Effect of nanocluster polyoxometalate {mo72fe30} on morphofunctional state of macrophages in cultures

Full Text

Макрофаги представляют собой пластичные и гетерогенные иммунные клетки (Taylor et al., 2005). Они присутствуют практически во всех тканях, участвуют в распознавании, фагоцитозе и деградации клеточного мусора и патогенов (Rogler, 2017). Они играют важную роль в презентации антигенов Т-клеткам, а также в индукции экспрессии костимулирующих молекул на других типах антигенпрезентирующих клеток, что инициирует адаптивный иммунный ответ (Jackson, 2016). Кроме того, макрофаги задействованы в инициации воспаления путем высвобождения цитокинов и хемокинов, которые, в свою очередь, привлекают другие иммунные клетки к очагам воспаления (Duan, 2016).

В зависимости от того, какие цитокины, факторы роста, эффекторные молекулы секретируют макрофаги, их традиционно подразделяют на классически и альтернативно активированные (М 1 и М 2 соответственно). Именно пластичность макрофагов, способность менять фенотип и функциональную активность в зависимости от характера микроокружения делает эти клетки чрезвычайно привлекательными при разработке лекарственных средств.

Макрофаги играют решающую роль в распознавании, обработке и клиренсе чужеродных частиц, в том числе наночастиц (Dobrovolskaia et al., 2007). Между тем наночастицы могут направлять макрофаги к различным поляризационным состояниям в качестве стимула микроокружения (Lucarelli et al., 2004; Bartneck et al., 2012; Laskar et al., 2013). Перепрограммирование макрофагов с фенотипа М1 на фенотип М2 может быть использовано для лечения хронических воспалительных заболеваний (Liu et al., 2014). Фенотипический сдвиг макрофагов М2 в сторону подтипа М1 полезен на ранних фазах воспаления и иммунотерапии рака (Su et al., 2015).

Адресная доставка лекарственных препаратов с использованием наночастиц для повышения безопасности и терапевтической эффективности инкапсулированных лекарственных средств относится к одному из интенсивно развивающихся направлений нанотехнологии (Caruthers et al., 2007; Dutta, 2007). Более глубокое понимание влияния наночастиц на поляризацию макрофагов имеет важное значение для модуляции биологических эффектов in vivo и разработки методов лечения, основанных на использовании наночастиц.

Соединения, известные как нанокластерные полиоксометаллаты с кеплератной структурой (ПОМ) впервые были синтезированы под руководством Мюллера (Müller et al., 1998, 1999). Представители этого класса привлекают внимание высокосимметричной структурой молекул сферической формы и размерами порядка нескольких нанометров. ПОМ обладают рядом интересных свойств, которые делают их перспективными для использования в качестве наночастиц для адресной доставки лекарств (Ostroushko et al., 2021). Нанокластерные, а также более простые ПОМ обладают собственной биологической активностью (Yamase, 2013; Bijelic et al., 2019). Многие ПОМ содержат молибден в двух степенях окисления (+5 и +6); присутствие пятивалентного молибдена обуславливает их токсическое действие. ПОМ {Mo₇₂Fe₃₀}, содержащий молибден только в высшей степени окисления (Mo⁺⁶), представляется нам наиболее перспективным представителем данного класса соединений в качестве основы средства адресной доставки. Обладая размером молекулы 2.5 нм, растворимый в воде, {Mo₇₂Fe₃₀} способен разлагаться в средах организма на более простые соединения молибдена и железа (Остроушко и др., 2011), которые в дальнейшем включаются в естественные для организма процессы метаболизма.

{Mo₇₂Fe₃₀} состоит из кислородных полиэдров молибдена и железа, стабилизированных ацетатными и водными лигандами, имеет внутреннюю полость (Müller et al., 1999) и способен связывать лекарственные препараты, флуоресцентные метки, биосовместимые полимеры, белки (Grzhegorzhevskii et al., 2023; Ostroushko et al., 2018; Tonkushina et al., 2022) и осуществлять движение под действием слабых электрических полей, в частности, при чрезкожном ионофорезе (Ostroushko et al., 2021). Ранее нами было продемонстрировано пролонгированное высвобождение противоопухолевого лекарственного препарата из комплекса с {Mo₇₂Fe₃₀} в эксперименте, моделирующем высвобождение препарата в крови (Tonkushina et al., 2022). Формула соединения:

[Mo₇₂Fe₃₀O₂₅₂(CH₃COO)₁₂{Mo₂O₇(H₂O)}₂ {H₂Mo₂O₈(H₂O)}(H₂O)₉₁] · ≈150H₂O.

