Влияние нанокластерного полиоксометаллата {мo72fe30} на морфофункциональное состояние макрофагов в культуре

Полный текст

Макрофаги представляют собой пластичные и гетерогенные иммунные клетки (Taylor et al., 2005). Они присутствуют практически во всех тканях, участвуют в распознавании, фагоцитозе и деградации клеточного мусора и патогенов (Rogler, 2017). Они играют важную роль в презентации антигенов Т-клеткам, а также в индукции экспрессии костимулирующих молекул на других типах антигенпрезентирующих клеток, что инициирует адаптивный иммунный ответ (Jackson, 2016). Кроме того, макрофаги задействованы в инициации воспаления путем высвобождения цитокинов и хемокинов, которые, в свою очередь, привлекают другие иммунные клетки к очагам воспаления (Duan, 2016).

В зависимости от того, какие цитокины, факторы роста, эффекторные молекулы секретируют макрофаги, их традиционно подразделяют на классически и альтернативно активированные (М 1 и М 2 соответственно). Именно пластичность макрофагов, способность менять фенотип и функциональную активность в зависимости от характера микроокружения делает эти клетки чрезвычайно привлекательными при разработке лекарственных средств.

Макрофаги играют решающую роль в распознавании, обработке и клиренсе чужеродных частиц, в том числе наночастиц (Dobrovolskaia et al., 2007). Между тем наночастицы могут направлять макрофаги к различным поляризационным состояниям в качестве стимула микроокружения (Lucarelli et al., 2004; Bartneck et al., 2012; Laskar et al., 2013). Перепрограммирование макрофагов с фенотипа М1 на фенотип М2 может быть использовано для лечения хронических воспалительных заболеваний (Liu et al., 2014). Фенотипический сдвиг макрофагов М2 в сторону подтипа М1 полезен на ранних фазах воспаления и иммунотерапии рака (Su et al., 2015).

Адресная доставка лекарственных препаратов с использованием наночастиц для повышения безопасности и терапевтической эффективности инкапсулированных лекарственных средств относится к одному из интенсивно развивающихся направлений нанотехнологии (Caruthers et al., 2007; Dutta, 2007). Более глубокое понимание влияния наночастиц на поляризацию макрофагов имеет важное значение для модуляции биологических эффектов in vivo и разработки методов лечения, основанных на использовании наночастиц.

Соединения, известные как нанокластерные полиоксометаллаты с кеплератной структурой (ПОМ) впервые были синтезированы под руководством Мюллера (Müller et al., 1998, 1999). Представители этого класса привлекают внимание высокосимметричной структурой молекул сферической формы и размерами порядка нескольких нанометров. ПОМ обладают рядом интересных свойств, которые делают их перспективными для использования в качестве наночастиц для адресной доставки лекарств (Ostroushko et al., 2021). Нанокластерные, а также более простые ПОМ обладают собственной биологической активностью (Yamase, 2013; Bijelic et al., 2019). Многие ПОМ содержат молибден в двух степенях окисления (+5 и +6); присутствие пятивалентного молибдена обуславливает их токсическое действие. ПОМ {Mo₇₂Fe₃₀}, содержащий молибден только в высшей степени окисления (Mo⁺⁶), представляется нам наиболее перспективным представителем данного класса соединений в качестве основы средства адресной доставки. Обладая размером молекулы 2.5 нм, растворимый в воде, {Mo₇₂Fe₃₀} способен разлагаться в средах организма на более простые соединения молибдена и железа (Остроушко и др., 2011), которые в дальнейшем включаются в естественные для организма процессы метаболизма.

{Mo₇₂Fe₃₀} состоит из кислородных полиэдров молибдена и железа, стабилизированных ацетатными и водными лигандами, имеет внутреннюю полость (Müller et al., 1999) и способен связывать лекарственные препараты, флуоресцентные метки, биосовместимые полимеры, белки (Grzhegorzhevskii et al., 2023; Ostroushko et al., 2018; Tonkushina et al., 2022) и осуществлять движение под действием слабых электрических полей, в частности, при чрезкожном ионофорезе (Ostroushko et al., 2021). Ранее нами было продемонстрировано пролонгированное высвобождение противоопухолевого лекарственного препарата из комплекса с {Mo₇₂Fe₃₀} в эксперименте, моделирующем высвобождение препарата в крови (Tonkushina et al., 2022). Формула соединения:

[Mo₇₂Fe₃₀O₂₅₂(CH₃COO)₁₂{Mo₂O₇(H₂O)}₂ {H₂Mo₂O₈(H₂O)}(H₂O)₉₁] · ≈150H₂O.

