Анализ методом минигенов влияния на сплайсинг нового варианта c.1545T>G в гене SLC26A4, ассоциированного с потерей слуха

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Патогенные варианты в гене SLC26A4 (OMIM #605646, 21 экзон), кодирующем трансмембранный белок пендрин, являются одной из наиболее значимых генетических причин потери слуха. Известно, что около 25% всех известных патогенных SLC26A4-вариантов, локализованных как в интронных, так и экзонных областях (вблизи экзон-интронных границ) гена, приводят к нарушению сплайсинга. При детальном анализе гена SLC26A4 у тувинских пациентов с потерей слуха (Республика Тыва, Южная Сибирь) был выявлен специфический спектр вариаций, включающий как уже известные патогенные варианты, так и новые варианты с пока неясным клиническим значением. Один из новых вариантов, c.1545T>G, локализован в потенциально «чувствительной» для сплайсинга позиции (1-ый нуклеотид в экзоне 14). Сегрегация этого варианта с потерей слуха, выявленная при анализе родословных пациентов, и значимое превышение его частоты в выборке пациентов по сравнению с контрольной выборкой свидетельствуют в пользу его патогенной значимости. Целью данной работы является анализ эффекта нового варианта c.1545T>G гена SLC26A4 на процесс сплайсинга с использованием генетических конструкций – минигенов. Была создана система минигенов, включающих анализируемый вариант c.1545T>G и вариант дикого типа. Исследование проведено на клеточной линии HEK293T и повторено на клетках HeLa и SW480. При сравнительном анализе паттернов сплайсинга в минигенах с вариантом c.1545T>G и дикого типа различий не было выявлено. Таким образом, вариант c.1545T>G гена SLC26A4 не приводит к нарушению сплайсинга, а его патогенный эффект может быть связан с заменой фенилаланина (Phe) на лейцин (Leu) в 515-ой аминокислотной позиции (p.Phe515Leu) белка пендрина.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Е. А. Панина

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Email: posukh@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090; Новосибирск, 630090

В. Ю. Данильченко

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Email: posukh@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090; Новосибирск, 630090

М. В. Зыцарь

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Email: posukh@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090; Новосибирск, 630090

К. Е. Орищенко

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Email: posukh@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090; Новосибирск, 630090

О. Л. Посух

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: posukh@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090; Новосибирск, 630090