Однако исследований действия этого ПОМ на культуру макрофагов, а также возможности их перепрограммирования при действии ПОМ ранее не проводили.

Цель настоящей работы заключалась в оценке влияния {Мо₇₂Fe₃₀} на культуру макрофагов, а также изучение возможности поляризации клеток при действии этого ПОМ. Оценивали влияние {Мо₇₂Fe₃₀} на морфологию, жизнеспособность, фагоцитарную активность и активность α-нафтилацетатэстеразы (специфического фермента моноцитов/макрофагов), а также на фенотип перитонеальных и альвеолярных макрофагов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

ПОМ кеплератного типа {Mo₇₂Fe₃₀} для проведения исследований был синтезирован с использованием отработанной двухстадийной методики (Müller et al., 1998, 1999). При культивировании клеток с {Mo₇₂Fe₃₀} его вводили в дозе  100 мкл (водного раствора в концентрации 2.0 г/л) на ٩00 мкл питательной среды. Доза была отработана в предыдущих исследованиях (Остроушко и др.,  20 18). Так как {Mo₇₂Fe₃₀} в питательной среде постепенно деструктирует на более простые молибден и железосодержащие ионы, использовали и продукты деструкции ПОМ (ПД) в качестве образцов сравнения для выявления влияния непосредственно нанокластерной структуры {Mo₇₂Fe₃₀}. ПД получали кипячением раствора {Mo₇₂Fe₃₀} в концентрации  2.0 г/л в течение 3 ч и также вводили в дозе  100 мкл раствора на ٩00 мкл питательной среды. {Mo₇₂Fe₃₀} устойчив до температуры ~70° C, и кипячение водного раствора позволяет гарантировать его деструкцию до более простых ионов молибдена и железа.

Животные. В работе использовали популяции макрофагов различной тканевой принадлежности (альвеолярные и перитонеальные), полученные из самцов крыс трехмесячного возраста породы Wistar. Условия содержания и обращение с используемыми в эксперименте животными соответствовали рекомендациям международных этических комитетов (директива Совета ЕС 2010/63/EU).

Выделение и культивирование макрофагов. Для выделения перитонеальных макрофагов вводили внутрибрюшинно  5 мл ледяного раствора Хэнкса, содержащего 100 ЕД пенициллина и  100 мкг стрептомицина на 1 мл (Li et al., 2012). Выполняли легкий массаж брюшной полости, а затем осторожно собирали жидкость. Полученную перитонеальную жидкость центрифугировали при  2 50 g в течение  10 мин. Клетки промывали раствором Хэнкса и повторно центрифугировали. Надосадочную жидкость сливали, а клеточный осадок ресуспендировали в  5 мл полной питательной среды и разливали по  500 мкл на покровные стекла, уложенные в ٦-луночный планшет, и оставляли для прикрепления в течение ٦0 мин в инкубаторе при 37° С,  5٪ CO₂ и ٩ 5٪ воздуха.

Для приготовления полной питательной среды использовали культуральную среду RPMI- 1٦40 (٩0٪ от общего объема) (“Биолот”, Россия), эмбриональную телячью сыворотку FBS (“Биолот”, Россия) (10% от общего объема среды), и гентамицин в концентрации 10 мкг/мл.

Альвеолярные макрофаги получали из бронхоальвеолярной жидкости методом альвеолярного лаважа тeплым раствором Хэнкса в объeме 3–4 мл, подогретым до температуры тела (36–37° С) (Wiggins, 1991). Полученную лаважную жидкость легких центрифугировали при  2 50 g в течение  10 мин. Клетки промывали раствором Хэнка и центрифугировали. Надосадочную жидкость сливали, а клеточный осадок ресуспендировали в  5 мл полной питательной среды и разливали по  500 мкл на покровные стекла, уложенные в ٦-луночный планшет и оставляли для прикрепления в течение ٦0 мин в инкубаторе при 37° С,  5٪ CO₂ и ٩ 5٪ воздуха.

За это время макрофаги прикреплялись к культуральной поверхности. По истечении 1 ч среду с не прикрепившимися клетками сливали, лунки промывали раствором Хенкса, после чего вновь заливали нужный объем питательной культуральной среды. Далее клетки культивировали при 37° С в СО₂-инкубаторе в атмосфере 5% СO₂ и 95% воздуха.