Однако исследований действия этого ПОМ на культуру макрофагов, а также возможности их перепрограммирования при действии ПОМ ранее не проводили.

Цель настоящей работы заключалась в оценке влияния {Мо₇₂Fe₃₀} на культуру макрофагов, а также изучение возможности поляризации клеток при действии этого ПОМ. Оценивали влияние {Мо₇₂Fe₃₀} на морфологию, жизнеспособность, фагоцитарную активность и активность α-нафтилацетатэстеразы (специфического фермента моноцитов/макрофагов), а также на фенотип перитонеальных и альвеолярных макрофагов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

ПОМ кеплератного типа {Mo₇₂Fe₃₀} для проведения исследований был синтезирован с использованием отработанной двухстадийной методики (Müller et al., 1998, 1999). При культивировании клеток с {Mo₇₂Fe₃₀} его вводили в дозе  100 мкл (водного раствора в концентрации 2.0 г/л) на ٩00 мкл питательной среды. Доза была отработана в предыдущих исследованиях (Остроушко и др.,  20 18). Так как {Mo₇₂Fe₃₀} в питательной среде постепенно деструктирует на более простые молибден и железосодержащие ионы, использовали и продукты деструкции ПОМ (ПД) в качестве образцов сравнения для выявления влияния непосредственно нанокластерной структуры {Mo₇₂Fe₃₀}. ПД получали кипячением раствора {Mo₇₂Fe₃₀} в концентрации  2.0 г/л в течение 3 ч и также вводили в дозе  100 мкл раствора на ٩00 мкл питательной среды. {Mo₇₂Fe₃₀} устойчив до температуры ~70° C, и кипячение водного раствора позволяет гарантировать его деструкцию до более простых ионов молибдена и железа.

Животные. В работе использовали популяции макрофагов различной тканевой принадлежности (альвеолярные и перитонеальные), полученные из самцов крыс трехмесячного возраста породы Wistar. Условия содержания и обращение с используемыми в эксперименте животными соответствовали рекомендациям международных этических комитетов (директива Совета ЕС 2010/63/EU).

Выделение и культивирование макрофагов. Для выделения перитонеальных макрофагов вводили внутрибрюшинно  5 мл ледяного раствора Хэнкса, содержащего 100 ЕД пенициллина и  100 мкг стрептомицина на 1 мл (Li et al., 2012). Выполняли легкий массаж брюшной полости, а затем осторожно собирали жидкость. Полученную перитонеальную жидкость центрифугировали при  2 50 g в течение  10 мин. Клетки промывали раствором Хэнкса и повторно центрифугировали. Надосадочную жидкость сливали, а клеточный осадок ресуспендировали в  5 мл полной питательной среды и разливали по  500 мкл на покровные стекла, уложенные в ٦-луночный планшет, и оставляли для прикрепления в течение ٦0 мин в инкубаторе при 37° С,  5٪ CO₂ и ٩ 5٪ воздуха.

Для приготовления полной питательной среды использовали культуральную среду RPMI- 1٦40 (٩0٪ от общего объема) (“Биолот”, Россия), эмбриональную телячью сыворотку FBS (“Биолот”, Россия) (10% от общего объема среды), и гентамицин в концентрации 10 мкг/мл.

Альвеолярные макрофаги получали из бронхоальвеолярной жидкости методом альвеолярного лаважа тeплым раствором Хэнкса в объeме 3–4 мл, подогретым до температуры тела (36–37° С) (Wiggins, 1991). Полученную лаважную жидкость легких центрифугировали при  2 50 g в течение  10 мин. Клетки промывали раствором Хэнка и центрифугировали. Надосадочную жидкость сливали, а клеточный осадок ресуспендировали в  5 мл полной питательной среды и разливали по  500 мкл на покровные стекла, уложенные в ٦-луночный планшет и оставляли для прикрепления в течение ٦0 мин в инкубаторе при 37° С,  5٪ CO₂ и ٩ 5٪ воздуха.

За это время макрофаги прикреплялись к культуральной поверхности. По истечении 1 ч среду с не прикрепившимися клетками сливали, лунки промывали раствором Хенкса, после чего вновь заливали нужный объем питательной культуральной среды. Далее клетки культивировали при 37° С в СО₂-инкубаторе в атмосфере 5% СO₂ и 95% воздуха.