Список литературы

  1. Baralle D., Baralle M. Splicing in action: Assessing disease causing sequence changes // J. Med. Genet. 2005. V. 42. № 10. P. 737–748. https://doi.org/10.1136/jmg.2004.029538
  2. López-Bigas N., Audit B., Ouzounis C., Parra G. et al. Are splicing mutations the most frequent cause of hereditary disease? // FEBS Lett. 2005. V. 579. № 9. P. 1900–1903. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2005.02.047
  3. Wang G.S., Cooper T.A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery // Nat. Rev. Genet. 2007. V. 8. № 10. P. 749–761. https://doi.org/10.1038/nrg2164
  4. Cummings B.B., Marshall J.L., Tukiainen T. et al. Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing // Sci. Transl. Med. 2017. V. 9. № 386. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aal5209
  5. Abramowicz A., Gos M. Splicing mutations in human genetic disorders: Examples, detection, and confirmation // J. Appl. Genet. 2018. V. 59. № 3. P. 253–268. https://doi.org/10.1007/s13353-018-0444-7
  6. Wai H., Douglas A.G.L., Baralle D. RNA splicing analysis in genomic medicine // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2019. V. 108. P. 61–71. https://doi.org/10.1016/j.biocel.2018.12.009
  7. Riolo G., Cantara S., Ricci C. What's wrong in a jump? Prediction and validation of splice site variants // Methods Protoc. 2021. V. 4. № 3. https://doi.org/10.3390/mps4030062
  8. Cartegni L., Chew S.L., Krainer A.R. Listening to silence and understanding nonsense: Exonic mutations that affect splicing // Nat. Rev. Genet. 2002. V. 3. № 4. P. 285–298. https://doi.org/10.1038/nrg775
  9. Grodecká L., Lockerová P., Ravčuková B. et al. Exon first nucleotide mutations in splicing: Evaluation of in silico prediction tools // PLoS One. 2014. V. 9. № 2. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0089570
  10. Perdomo-Ramirez A., de Armas-Ortiz M., Ramos-Trujillo E. et al. Exonic CLDN16 mutations associated with familial hypomagnesemia with hypercalciuria and nephrocalcinosis can induce deleterious mRNA alterations // BMC Med. Genet. 2019. V. 20. № 1. P. 6. https://doi.org/10.1186/s12881-018-0713-7
  11. Albader N., Zou M., BinEssa H.A. et al. Insights of noncanonical splice-site variants on RNA splicing in patients with congenital hypothyroidism // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2022. V. 10. № 3. P. e1263–e1276.https://doi.org/10.1210/clinem/dgab737
  12. Shi X., Wang H., Zhang R. et al. Minigene splicing assays reveal new insights into exonic variants of the SLC12A3 gene in Gitelman syndrome // Mol. Genet. Genomic Med. 2023. V. 11. № 4. https://doi.org/10.1002/mgg3.2128
  13. Richards S., Aziz N., Bale S. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: A joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genet. Med. 2015. V. 17. № 5. P. 405–424. https://doi.org/10.1038/gim.2015.30
  14. Cooper T.A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements // Methods. 2005. V. 37. № 4. P. 331–340. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2005.07.015
  15. Park H.J., Lee S.J., Jin H.S. et al. Genetic basis of hearing loss associated with enlarged vestibular aqueducts in Koreans // Clin. Genet. 2005. V. 67. № 2. P. 160–165. https://doi.org/10.1111/j.1399-0004.2004.00386.x
  16. Kim Y., Kim H.R., Kim J. et al. A novel synonymous mutation causing complete skipping of exon 16 in the SLC26A4 gene in a Korean family with hearing loss // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2013. V. 430. № 3. P. 1147–1150. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2012.12.022
  17. Lee B., Kim Y.R., Kim S.J. et al. Modified U1 snRNA and antisense oligonucleotides rescue splice mutations in SLC26A4 that cause hereditary hearing loss // Hum. Mutat. 2019. V. 40. № 8. P. 1172–1180. https://doi.org/10.1002/humu.23774
  18. Wasano K., Takahashi S., Rosenberg S.K. et al. Systematic quantification of the anion transport function of pendrin (SLC26A4) and its disease-associated variants // Hum. Mutat. 2020. V. 41. № 1. P. 316–331. https://doi.org/10.1002/humu.23930
  19. Zhao Y., Long Y., Shi T. et al. Validating the splicing effect of rare variants in the SLC26A4 gene using minigene assay // BMC Med. Genomics. 2024. V. 17. № 1. P. 233. https://doi.org/10.1186/s12920-024-02007-1
  20. Danilchenko V.Y., Zytsar M.V., Maslova E.A. et al. Different rates of the SLC26A4-related hearing loss in two indigenous peoples of Southern Siberia (Russia) // Diagnostics (Basel). 2021. V. 11. № 12. https://doi.org/10.3390/diagnostics11122378
  21. Weisschuh N., Marino V., Schäferhoff K. et al. Mutations at a split codon in the GTPase-encoding domain of OPA1 cause dominant optic atrophy through different molecular mechanisms // Hum. Mol. Genet. 2022. V. 31. № 5. P. 761–774. https://doi.org/10.1093/hmg/ddab286
  22. Fu Y., Masuda A., Ito M. et al. AG-dependent 3'-splice sites are predisposed to aberrant splicing due to a mutation at the first nucleotide of an exon // Nucl. Ac. Res. 2011. V. 39. № 5. P. 4396–4404. https://doi.org/10.1093/nar/gkr026
  23. Kováčová T., Souček P., Hujová P. et al. Splicing Enhancers at intron–exon borders participate in acceptor splice sites recognition // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. № 18. https://doi.org/10.3390/ijms21186553
  24. Lastella P., Surdo N.C., Resta N. et al. In silico and in vivo splicing analysis of MLH1 and MSH2 missense mutations shows exon- and tissue-specific effects // BMC Genomics. 2006. V. 7. https://doi.org/10.1186/1471-2164-7-243
  25. Yoon J.S., Park H.J., Yoo S.Y. et al. Heterogeneity in the processing defect of SLC26A4 mutants // J. Med. Genet. 2008. V. 45. № 7. P. 411–419. https://doi.org/10.1136/jmg.2007.054635
  26. Roesch S., Bernardinelli E., Nofziger C. et al. Functional Testing of SLC26A4 variants-clinical and molecular analysis of a cohort with enlarged vestibular aqueduct from Austria // Int. J. Mol. Sci. 2018. V. 19. № 1. https://doi.org/10.3390/ijms19010209

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. a – схема минигенов «экзон 14» и «экзоны 13–14». Фрагменты вектора pET01 в составе минигенов: экзон А (180 пн), интрон А (229 пн), интрон В (303 пн), экзон В (66 пн) – выделены серым цветом; фрагменты гена SLC26A4 – зеленым цветом. Фрагменты гена SLC26A4, включенные в состав минигенов «экзон 14»: часть интрона 13 (225 пн), экзон 14 (70 пн) с вариантом c.1545T>G или с диким типом, часть интрона 14 (254 пн). Фрагменты гена SLC26A4, включенные в состав минигенов «экзоны 13–14»: часть интрона 12 (172 пн), экзон 13 (107 пн), интрон 13 (2003 пн), экзон 14 (70 пн) с вариантом c.1545T>G или с диким типом, часть интрона 14 (177 пн). Стрелкой показана локализация варианта c.1545T>G в экзоне 14 гена SLC26A4. б – анализ сплайсинга минигенов «экзон 14» и «экзоны 13–14». Слева: электрофореграммы ПЦР-продуктов в 3%-ном агарозном геле. М – маркер, мут. – миниген с вариантом c.1545T>G, wt – миниген с диким типом, pET01 – вектор pET01 без встройки. * – ПЦР-продукты, полученные в результате активации скрытого сайта сплайсинга; справа – схематичное представление результатов сплайсинга.

Скачать (965KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».