Определение фенотипических маркеров макрофагов. Фенотип полученных клеток оценивали методом иммуноцитохимического окрашивания. В качестве фенотипического маркера использовали маркер F4/80, который позволяет определить дифференцировку клеток в макрофаги (McKnight et al., 1996; Dos Anjos Cassado, 2017; Khazen et al., 2005). По маркеру CD163 определяли дифференцировку макрофагов в противовоспалительный фенотип М 2 (Schaer et al., 2006; Шарафутдинова и др.,  20 14). При связывании моноклонального антитела к CD163 с соответствующим гликопротеином клеток наблюдается диффузное окрашивание мембран и цитоплазмы макрофагов М 2 (Hu et al., 2017). Кроме того, этот маркер представляет собой скавенджер-рецептор, повышенная экспрессия которого связана с активацией эндоцитоза (Onofre et al., 2009; Etzerodt et al., 2013). Исследование проводили через  24 ч после культивирования макрофагов с {Mo₇₂Fe₃₀} или ПД в CO₂-инкубаторе. Для идентификации вышеперечисленных маркеров применяли непрямой пероксидазный метод окрашивания. Процедура окрашивания одинакова для всех идентифицируемых антигенов.

Покровные стeкла фиксировали в  10٪-ном формалине. После высушивания их подвергали депарафинизации, дегидратации и промывке в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем Tween 20 (PanReac AppliChem GmbH, Германия), pH 7.6. Фиксация в формалине может приводить к изменению трехмерной структуры белков. При этом может происходить модификация антигенных эпитопов и изменение электростатического взаимодействия, что приводит к невозможности взаимодействия эпитопа антигена с паратопом антитела. Поэтому, до нанесения первичных антител проводили демаскировку эпитопов протеазами.

Для минимизации фонового окрашивания проводили блокировку активности эндогенной пероксидазы путeм нанесения на срезы 3٪-ного раствора пероксида водорода, последующей промывки и нанесения на 30 мин протеинового блока на основе бычьего сывороточного альбумина.

Следующий этап включал инкубацию с первичными антителами в течение ٦0 мин при 37° С. Несвязавшиеся реагенты отмывали в буфере PBS + Tween 20 (3 раза по 5 мин) и после проводили инкубацию с вторичными антителами в течение 60 мин при 37° С, затем повторяли промывку в то же буфере.

Для визуализации антигенреактивных клеток использовали хромогенный субстрат 3,3-диаминобензидин (DAB) в забуференном растворе. DAB-позитивные клетки идентифицировали по коричневому окрашиванию. После окрашивания покровные стекла промывали в дистиллированной воде  5 мин, окрашивали гематоксилином и промывали в водопроводной воде  5 мин. На стеклах подсчитывали общее число клеток и число клеток, положительно окрашенных соответствующим антителом.

Влияние ПОМ. Полученные культуры перитонеальных и альвеолярных макрофагов делили на три группы: нестимулированные (контроль), стимулированные макрофаги, к которым через 24 ч культивирования в CO₂-инкубаторе добавляли {Mo₇₂Fe₃₀} или ПД и продолжали культивировать еще 24 ч.

Оценка жизнеспособности макрофагов. Жизнеспособность оценивали через сутки после добавления {Mo₇₂Fe₃₀} или ПД. Старую среду сливали и промывали клетки 2 раза PBS Дюльбекко (DPBS, “ПанЭко”, Россия), рН 7.0–7.1, осмолярность 300 ± 20 мосмоль/кг. Культуры клеток переводили в суспензию путем инкубации в смеси 0.25%-го раствора трипсина с раствором Версена (1:1 при 37° С) в течение 10 мин при 37° С в CO₂-инкубаторе. Далее добавляли питательную среду и повторно суспендировали клетки, аккуратно пипетируя их. Затем клетки центрифугировали при 300 g в течение  5 мин. Надосадочную жидкость сливали, клетки ресуспендировали в DPBS комнатной температуры, чтобы смыть остатки клеточного мусора и белков. Затем этап с центрифугированием и промывкой в DPBS повторяли еще раз.

Далее клетки окрашивали раствором трипанового синего (100 мкл 0.4%-ного трипанового синего на 100 мкл полученной клеточной суспензии). Инкубировали смесь в течение 3 мин при комнатной температуре (Strober, 2015). Считали окрашенные (нежизнеспособные) и неокрашенные (живые) клетки.