Определение фенотипических маркеров макрофагов. Фенотип полученных клеток оценивали методом иммуноцитохимического окрашивания. В качестве фенотипического маркера использовали маркер F4/80, который позволяет определить дифференцировку клеток в макрофаги (McKnight et al., 1996; Dos Anjos Cassado, 2017; Khazen et al., 2005). По маркеру CD163 определяли дифференцировку макрофагов в противовоспалительный фенотип М 2 (Schaer et al., 2006; Шарафутдинова и др.,  20 14). При связывании моноклонального антитела к CD163 с соответствующим гликопротеином клеток наблюдается диффузное окрашивание мембран и цитоплазмы макрофагов М 2 (Hu et al., 2017). Кроме того, этот маркер представляет собой скавенджер-рецептор, повышенная экспрессия которого связана с активацией эндоцитоза (Onofre et al., 2009; Etzerodt et al., 2013). Исследование проводили через  24 ч после культивирования макрофагов с {Mo₇₂Fe₃₀} или ПД в CO₂-инкубаторе. Для идентификации вышеперечисленных маркеров применяли непрямой пероксидазный метод окрашивания. Процедура окрашивания одинакова для всех идентифицируемых антигенов.

Покровные стeкла фиксировали в  10٪-ном формалине. После высушивания их подвергали депарафинизации, дегидратации и промывке в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем Tween 20 (PanReac AppliChem GmbH, Германия), pH 7.6. Фиксация в формалине может приводить к изменению трехмерной структуры белков. При этом может происходить модификация антигенных эпитопов и изменение электростатического взаимодействия, что приводит к невозможности взаимодействия эпитопа антигена с паратопом антитела. Поэтому, до нанесения первичных антител проводили демаскировку эпитопов протеазами.

Для минимизации фонового окрашивания проводили блокировку активности эндогенной пероксидазы путeм нанесения на срезы 3٪-ного раствора пероксида водорода, последующей промывки и нанесения на 30 мин протеинового блока на основе бычьего сывороточного альбумина.

Следующий этап включал инкубацию с первичными антителами в течение ٦0 мин при 37° С. Несвязавшиеся реагенты отмывали в буфере PBS + Tween 20 (3 раза по 5 мин) и после проводили инкубацию с вторичными антителами в течение 60 мин при 37° С, затем повторяли промывку в то же буфере.

Для визуализации антигенреактивных клеток использовали хромогенный субстрат 3,3-диаминобензидин (DAB) в забуференном растворе. DAB-позитивные клетки идентифицировали по коричневому окрашиванию. После окрашивания покровные стекла промывали в дистиллированной воде  5 мин, окрашивали гематоксилином и промывали в водопроводной воде  5 мин. На стеклах подсчитывали общее число клеток и число клеток, положительно окрашенных соответствующим антителом.

Влияние ПОМ. Полученные культуры перитонеальных и альвеолярных макрофагов делили на три группы: нестимулированные (контроль), стимулированные макрофаги, к которым через 24 ч культивирования в CO₂-инкубаторе добавляли {Mo₇₂Fe₃₀} или ПД и продолжали культивировать еще 24 ч.

Оценка жизнеспособности макрофагов. Жизнеспособность оценивали через сутки после добавления {Mo₇₂Fe₃₀} или ПД. Старую среду сливали и промывали клетки 2 раза PBS Дюльбекко (DPBS, “ПанЭко”, Россия), рН 7.0–7.1, осмолярность 300 ± 20 мосмоль/кг. Культуры клеток переводили в суспензию путем инкубации в смеси 0.25%-го раствора трипсина с раствором Версена (1:1 при 37° С) в течение 10 мин при 37° С в CO₂-инкубаторе. Далее добавляли питательную среду и повторно суспендировали клетки, аккуратно пипетируя их. Затем клетки центрифугировали при 300 g в течение  5 мин. Надосадочную жидкость сливали, клетки ресуспендировали в DPBS комнатной температуры, чтобы смыть остатки клеточного мусора и белков. Затем этап с центрифугированием и промывкой в DPBS повторяли еще раз.

Далее клетки окрашивали раствором трипанового синего (100 мкл 0.4%-ного трипанового синего на 100 мкл полученной клеточной суспензии). Инкубировали смесь в течение 3 мин при комнатной температуре (Strober, 2015). Считали окрашенные (нежизнеспособные) и неокрашенные (живые) клетки.

