заключение

Разработанный алгоритм автоматизированной интеллектуальной системы контроля контаминации в питательной среде / растительном объекте, характеристик питательной среды (отклонений от регламентированных показателей) обеспечивает идентификацию высокой степени точности биологических загрязнений при микроклональном размножении растений посредством анализа цветовых характеристик объекта, а также цифровых снимков с использованием специализированных библиотек глубокого машинного обучения для последующей обработки искусственными нейронными сетями различных архитектур. Использование данного алгоритма при проектировании систем автоматизации климатических камер для выращивания растений [7, 8] способствует своевременному обнаружению контаминации питательной среды и эксплантов, что позволит не только вовремя исключить зараженные образцы из стерильной камеры, но и провести оперативное вмешательство для пересева содержимого, тем самым предотвращая производственные потери.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-21-20041 и администрации Волгоградской области.

Об авторах

Никита Игоревич Лебедь

Волгоградский государственный аграрный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: nik8872@yandex.ru

доктор технических наук, профессор кафедры «Электроснабжение и энергетические системы»

Россия, Волгоград

Кирилл Евгеньевич Токарев

Волгоградский государственный аграрный университет

Email: nik8872@yandex.ru

кандидат экономических наук, доцент кафедры «Математическое моделирование и информатика»

Россия, Волгоград

Дмитрий Сергеевич Гапич

Волгоградский государственный аграрный университет

Email: nik8872@yandex.ru

доктор технических наук, заведующий кафедрой «Электроснабжение и энергетические системы»

Россия, Волгоград

Список литературы

Дополнительные файлы