Жизнеспособность клеток оценивали согласно международному стандарту ISO 10993-5 и определяли, как отношение числа жизнеспособных клеток аликвоты к общему числу клеток на 1 мл аликвоты. Оценивали среднее значение жизнеспособности по трем параллельным измерениям.

Морфометрическая характеристика макрофагов. В качестве морфометрических показателей определяли площадь клетки и ядра в мкм², а также ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО). Визуализацию осуществляли с помощью оптического микроскопа Olympus BX-51 (Япония), оснащенного флуоресцентным модулем LED ADF FL-LED-BGUV (ADF, Китай) и подключенной к нему монохроматической камерой ADF FLM07 (ADF, Китай) с охладителем Пельтье. Для обработки изображений использовали программное обеспечение камеры ADF Image Capture (http://adfmicroscopy.com/).

Ферментативная активность. В группу ферментов, гидролизирующих эфиры карбоновых кислот, входят неспецифические эстеразы (EC 3.1.1). Ферментативную (секреторную) активность макрофагов оценивали, окрашивая их на неспецифическую α-нафтилацетатэстеразу, характерную для них и их идентификации (Ennist et al., 1983), и определяли цитохимический индекс (ЦХИ) (Hayhoe et al., 1980). Как и другие неспецифические эстеразы, α-нафтилацетатэстераза катализирует реакцию гидролиза производных нафтилацетата (Wang et al., 2021) и, кроме того, участвует в детоксикации эндотоксинов и ксенобиотиков (Terriere, 1984; Zvereva et al., 2003). Для выявления ее активности макрофаги фиксировали в формалине в течение  5 мин. Затем инкубировали при комнатной температуре 30 мин в рабочем растворе, состоящем из  10 мг а-нафтилацетата, растворенного в 1 мл ацетона, 50 мл фосфатного буфера (рН 7.4) и 50 мг прочного синего. Затем клетки промывали в дистиллированной воде 2–3 мин. Докрашивали ядра гематоксилином Карацци (“Диахим-ЦитоСтейн-ГК”; “АБРИС+”, Россия) в течение 5 мин. α-Нафтилацетатэстераза ускоряет гидролизное расщепление α-нафтилацетата до уксусной кислоты и α-нафтола, соединение которого с диазониевой солью образует красно-коричневое окрашивание, нерастворимое в воде.

Подсчет макрофагов проводили под микроскопои ZEISS Primo Star (ZEISS, Германия) с помощью компьютерной программы ToupView 3.7 (http://touptek.com/product/showproduct.php?lang=en&id=103). Активность фермента выявляли по коричнево-черным гранулам в цитоплазме клеток.

Степень активности неспецифической эстеразы оценивали по описанной методике (Hayhoe et al., 1980). Подсчет результатов проводили, используя принцип Астальди (Astaldi et al., 1952; Astaldi et al., 1957). Клетки делили на 3 группы по активности эстеразы: 1-я – площадь, занимаемая гранулами не более  1/3 площади ядра;  2-я – площадь, занимаемая гранулами более  1/3 площади яда, но не более площади всего ядра; 3-я – площадь, занимаемая гранулами более площади ядра. Степень эстеразной активности определяли по формуле:

$\mathrm{ЦХИ}=\frac{\mathrm{B}\times 1\times \mathrm{C}\times 2\times \mathrm{D}\times 3}{\mathrm{N}}$

где В – число клеток с активностью  1; С – с активностью  2; D – с активностью 3; N – общее число посчитанных клеток.

Полученные показатели ЦХИ сравнивали с референсными значениями: для макрофагов ЦХИ в норме составляет 0.94–0.98 (Кост, 1975; Dhingra et al., 1982).

Фагоцитарная активность. Использовали частицы латекса ( 10٪-ная полистирольная суспензия) диаметром  1. 5 мкм (“ПанЭко”, США). Макрофаги делили на три группы: контрольную и 2 опытные – с {Mo₇₂Fe₃₀} и с ПД и культивировали в течение  24 ч. Далее вносили 10 мкл суспензии частиц латекса на  500 мкл полной питательной среды в ٦-луночные планшеты (примерно от 3 50 частиц на 1 клетку). Затем альвеолярные и перитонеальные макрофаги инкубировали с частицами латекса течение  1 ч при 37° С в CO₂-инкубаторе. По окончании питательную среду удаляли и макрофаги окрашивали по Романовскому. Подсчет числа поглощенных частиц латекса осуществляли с помощью светового микроскопа, используя компьютерную программу ADF (Китай, http://adfmicroscopy.com/). Определяли фагоцитарное число (ФЧ) − среднее число частиц, поглощенных одним макрофагом (Sharma et al., 2014).