Жизнеспособность клеток оценивали согласно международному стандарту ISO 10993-5 и определяли, как отношение числа жизнеспособных клеток аликвоты к общему числу клеток на 1 мл аликвоты. Оценивали среднее значение жизнеспособности по трем параллельным измерениям.

Морфометрическая характеристика макрофагов. В качестве морфометрических показателей определяли площадь клетки и ядра в мкм², а также ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО). Визуализацию осуществляли с помощью оптического микроскопа Olympus BX-51 (Япония), оснащенного флуоресцентным модулем LED ADF FL-LED-BGUV (ADF, Китай) и подключенной к нему монохроматической камерой ADF FLM07 (ADF, Китай) с охладителем Пельтье. Для обработки изображений использовали программное обеспечение камеры ADF Image Capture (http://adfmicroscopy.com/).

Ферментативная активность. В группу ферментов, гидролизирующих эфиры карбоновых кислот, входят неспецифические эстеразы (EC 3.1.1). Ферментативную (секреторную) активность макрофагов оценивали, окрашивая их на неспецифическую α-нафтилацетатэстеразу, характерную для них и их идентификации (Ennist et al., 1983), и определяли цитохимический индекс (ЦХИ) (Hayhoe et al., 1980). Как и другие неспецифические эстеразы, α-нафтилацетатэстераза катализирует реакцию гидролиза производных нафтилацетата (Wang et al., 2021) и, кроме того, участвует в детоксикации эндотоксинов и ксенобиотиков (Terriere, 1984; Zvereva et al., 2003). Для выявления ее активности макрофаги фиксировали в формалине в течение  5 мин. Затем инкубировали при комнатной температуре 30 мин в рабочем растворе, состоящем из  10 мг а-нафтилацетата, растворенного в 1 мл ацетона, 50 мл фосфатного буфера (рН 7.4) и 50 мг прочного синего. Затем клетки промывали в дистиллированной воде 2–3 мин. Докрашивали ядра гематоксилином Карацци (“Диахим-ЦитоСтейн-ГК”; “АБРИС+”, Россия) в течение 5 мин. α-Нафтилацетатэстераза ускоряет гидролизное расщепление α-нафтилацетата до уксусной кислоты и α-нафтола, соединение которого с диазониевой солью образует красно-коричневое окрашивание, нерастворимое в воде.

Подсчет макрофагов проводили под микроскопои ZEISS Primo Star (ZEISS, Германия) с помощью компьютерной программы ToupView 3.7 (http://touptek.com/product/showproduct.php?lang=en&id=103). Активность фермента выявляли по коричнево-черным гранулам в цитоплазме клеток.

Степень активности неспецифической эстеразы оценивали по описанной методике (Hayhoe et al., 1980). Подсчет результатов проводили, используя принцип Астальди (Astaldi et al., 1952; Astaldi et al., 1957). Клетки делили на 3 группы по активности эстеразы: 1-я – площадь, занимаемая гранулами не более  1/3 площади ядра;  2-я – площадь, занимаемая гранулами более  1/3 площади яда, но не более площади всего ядра; 3-я – площадь, занимаемая гранулами более площади ядра. Степень эстеразной активности определяли по формуле:

$\mathrm{ЦХИ}=\frac{\mathrm{B}\times 1\times \mathrm{C}\times 2\times \mathrm{D}\times 3}{\mathrm{N}}$

где В – число клеток с активностью  1; С – с активностью  2; D – с активностью 3; N – общее число посчитанных клеток.

Полученные показатели ЦХИ сравнивали с референсными значениями: для макрофагов ЦХИ в норме составляет 0.94–0.98 (Кост, 1975; Dhingra et al., 1982).

Фагоцитарная активность. Использовали частицы латекса ( 10٪-ная полистирольная суспензия) диаметром  1. 5 мкм (“ПанЭко”, США). Макрофаги делили на три группы: контрольную и 2 опытные – с {Mo₇₂Fe₃₀} и с ПД и культивировали в течение  24 ч. Далее вносили 10 мкл суспензии частиц латекса на  500 мкл полной питательной среды в ٦-луночные планшеты (примерно от 3 50 частиц на 1 клетку). Затем альвеолярные и перитонеальные макрофаги инкубировали с частицами латекса течение  1 ч при 37° С в CO₂-инкубаторе. По окончании питательную среду удаляли и макрофаги окрашивали по Романовскому. Подсчет числа поглощенных частиц латекса осуществляли с помощью светового микроскопа, используя компьютерную программу ADF (Китай, http://adfmicroscopy.com/). Определяли фагоцитарное число (ФЧ) − среднее число частиц, поглощенных одним макрофагом (Sharma et al., 2014).

