Analysis by minigene assay of the splicing effect of a novel variant c.1545T>G in the SLC26A4 gene associated with hearing loss

Cover Page

Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription Access

Abstract

Pathogenic variants in the SLC26A4 gene (OMIM #605646, 21 exons), encoding the transmembrane protein pendrin, are one of the most significant genetic causes of hearing loss. It is known that about 25% of all pathogenic SLC26A4 variants, which are localized in both intronic and exonic gene regions (near the exon–intron boundaries), lead to aberrant splicing. A detailed analysis of the SLC26A4 gene in Tuvinian patients with hearing loss (the Tyva Republic, Southern Siberia) revealed a specific spectrum of variations, including both already known pathogenic variants and novel variants with unclear clinical significance. One of the novel variants, c.1545T>G, is localized at a position that is potentially «sensitive» to splicing (the 1st nucleotide in exon 14). The segregation of this variant with hearing loss observed in the pedigrees of patients and the significant increase in the frequency of c.1545T>G in the sample of patients compared to the control sample indicate its pathogenic significance. The aim of this work is to analyze the effect of novel variant c.1545T>G of the SLC26A4 gene on the splicing process using minigene assay. A system of minigenes was created, including the analyzed variant c.1545T>G, and the wild-type variant. The study was carried out on HEK293T cell line and repeated on HeLa and SW480 cells. Comparative analysis of splicing patterns in minigenes with variant c.1545T>G and with wild type did not reveal any differences. Thus, variant c.1545T>G of the SLC26A4 gene does not lead to splicing disruption, and its pathogenic effect may be due to the substitution of phenylalanine (Phe) for leucine (Leu) at amino acid position 515 (p.Phe515Leu) of the pendrin protein.

Full Text

Restricted Access

About the authors

E. A. Panina

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Novosibirsk State University

Email: posukh@bionet.nsc.ru
Russian Federation, Novosibirsk, 630090; Novosibirsk, 630090

V. Y. Danilchenko

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Novosibirsk State University

Email: posukh@bionet.nsc.ru
Russian Federation, Novosibirsk, 630090; Novosibirsk, 630090

M. V. Zytsar

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Novosibirsk State University

Email: posukh@bionet.nsc.ru
Russian Federation, Novosibirsk, 630090; Novosibirsk, 630090

K. E. Orishchenko

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Novosibirsk State University

Email: posukh@bionet.nsc.ru
Russian Federation, Novosibirsk, 630090; Novosibirsk, 630090

O. L. Posukh

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Novosibirsk State University

Author for correspondence.
Email: posukh@bionet.nsc.ru
Russian Federation, Novosibirsk, 630090; Novosibirsk, 630090