Полученные данные анализировали с помощью программы STATISTICA. 10 и Microsoft Excel. Вычисляли среднее арифметическое значение, ошибку среднего (SE) и стандартное отклонение (σ). Использовали непараметрический критерий Манна–Уитни для определения значимости разницы в опытных группах по сравнению с контролем. Различия считали достоверными при Р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Жизнеспособность макрофагов. В контрольной группе жизнеспособность перитонеальных и альвеолярных макрофагов по трeм параллельным измерениям составила 94.7 ± 3.9 и 93.2 ± 3.8% соответственно. При культивировании клеток с {Mo₇₂Fe₃₀} или с ПД в течение  24 часов статистически значимых различий показателей жизнеспособности не было (табл.  1).

 

Таблица  1. Влияние {Mo₇₂Fe₃₀} и продуктов его деструкции (ПД) на жизнеспособность и морфометрические характеристики макрофагов

Макрофаги	Контроль	ПОМ	ПД
Жизнеспособность, ٪
Перитонеальные	94.7 ± 3.9	94.1 ± 4.4	93.1 ± 3.8
Альвеолярные	93.2 ± 3.8	94.2 ±  2.٦	94.6 ± 3.4
Площадь клетки, мкм2
Перитонеальные	285.3 ± 7. 1	307.3 ± 8. 2	281.7 ± 3.٦
Альвеолярные	246.8 ± 8.3	260.7 ± ٦.0	241.6 ± ٦.٩
Площадь ядра, мкм2
Перитонеальные	74.8 ± 4.3	73.7 ±  5.7	71.2 ±  2.٦
Альвеолярные	246.8 ± 8.3	260.7 ± ٦.0	241.6 ± ٦.٩
ЯЦО
Перитонеальные	0.35 ± 0.0 2	0.32 ± 0.0 1	0.34 ± 0.0 1
Альвеолярные	0.45 ± 0.0 1	0.47 ± 0.0 2	0.52 ± 0.0 1
ЦХИ, усл. ед.
Перитонеальные	0.93 ± 0.02	0.88 ± 0.07	0.92 ± 0.05
Альвеолярные	0.98 ± 0.02	0.98 ± 0.02	0.95 ± 0.03
ФЧ, усл. ед.
Перитонеальные	72.9 ± 3.9	55.9* ± 4.1	65.8 ± 2.0
Альвеолярные	70.8 ± 4.5	45.6* ± 3.٦	42.0* ± 3.4

Примечание к табл.  1 и  2. Показаны средние значения и их ошибки.

* – Различие с контролем достоверно при Р < 0.05.

 

Морфологическая и морфометрическая характеристика макрофагов. Морфометрический анализ перитонеальных макрофагов позволил выявить следующие закономерности: перитонеальные макрофаги контрольной группы представлены клетками округлой формы с округлым или бобовидным ядром, расположенным на периферии, что свидетельствует о нормальной морфологии изучаемых клеточных культур. При культивировании перитонеальных макрофагов с {Mo₇₂Fe₃₀} или с ПД в течение  24 часов изменения формы клеток и ядер не наблюдали.

Статистически значимых различий морфометрических показателей между контрольной группой и группой макрофагов с ПД или с {Mo₇₂Fe₃₀} обнаружено не было (табл.  1). Однако отмечали тенденцию к увеличению площади клеток при культивировании их с {Mo₇₂Fe₃₀}. Статистически значимых различий площадей ядер и величин ЯЦО при культивировании с {Mo₇₂Fe₃₀} или ПД нет (табл.  1). Не наблюдали и изменения формы клеток и ядер.

Активность неспецифической эстеразы. Показатели ЦХИ α-нафтилацетатэстеразы перитонеальных и альвеолярных макрофагов находятся в пределах референсных значений и согласуются с данными литературы (Кост, 1975; Dhingra et al., 1982). В контрольной группе ЦХИ составил 0.93 ± 0.02 и 0.98 ± 0.02 для перитонеальных и альвеолярных макрофагов соответственно. Статистически значимых отличий от ЦХИ клеток, культивируемых с ПД или {Mo₇₂Fe₃₀} в течение суток не обнаружено (см. табл.  1).