Полученные данные анализировали с помощью программы STATISTICA. 10 и Microsoft Excel. Вычисляли среднее арифметическое значение, ошибку среднего (SE) и стандартное отклонение (σ). Использовали непараметрический критерий Манна–Уитни для определения значимости разницы в опытных группах по сравнению с контролем. Различия считали достоверными при Р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Жизнеспособность макрофагов. В контрольной группе жизнеспособность перитонеальных и альвеолярных макрофагов по трeм параллельным измерениям составила 94.7 ± 3.9 и 93.2 ± 3.8% соответственно. При культивировании клеток с {Mo₇₂Fe₃₀} или с ПД в течение  24 часов статистически значимых различий показателей жизнеспособности не было (табл.  1).

 

Таблица  1. Влияние {Mo₇₂Fe₃₀} и продуктов его деструкции (ПД) на жизнеспособность и морфометрические характеристики макрофагов

Макрофаги	Контроль	ПОМ	ПД
Жизнеспособность, ٪
Перитонеальные	94.7 ± 3.9	94.1 ± 4.4	93.1 ± 3.8
Альвеолярные	93.2 ± 3.8	94.2 ±  2.٦	94.6 ± 3.4
Площадь клетки, мкм2
Перитонеальные	285.3 ± 7. 1	307.3 ± 8. 2	281.7 ± 3.٦
Альвеолярные	246.8 ± 8.3	260.7 ± ٦.0	241.6 ± ٦.٩
Площадь ядра, мкм2
Перитонеальные	74.8 ± 4.3	73.7 ±  5.7	71.2 ±  2.٦
Альвеолярные	246.8 ± 8.3	260.7 ± ٦.0	241.6 ± ٦.٩
ЯЦО
Перитонеальные	0.35 ± 0.0 2	0.32 ± 0.0 1	0.34 ± 0.0 1
Альвеолярные	0.45 ± 0.0 1	0.47 ± 0.0 2	0.52 ± 0.0 1
ЦХИ, усл. ед.
Перитонеальные	0.93 ± 0.02	0.88 ± 0.07	0.92 ± 0.05
Альвеолярные	0.98 ± 0.02	0.98 ± 0.02	0.95 ± 0.03
ФЧ, усл. ед.
Перитонеальные	72.9 ± 3.9	55.9* ± 4.1	65.8 ± 2.0
Альвеолярные	70.8 ± 4.5	45.6* ± 3.٦	42.0* ± 3.4

Примечание к табл.  1 и  2. Показаны средние значения и их ошибки.

* – Различие с контролем достоверно при Р < 0.05.

 

Морфологическая и морфометрическая характеристика макрофагов. Морфометрический анализ перитонеальных макрофагов позволил выявить следующие закономерности: перитонеальные макрофаги контрольной группы представлены клетками округлой формы с округлым или бобовидным ядром, расположенным на периферии, что свидетельствует о нормальной морфологии изучаемых клеточных культур. При культивировании перитонеальных макрофагов с {Mo₇₂Fe₃₀} или с ПД в течение  24 часов изменения формы клеток и ядер не наблюдали.

Статистически значимых различий морфометрических показателей между контрольной группой и группой макрофагов с ПД или с {Mo₇₂Fe₃₀} обнаружено не было (табл.  1). Однако отмечали тенденцию к увеличению площади клеток при культивировании их с {Mo₇₂Fe₃₀}. Статистически значимых различий площадей ядер и величин ЯЦО при культивировании с {Mo₇₂Fe₃₀} или ПД нет (табл.  1). Не наблюдали и изменения формы клеток и ядер.

Активность неспецифической эстеразы. Показатели ЦХИ α-нафтилацетатэстеразы перитонеальных и альвеолярных макрофагов находятся в пределах референсных значений и согласуются с данными литературы (Кост, 1975; Dhingra et al., 1982). В контрольной группе ЦХИ составил 0.93 ± 0.02 и 0.98 ± 0.02 для перитонеальных и альвеолярных макрофагов соответственно. Статистически значимых отличий от ЦХИ клеток, культивируемых с ПД или {Mo₇₂Fe₃₀} в течение суток не обнаружено (см. табл.  1).