References

  1. Baralle D., Baralle M. Splicing in action: Assessing disease causing sequence changes // J. Med. Genet. 2005. V. 42. № 10. P. 737–748. https://doi.org/10.1136/jmg.2004.029538
  2. López-Bigas N., Audit B., Ouzounis C., Parra G. et al. Are splicing mutations the most frequent cause of hereditary disease? // FEBS Lett. 2005. V. 579. № 9. P. 1900–1903. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2005.02.047
  3. Wang G.S., Cooper T.A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery // Nat. Rev. Genet. 2007. V. 8. № 10. P. 749–761. https://doi.org/10.1038/nrg2164
  4. Cummings B.B., Marshall J.L., Tukiainen T. et al. Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing // Sci. Transl. Med. 2017. V. 9. № 386. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aal5209
  5. Abramowicz A., Gos M. Splicing mutations in human genetic disorders: Examples, detection, and confirmation // J. Appl. Genet. 2018. V. 59. № 3. P. 253–268. https://doi.org/10.1007/s13353-018-0444-7
  6. Wai H., Douglas A.G.L., Baralle D. RNA splicing analysis in genomic medicine // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2019. V. 108. P. 61–71. https://doi.org/10.1016/j.biocel.2018.12.009
  7. Riolo G., Cantara S., Ricci C. What's wrong in a jump? Prediction and validation of splice site variants // Methods Protoc. 2021. V. 4. № 3. https://doi.org/10.3390/mps4030062
  8. Cartegni L., Chew S.L., Krainer A.R. Listening to silence and understanding nonsense: Exonic mutations that affect splicing // Nat. Rev. Genet. 2002. V. 3. № 4. P. 285–298. https://doi.org/10.1038/nrg775
  9. Grodecká L., Lockerová P., Ravčuková B. et al. Exon first nucleotide mutations in splicing: Evaluation of in silico prediction tools // PLoS One. 2014. V. 9. № 2. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0089570
  10. Perdomo-Ramirez A., de Armas-Ortiz M., Ramos-Trujillo E. et al. Exonic CLDN16 mutations associated with familial hypomagnesemia with hypercalciuria and nephrocalcinosis can induce deleterious mRNA alterations // BMC Med. Genet. 2019. V. 20. № 1. P. 6. https://doi.org/10.1186/s12881-018-0713-7
  11. Albader N., Zou M., BinEssa H.A. et al. Insights of noncanonical splice-site variants on RNA splicing in patients with congenital hypothyroidism // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2022. V. 10. № 3. P. e1263–e1276.https://doi.org/10.1210/clinem/dgab737
  12. Shi X., Wang H., Zhang R. et al. Minigene splicing assays reveal new insights into exonic variants of the SLC12A3 gene in Gitelman syndrome // Mol. Genet. Genomic Med. 2023. V. 11. № 4. https://doi.org/10.1002/mgg3.2128
  13. Richards S., Aziz N., Bale S. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: A joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genet. Med. 2015. V. 17. № 5. P. 405–424. https://doi.org/10.1038/gim.2015.30
  14. Cooper T.A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements // Methods. 2005. V. 37. № 4. P. 331–340. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2005.07.015
  15. Park H.J., Lee S.J., Jin H.S. et al. Genetic basis of hearing loss associated with enlarged vestibular aqueducts in Koreans // Clin. Genet. 2005. V. 67. № 2. P. 160–165. https://doi.org/10.1111/j.1399-0004.2004.00386.x
  16. Kim Y., Kim H.R., Kim J. et al. A novel synonymous mutation causing complete skipping of exon 16 in the SLC26A4 gene in a Korean family with hearing loss // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2013. V. 430. № 3. P. 1147–1150. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2012.12.022
  17. Lee B., Kim Y.R., Kim S.J. et al. Modified U1 snRNA and antisense oligonucleotides rescue splice mutations in SLC26A4 that cause hereditary hearing loss // Hum. Mutat. 2019. V. 40. № 8. P. 1172–1180. https://doi.org/10.1002/humu.23774
  18. Wasano K., Takahashi S., Rosenberg S.K. et al. Systematic quantification of the anion transport function of pendrin (SLC26A4) and its disease-associated variants // Hum. Mutat. 2020. V. 41. № 1. P. 316–331. https://doi.org/10.1002/humu.23930
  19. Zhao Y., Long Y., Shi T. et al. Validating the splicing effect of rare variants in the SLC26A4 gene using minigene assay // BMC Med. Genomics. 2024. V. 17. № 1. P. 233. https://doi.org/10.1186/s12920-024-02007-1
  20. Danilchenko V.Y., Zytsar M.V., Maslova E.A. et al. Different rates of the SLC26A4-related hearing loss in two indigenous peoples of Southern Siberia (Russia) // Diagnostics (Basel). 2021. V. 11. № 12. https://doi.org/10.3390/diagnostics11122378
  21. Weisschuh N., Marino V., Schäferhoff K. et al. Mutations at a split codon in the GTPase-encoding domain of OPA1 cause dominant optic atrophy through different molecular mechanisms // Hum. Mol. Genet. 2022. V. 31. № 5. P. 761–774. https://doi.org/10.1093/hmg/ddab286
  22. Fu Y., Masuda A., Ito M. et al. AG-dependent 3'-splice sites are predisposed to aberrant splicing due to a mutation at the first nucleotide of an exon // Nucl. Ac. Res. 2011. V. 39. № 5. P. 4396–4404. https://doi.org/10.1093/nar/gkr026
  23. Kováčová T., Souček P., Hujová P. et al. Splicing Enhancers at intron–exon borders participate in acceptor splice sites recognition // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. № 18. https://doi.org/10.3390/ijms21186553
  24. Lastella P., Surdo N.C., Resta N. et al. In silico and in vivo splicing analysis of MLH1 and MSH2 missense mutations shows exon- and tissue-specific effects // BMC Genomics. 2006. V. 7. https://doi.org/10.1186/1471-2164-7-243
  25. Yoon J.S., Park H.J., Yoo S.Y. et al. Heterogeneity in the processing defect of SLC26A4 mutants // J. Med. Genet. 2008. V. 45. № 7. P. 411–419. https://doi.org/10.1136/jmg.2007.054635
  26. Roesch S., Bernardinelli E., Nofziger C. et al. Functional Testing of SLC26A4 variants-clinical and molecular analysis of a cohort with enlarged vestibular aqueduct from Austria // Int. J. Mol. Sci. 2018. V. 19. № 1. https://doi.org/10.3390/ijms19010209

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. a – diagram of the minigenes “exon 14” and “exons 13–14”. Fragments of the pET01 vector in the minigenes: exon A (180 bp), intron A (229 bp), intron B (303 bp), exon B (66 bp) are highlighted in gray; fragments of the SLC26A4 gene are highlighted in green. Fragments of the SLC26A4 gene included in the minigenes “exon 14”: part of intron 13 (225 bp), exon 14 (70 bp) with the c.1545T>G variant or with the wild type, part of intron 14 (254 bp). Fragments of the SLC26A4 gene included in the minigenes "exons 13-14": part of intron 12 (172 bp), exon 13 (107 bp), intron 13 (2003 bp), exon 14 (70 bp) with the c.1545T>G variant or with the wild type, part of intron 14 (177 bp). The arrow shows the localization of the c.1545T>G variant in exon 14 of the SLC26A4 gene. b – splicing analysis of the minigenes "exon 14" and "exons 13-14". Left: electrophoregrams of PCR products in 3% agarose gel. M – marker, mut. – minigene with the c.1545T>G variant, wt – minigene with the wild type, pET01 – pET01 vector without insertion. * – PCR products obtained as a result of activation of the hidden splicing site; on the right – schematic representation of the splicing results.

Download (965KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2025 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».