Таким образом, как {Mo₇₂Fe₃₀}, так и ПД не влияют на активность α-нафтилацетатэстеразы. Следовательно, можно предположить, что процесс детоксикации эндотоксинов и ксенобиотиков (Terriere, 1984; Zvereva et al., 2003), осуществляемый макрофагами благодаря наличию в клетках неспецифических эстераз (в том числе α-нафтилацетатэстеразы) не нарушается при их взаимодействии с ПОМ.

Фагоцитарная активность. У перитонеальных и альвеолярных макрофагов контрольной группы значение ФЧ (фагоцитирование латексных частиц) составило соответственно 72.9 ± 3.9 и 70.8 ± 4.5. В группах макрофагов обоих видов, культивируемых с {Mo₇₂Fe₃₀} в течение  24 часов, ФЧ значимо уменьшилось. Разница фагоцитарной активности показана на рис.  1. При культивировании с ПД (в течение суток) статистически значимых различий не наблюдали (табл.  1).

 

Рис. 1. Фагоцитоз латексных частиц перитонеальными (а, б) и альвеолярными (в, г) макрофагами. а, в – в контроле; б, г – после действия {Mo72Fe30}.

 

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о снижении фагоцитарной активности макрофагов при их культивировании с {Mo₇₂Fe₃₀}. Можно предположить, что снижение фагоцитоза обусловлено поляризацией макрофагов с последующей сменой фенотипа. Макрофаги разных фенотипов отличаются друг от друга функциональной активностью, в том числе и фагоцитарной. Имеются данные о том, что макрофаги М2 активнее фагоцитируют латексные шарики, чем М 1, которые иммунологически ориентированы на захват бактерий и вирусов (Stangel et al., 2000; Yunna et al., 2020).

Фенотипические маркеры макрофагов. Принадлежность полученных клеток к популяции резидентных тканевых макрофагов оценивали по экспрессии специфического маркера F4/80 (является частью семейства EGF-TM7). Клетки F4/80⁺ перитонеальных и альвеолярных макрофагов показаны на рисунках  2б и 3б, клетки F4/80^– – на рис. 2a и 3а соответственно. Маркер CD163 определяет дифференцировку макрофагов в противовоспалительный фенотип М 2 (Шарафутдинова и др.,  20 14; Schaer et al., 2006). Перитонеальные макрофаги CD16^– и CD163⁺ продемонстрированы на рис. 2в и 2г, альвеолярные − на рис. 3в и 3г.

 

Рис. 2. Фенотипическое окрашивание перитонеальных макрофагов. а – F4/80–-клетки, б – F4/80+-клетки, в – CD163–-клетки, г – CD163+-клетки.

 

Рис. 3. Фенотипическое окрашивание альвеолярных макрофагов: а – F4/80–-клетки, б – F4/80+-клетки, в – CD163–-клетки, г – CD163+-клетки.

 

Выделенные в первичную культуру перитонеальные макрофаги контрольной группы по своему составу содержали 84.02±3.8% положительно окрашенных на F4/80 клеток, что свидетельствует о высокой чистоте выделенных культур. Доля макрофагов CD163⁺ (маркер М 2 макрофагов) среди клеток, выделенных в первичную культуру, составила 47.06 ± 4.4% для контрольной группы. Культивирование перитонеальных макрофагов с {Mo₇₂Fe₃₀} или с ПД в течение суток не изменило долю F4/80⁺-клеток (табл. 2). Однако доля CD163⁺-макрофагов снизилась в группе клеток, культивируемых с {Mo₇₂Fe₃₀}.

 

Таблица  2. Влияние {Mo₇₂Fe₃₀} и продуктов его деструкции на фенотипические маркеры макрофагов

Макрофаги	Контроль	ПОМ	ПД
Доля F4/80+-клеток, %
Перитонеальные	84.0 ± 3.8	85.0 ± 3.5	86.5 ± 5.2
Альвеолярные	85.5 ± 5.7	91.6 ± 2.5	87.8 ± 2.1
Доля CD163+-клеток. %
Перитонеальные	47.1 ± 4.4	32.7 ± 1.٩*	43.5 ± 2.3
Альвеолярные	49.9 ± 5.2	33.4 ± 2.5*	37.9 ± 3.5*

Примечание. См. табл. 1.