Таким образом, как {Mo₇₂Fe₃₀}, так и ПД не влияют на активность α-нафтилацетатэстеразы. Следовательно, можно предположить, что процесс детоксикации эндотоксинов и ксенобиотиков (Terriere, 1984; Zvereva et al., 2003), осуществляемый макрофагами благодаря наличию в клетках неспецифических эстераз (в том числе α-нафтилацетатэстеразы) не нарушается при их взаимодействии с ПОМ.

Фагоцитарная активность. У перитонеальных и альвеолярных макрофагов контрольной группы значение ФЧ (фагоцитирование латексных частиц) составило соответственно 72.9 ± 3.9 и 70.8 ± 4.5. В группах макрофагов обоих видов, культивируемых с {Mo₇₂Fe₃₀} в течение  24 часов, ФЧ значимо уменьшилось. Разница фагоцитарной активности показана на рис.  1. При культивировании с ПД (в течение суток) статистически значимых различий не наблюдали (табл.  1).

 

Рис. 1. Фагоцитоз латексных частиц перитонеальными (а, б) и альвеолярными (в, г) макрофагами. а, в – в контроле; б, г – после действия {Mo72Fe30}.

 

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о снижении фагоцитарной активности макрофагов при их культивировании с {Mo₇₂Fe₃₀}. Можно предположить, что снижение фагоцитоза обусловлено поляризацией макрофагов с последующей сменой фенотипа. Макрофаги разных фенотипов отличаются друг от друга функциональной активностью, в том числе и фагоцитарной. Имеются данные о том, что макрофаги М2 активнее фагоцитируют латексные шарики, чем М 1, которые иммунологически ориентированы на захват бактерий и вирусов (Stangel et al., 2000; Yunna et al., 2020).

Фенотипические маркеры макрофагов. Принадлежность полученных клеток к популяции резидентных тканевых макрофагов оценивали по экспрессии специфического маркера F4/80 (является частью семейства EGF-TM7). Клетки F4/80⁺ перитонеальных и альвеолярных макрофагов показаны на рисунках  2б и 3б, клетки F4/80^– – на рис. 2a и 3а соответственно. Маркер CD163 определяет дифференцировку макрофагов в противовоспалительный фенотип М 2 (Шарафутдинова и др.,  20 14; Schaer et al., 2006). Перитонеальные макрофаги CD16^– и CD163⁺ продемонстрированы на рис. 2в и 2г, альвеолярные − на рис. 3в и 3г.

 

Рис. 2. Фенотипическое окрашивание перитонеальных макрофагов. а – F4/80–-клетки, б – F4/80+-клетки, в – CD163–-клетки, г – CD163+-клетки.

 

Рис. 3. Фенотипическое окрашивание альвеолярных макрофагов: а – F4/80–-клетки, б – F4/80+-клетки, в – CD163–-клетки, г – CD163+-клетки.

 

Выделенные в первичную культуру перитонеальные макрофаги контрольной группы по своему составу содержали 84.02±3.8% положительно окрашенных на F4/80 клеток, что свидетельствует о высокой чистоте выделенных культур. Доля макрофагов CD163⁺ (маркер М 2 макрофагов) среди клеток, выделенных в первичную культуру, составила 47.06 ± 4.4% для контрольной группы. Культивирование перитонеальных макрофагов с {Mo₇₂Fe₃₀} или с ПД в течение суток не изменило долю F4/80⁺-клеток (табл. 2). Однако доля CD163⁺-макрофагов снизилась в группе клеток, культивируемых с {Mo₇₂Fe₃₀}.

 

Таблица  2. Влияние {Mo₇₂Fe₃₀} и продуктов его деструкции на фенотипические маркеры макрофагов

Макрофаги	Контроль	ПОМ	ПД
Доля F4/80+-клеток, %
Перитонеальные	84.0 ± 3.8	85.0 ± 3.5	86.5 ± 5.2
Альвеолярные	85.5 ± 5.7	91.6 ± 2.5	87.8 ± 2.1
Доля CD163+-клеток. %
Перитонеальные	47.1 ± 4.4	32.7 ± 1.٩*	43.5 ± 2.3
Альвеолярные	49.9 ± 5.2	33.4 ± 2.5*	37.9 ± 3.5*

Примечание. См. табл. 1.

