Исследование свойств и активности нуклеаз DfCas9 и DsCas9 в клетках эукариот

Объектами данного исследования являются две новые нуклеазы семейства CRISPR/Cas9, гены которых были найдены в геномах бактерий: DfCas9 и DsCas9. Эти нуклеазы были найдены в рамках работ, проведенных компанией Биокад совместно со Сколковским институтом науки и технологии и Санкт-Петербургским политехническим университетом Петра Великого в рамках соглашения по гранту Министерства образования и науки РФ (Cоглашение 14.606.21.0006 от 26 сентября 2017 года). В рамках этого соглашения нуклеазы DfCas9 и DsCas9 были охарактеризованы in vitro сотрудниками Сколтеха и СПбПУ.

На основе результатов этих исследований в настоящей работе было проведено изучение геном-модифицируюшей нуклеазной активности этих ферментов в клетках млекопитающих, а именно – на культуре HEK293. В частности, были получены экспрессионные генетические конструкции с нуклеазами DsCas9 и DfCas9 и необходимыми направляющими РНК (последовательности направляющих РНК были описаны ранее) [1]. Показана экспрессия данных нуклеаз на уровне белка, а также активность нуклеазы DfCas9 в локусе VEGF2 в клетках HEK293. Теоретическое исследование проводилось методом анализа зарубежной и отечественной литературы. Экспериментальная часть работы была выполнена с помощью рестриктазно-лигазного метода клонирования, транзиентной трансфекции, метода детекции экспрессии белков Western Blot и метода детекции гетеродуплексной двуцепочечной ДНК с использованием Т7 эндонуклеазы.