 

В первичной культуре альвеолярные макрофаги контрольной группы содержали 8 5.55 ± ± 5.7% F4/80⁺-клеток и 49.91 ± 5.2% CD163⁺-клеток. Действие {Mo₇₂Fe₃₀} или ПД в течение  24 часов не изменило долю F4/80⁺-клеток (табл.  2), но снижалась доля CD163⁺-макрофагов и перитонеальных, и альвеолярных в случае действия и {Mo₇₂Fe₃₀}, и ПД (табл.  2). Для перитонеальных макрофагов это может свидетельствовать об уменьшении доли макрофагов М 2 в культуре.

Снижение доли CD163⁺-клеток в культуре альвеолярных макрофагов при инкубировании с ПД может объясняться тем, что альвеолярные макрофаги характеризуются высокой чувствительностью к железу, могут приобретать как связанное с трансферрином железо, высвобождаемое альвеолярными эпителиальными клетками, так и вдыхаемое железо в результате воздействия окружающей среды (например, дыма и загрязнения воздуха) (Holian et al., 1990; Corhay et al., 2000). Снижение доли макрофагов М 2 может указывать на возможную поляризацию макрофагов в провоспалительный фенотип М 1. Эти данные согласуются со снижением фагоцитарной активности, поскольку CD163 представляет собой скавенджер-рецептор, повышенная экспрессия которого связана с эндоцитозом (Onofre et al., 2009; Etzerodt et al., 2013). Соответственно, уменьшение экспрессии данного рецептора на поверхности мембраны клетки способствует переходу макрофага от противовоспалительного фенотипа М 2, который наиболее активно поглощает частицы латекса за счет эндоцитоза (фагоцитоза) к провоспалительному М1 (Stangel et al., 2000; Yunna et al., 2020).

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты настоящей работы показали, что {Mo₇₂Fe₃₀} и его ПД не оказывают значимого влияния на жизнеспособность перитонеальных и альвеолярных макрофагов, не приводят к значимому изменению морфологических показателей клетки и активности неспецифической эстеразы (α-нафтилацетатэстеразы), важного компонента системы детоксикации клетки. Таким образом, не обнаружено токсического действия ПОМ на культуры перитонеальных и альвеолярных макрофагов.

В ходе исследования отмечено снижение фагоцитарной активности макрофагов в экспериментальных группах. Мы предположили, что это может быть связано с изменением фенотипа макрофагов, поэтому провели иммуноцитохимическое окрашивание клеток на маркер CD163. Полученные данные продемонстрировали снижение доли CD163⁺-клеток в присутствии {Mo₇₂Fe₃₀}, что согласуется с результатами оценки фагоцитарной активности. В литературе имеются сведения о том, что фагоцитоз именно М 2-макрофагов более эффективен по отношению к латексным шарикам и частицам зимозана по сравнению с фенотипом М 1 (Martinez et al., 2008; Stangel et al., 2000). Стоит отметить также, что поскольку CD 1٦3 представляет собой скавенджер-рецептор, связанный с эндоцитозом (Onofre et al., 2009; Etzerodt et al., 2013), уменьшение его экспрессии на поверхности мембраны способствует переходу макрофага от противовоспалительного фенотипа М 2, который наиболее активно поглощает частицы латекса за счет эндоцитоза (фагоцитоза) к провоспалительному М1 (Stangel et al., 2000; Yunna et al., 2020).

Полученные данные о влиянии {Mo₇₂Fe₃₀} на поляризацию макрофагов в провоспалительный фенотип М 1 делает его еще более перспективным объектом исследования в области онкологии. Кроме того, изучение влияния наночастиц на поляризацию макрофагов, становится важным звеном в понимании механизма действия данных соединений на клетку.

В настоящее время есть примеры изменения поляризации макрофагов с помощью железосодержащих наночастиц. Например, суперпарамагнитные наночастицы оксида железа (SPION), покрытые полиэтиленимином, индуцируют поляризацию М 1, характеризующуюся заметной апрегуляцией типичных генов, связанных с М 1, таких как CD80, IL- 1β, TNF-α (Mulens-Arias et al., 2015). Поскольку макрофаги вносят вклад в опухолевое иммунное микрокружение, их взаимодействие с наночастицами оксида железа может определять тераностичный результат и предоставлять важный инструмент для перепрограммирования фенотипа опухолеассоциированных макрофагов (Mulens-Arias et al., 2021).