 

В первичной культуре альвеолярные макрофаги контрольной группы содержали 8 5.55 ± ± 5.7% F4/80⁺-клеток и 49.91 ± 5.2% CD163⁺-клеток. Действие {Mo₇₂Fe₃₀} или ПД в течение  24 часов не изменило долю F4/80⁺-клеток (табл.  2), но снижалась доля CD163⁺-макрофагов и перитонеальных, и альвеолярных в случае действия и {Mo₇₂Fe₃₀}, и ПД (табл.  2). Для перитонеальных макрофагов это может свидетельствовать об уменьшении доли макрофагов М 2 в культуре.

Снижение доли CD163⁺-клеток в культуре альвеолярных макрофагов при инкубировании с ПД может объясняться тем, что альвеолярные макрофаги характеризуются высокой чувствительностью к железу, могут приобретать как связанное с трансферрином железо, высвобождаемое альвеолярными эпителиальными клетками, так и вдыхаемое железо в результате воздействия окружающей среды (например, дыма и загрязнения воздуха) (Holian et al., 1990; Corhay et al., 2000). Снижение доли макрофагов М 2 может указывать на возможную поляризацию макрофагов в провоспалительный фенотип М 1. Эти данные согласуются со снижением фагоцитарной активности, поскольку CD163 представляет собой скавенджер-рецептор, повышенная экспрессия которого связана с эндоцитозом (Onofre et al., 2009; Etzerodt et al., 2013). Соответственно, уменьшение экспрессии данного рецептора на поверхности мембраны клетки способствует переходу макрофага от противовоспалительного фенотипа М 2, который наиболее активно поглощает частицы латекса за счет эндоцитоза (фагоцитоза) к провоспалительному М1 (Stangel et al., 2000; Yunna et al., 2020).

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты настоящей работы показали, что {Mo₇₂Fe₃₀} и его ПД не оказывают значимого влияния на жизнеспособность перитонеальных и альвеолярных макрофагов, не приводят к значимому изменению морфологических показателей клетки и активности неспецифической эстеразы (α-нафтилацетатэстеразы), важного компонента системы детоксикации клетки. Таким образом, не обнаружено токсического действия ПОМ на культуры перитонеальных и альвеолярных макрофагов.

В ходе исследования отмечено снижение фагоцитарной активности макрофагов в экспериментальных группах. Мы предположили, что это может быть связано с изменением фенотипа макрофагов, поэтому провели иммуноцитохимическое окрашивание клеток на маркер CD163. Полученные данные продемонстрировали снижение доли CD163⁺-клеток в присутствии {Mo₇₂Fe₃₀}, что согласуется с результатами оценки фагоцитарной активности. В литературе имеются сведения о том, что фагоцитоз именно М 2-макрофагов более эффективен по отношению к латексным шарикам и частицам зимозана по сравнению с фенотипом М 1 (Martinez et al., 2008; Stangel et al., 2000). Стоит отметить также, что поскольку CD 1٦3 представляет собой скавенджер-рецептор, связанный с эндоцитозом (Onofre et al., 2009; Etzerodt et al., 2013), уменьшение его экспрессии на поверхности мембраны способствует переходу макрофага от противовоспалительного фенотипа М 2, который наиболее активно поглощает частицы латекса за счет эндоцитоза (фагоцитоза) к провоспалительному М1 (Stangel et al., 2000; Yunna et al., 2020).

Полученные данные о влиянии {Mo₇₂Fe₃₀} на поляризацию макрофагов в провоспалительный фенотип М 1 делает его еще более перспективным объектом исследования в области онкологии. Кроме того, изучение влияния наночастиц на поляризацию макрофагов, становится важным звеном в понимании механизма действия данных соединений на клетку.

В настоящее время есть примеры изменения поляризации макрофагов с помощью железосодержащих наночастиц. Например, суперпарамагнитные наночастицы оксида железа (SPION), покрытые полиэтиленимином, индуцируют поляризацию М 1, характеризующуюся заметной апрегуляцией типичных генов, связанных с М 1, таких как CD80, IL- 1β, TNF-α (Mulens-Arias et al., 2015). Поскольку макрофаги вносят вклад в опухолевое иммунное микрокружение, их взаимодействие с наночастицами оксида железа может определять тераностичный результат и предоставлять важный инструмент для перепрограммирования фенотипа опухолеассоциированных макрофагов (Mulens-Arias et al., 2021).