В настоящее время необходим поиск стратегий, способных усилить действие существующих лекарств за счет разработки новых терапевтических подходов. Лекарственные препараты могут быть конъюгированы с наночастицами с целью повышения их фармакологического действия или придания им новых специфических свойств. Например, лечение только доксорубицином снижало секрецию макрофагами ФНО-α − важного цитокина, который активирует специфические рецепторы, определяющие раковую клетку, блокирует дальнейшее деление клетки и способствует ее гибели (Reichel et al., 2019). Аналогичным образом ФНО-α воздействует на клетки, инфицированные вирусами и другими патогенами. Наночастицы оксида цинка незначительно увеличивали секрецию ФНО-α макрофагами. В отличие от предыдущих групп, комплекс ZnO-доксорубицин значимо увеличивал секрецию ФНО-α макрофагами, а также секрецию IL-٦ − еще одного важного провоспалительного цитокина (Reichel et al., 2019). Макрофаги, обработанные ZnO-доксорубицином, демонстрировали повышенную экспрессию CD80, CD8٦ и MHCII по сравнению с наночастицами оксида цинка или свободным доксорубицином (Reichel et al., 2019).

Как показали исследования, проведенные в последние десятилетия, ПОМ обладают перспективной биологической активностью, в том числе противоопухолевой и противоинфекционной благодаря своей особой структуре и свойствам (Wang, 2022). Их высокая биосовместимость, структурная стабильность и модифицируемость предоставляют широкие возможности для исследований в области диагностики и лечения рака.

Иммунотерапия антигенпрезентирующими клетками инициирует мощный Т-клеточный ответ при онкологических, вирусных и инфекционных заболеваниях (Masson et al., 2008; Gardner et al., 2020). Использование аутологичных макрофагальных вакцин в клинических испытаниях представляет собой индивидуальную форму клеточной терапии, требующей генерации макрофагов типа М 2 или М 1 в зависимости от вида и тяжести заболевания.

Таким образом, исследуемый нами ПОМ {Mo₇₂Fe₃₀} может представлять большой интерес для биомедицины и онкологии. Предполагаемая способность обеспечивать поляризацию макрофагов делает его интересным объектом для онкологических исследований. Мы показали, что исследованный ПОМ {Mo₇₂Fe₃₀} эффективно поляризуют макрофаги в направлении фенотипа М 1. В дальнейшем мы планируем использовать ПОМ для стимуляции образования М 1-макрофагов и возможного использования полученной культуры в экспериментальных моделях ряда онкологических и воспалительных заболеваний.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена с использованием оборудования центра коллективного пользования ИИФ УрО РАН.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена за счет при финансовой поддержке в рамках государственного задания по науке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (проект № 123031300049-8), а также в рамках госзадания Института иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН (№ 122020900136-4) и Программы развития Уральского федерального университета имени первого Президента России Б.Н. Ельцина в соответствии с программой стратегического академического лидерства «Приоритет- 2030».

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с животными проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (http://oacu.od.nih.gov/regs/index.htm). Протоколы с использованием животных были одобрены одобрены этическим комитетом Института иммунологии и физиологии УрО РАН, протокол № 07/19 от 18.12.2019.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

S. A. Titova

Ural Federal University named after the First President of Russia B. N. Yeltsin

Author for correspondence.
Email: svetattitova12021998@gmail.com
Russian Federation, Ekaterinburg

M. O. Tonkushina

Ural Federal University named after the First President of Russia B. N. Yeltsin

Email: svetattitova12021998@gmail.com
Russian Federation, Ekaterinburg

K. V. Grzhegorzhevskii

Ural Federal University named after the First President of Russia B. N. Yeltsin

Email: svetattitova12021998@gmail.com
Russian Federation, Ekaterinburg

I. G. Danilova

Ural Federal University named after the First President of Russia B. N. Yeltsin; Institute of Immunology and Physiology, Urals Branch, Russian Academy of Sciences

Email: svetattitova12021998@gmail.com
Russian Federation, Ekaterinburg; Ekaterinburg

V. A. Pozdina

Institute of Immunology and Physiology, Urals Branch, Russian Academy of Sciences

Email: svetattitova12021998@gmail.com
Russian Federation, Ekaterinburg

M. V. Ulitko

Ural Federal University named after the First President of Russia B. N. Yeltsin

Email: svetattitova12021998@gmail.com
Russian Federation, Ekaterinburg

A. A. Ostroushko

Ural Federal University named after the First President of Russia B. N. Yeltsin

Email: svetattitova12021998@gmail.com
Russian Federation, Ekaterinburg

References

Supplementary files