В настоящее время необходим поиск стратегий, способных усилить действие существующих лекарств за счет разработки новых терапевтических подходов. Лекарственные препараты могут быть конъюгированы с наночастицами с целью повышения их фармакологического действия или придания им новых специфических свойств. Например, лечение только доксорубицином снижало секрецию макрофагами ФНО-α − важного цитокина, который активирует специфические рецепторы, определяющие раковую клетку, блокирует дальнейшее деление клетки и способствует ее гибели (Reichel et al., 2019). Аналогичным образом ФНО-α воздействует на клетки, инфицированные вирусами и другими патогенами. Наночастицы оксида цинка незначительно увеличивали секрецию ФНО-α макрофагами. В отличие от предыдущих групп, комплекс ZnO-доксорубицин значимо увеличивал секрецию ФНО-α макрофагами, а также секрецию IL-٦ − еще одного важного провоспалительного цитокина (Reichel et al., 2019). Макрофаги, обработанные ZnO-доксорубицином, демонстрировали повышенную экспрессию CD80, CD8٦ и MHCII по сравнению с наночастицами оксида цинка или свободным доксорубицином (Reichel et al., 2019).

Как показали исследования, проведенные в последние десятилетия, ПОМ обладают перспективной биологической активностью, в том числе противоопухолевой и противоинфекционной благодаря своей особой структуре и свойствам (Wang, 2022). Их высокая биосовместимость, структурная стабильность и модифицируемость предоставляют широкие возможности для исследований в области диагностики и лечения рака.

Иммунотерапия антигенпрезентирующими клетками инициирует мощный Т-клеточный ответ при онкологических, вирусных и инфекционных заболеваниях (Masson et al., 2008; Gardner et al., 2020). Использование аутологичных макрофагальных вакцин в клинических испытаниях представляет собой индивидуальную форму клеточной терапии, требующей генерации макрофагов типа М 2 или М 1 в зависимости от вида и тяжести заболевания.

Таким образом, исследуемый нами ПОМ {Mo₇₂Fe₃₀} может представлять большой интерес для биомедицины и онкологии. Предполагаемая способность обеспечивать поляризацию макрофагов делает его интересным объектом для онкологических исследований. Мы показали, что исследованный ПОМ {Mo₇₂Fe₃₀} эффективно поляризуют макрофаги в направлении фенотипа М 1. В дальнейшем мы планируем использовать ПОМ для стимуляции образования М 1-макрофагов и возможного использования полученной культуры в экспериментальных моделях ряда онкологических и воспалительных заболеваний.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена с использованием оборудования центра коллективного пользования ИИФ УрО РАН.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена за счет при финансовой поддержке в рамках государственного задания по науке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (проект № 123031300049-8), а также в рамках госзадания Института иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН (№ 122020900136-4) и Программы развития Уральского федерального университета имени первого Президента России Б.Н. Ельцина в соответствии с программой стратегического академического лидерства «Приоритет- 2030».

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с животными проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (http://oacu.od.nih.gov/regs/index.htm). Протоколы с использованием животных были одобрены одобрены этическим комитетом Института иммунологии и физиологии УрО РАН, протокол № 07/19 от 18.12.2019.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

С. А. Титова

Уральский федеральный университет им. Первого Президента России Б.Н. Ельцина

Автор, ответственный за переписку.
Email: svetattitova12021998@gmail.com
Россия, Екатеринбург

М. О. Тонкушина

Уральский федеральный университет им. Первого Президента России Б.Н. Ельцина

Email: svetattitova12021998@gmail.com
Россия, Екатеринбург

К. В. Гржегоржевский

Уральский федеральный университет им. Первого Президента России Б.Н. Ельцина

Email: svetattitova12021998@gmail.com
Россия, Екатеринбург

И. Г. Данилова

Уральский федеральный университет им. Первого Президента России Б.Н. Ельцина; Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН

Email: svetattitova12021998@gmail.com
Россия, Екатеринбург; Екатеринбург

В. А. Поздина

Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН

Email: svetattitova12021998@gmail.com
Россия, Екатеринбург

М. В. Улитко

Уральский федеральный университет им. Первого Президента России Б.Н. Ельцина

Email: svetattitova12021998@gmail.com
Россия, Екатеринбург

А. А. Остроушко

Уральский федеральный университет им. Первого Президента России Б.Н. Ельцина

Email: svetattitova12021998@gmail.com
Россия, Екатеринбург

Список литературы

Дополнительные файлы