Внутренние теломерные последовательности в хромосомах байкальских планарий

Полный текст

1. Введение

Внутренние теломерные последовательности (ITS) – это теломерная ДНК, локализованная в любом участке хромосом, кроме терминальных регионов (Meyne et al., 1990). Они могут возникать по нескольким причинам, в том числе в результате хромосомных перестроек в процессе эволюции генома, репарации двухцепочечных разрывов ДНК и внедрения экстрахромосомной теломерной ДНК в хромосомы и ее амплификации (Bolzán and Bianchi, 2006; Ruiz-Herrera et al., 2008; Bolzán, 2012). Как правило, ITS не связаны с функциями теломер, если не учитывать их определенную роль в поддержании пластичности генома, т. к. известно, что они индуцируют мутации и локализуются в хрупких сайтах, по которым происходят разрывы хромосом (Moore et al., 2018; Lin and Yan, 2008).

Выделяют четыре группы ITS: короткие, субтеломерные, слитые (появившиеся в результате слияния хромосом) и гетерохроматиновые (Bolzán, 2017). Они отличаются размерами, локализацией и нуклеотидным окружением, а также возникают благодаря разным механизмам. Короткие ITS имеют размер 100-120 пн и могут быть окружены как уникальными последовательностями, так и SINE, LINE, LTR ретротранспозонами. Длина субтеломерных ITS измеряется сотнями нуклеотидов и может включать в себя вырожденные теломерные повторы. Слитые ITS имеют ориентацию голова-к-голове и фланкированы субтеломерной ДНК, что указывает на случаи объединения двух хромосом в теломерных областях. Их размеры могут варьировать от нескольких тпн до нескольких десятков тпн. Гетерохроматиновые ITS – это самые большие последовательности размером до нескольких сотен тпн. Они часто обнаруживаются в прицентромерных областях, но могут встречаться и на плечах хромосом, а также образовывать микрохромосомы (Bolzán, 2017).

Чувствительность обычной Fluorescence in situ hybridization (FISH) позволяет визуализировать последовательности длиной 1000 пн и более (Poon et al., 1999), т.е. с помощью этого метода сложно обнаружить короткие и субтеломерные ITS. Однако наиболее значимые в эволюции кариотипа хромосомные перестройки, которые могут затрагивать теломерные регионы, этот метод способен зафиксировать. В хромосомах позвоночных животных ITS размером более 1000 пн довольно часто встречаются и расположены главным образом вблизи центромер (Meyne et al., 1990; Bolzán et al., 2017; Vicari et al., 2022). Как правило, это является следствием робертсоновских транслокаций (Slijepcevic, 1998), хотя не всегда такие хромосомные мутации приводят к появлению ITS (Souza et al., 2016). Из того, что известно о хромосомах беспозвоночных животных можно сказать, что ITS размером более 1000 пн в них не так широко распространены (Vítková et al., 2005; Traut et al., 2007; Vicari et al., 2022). Например, среди моллюсков такие ITS были обнаружены только у двух из 23 исследованных в этом отношении видов (Nomoto et al., 2001; Godwin et al., 2012). Среди плоских червей известны данные FISH с теломерными зондами для 23 видов, причем большинство из них – паразиты (Таблица 1), и ITS обнаружены только в половых хромосомах двух видов трематод (Hirai, 2014) и одного вида цестод (Špakulová et al., 2019). У свободноживущих плоских червей ITS еще не были выявлены.

 

Таблица 1. Виды, проанализированные на наличие ITS, и их гены 18S рРНК

Виды	2n	ITS (FISH)	Номер в GenBank 18S rRNA
TRICLADIDA
Baikalobia guttata Gerstfeldt, 1858	30	есть1	KY848668.1
B. variegata Korotneff, 1912	30	есть1	OR758633.1
Polycelis tenuis Ijima, 1884	14	нет2	Z99949.1
Dugesia ryukyuensis Kawakatsu, 1976	14	нет2	AF050433.1 (type II)
MONOGENEA
Paradiplozoon homoion Bychowsky et Nagibina, 1959	14	нет3	KY640614.1
CESTODA
Caryophyllaeus laticeps Pallas, 1781	20	нет4	AJ287488.1
Caryophyllaeides fennica Schneider, 1902	20	нет4	KF990172.1
Nippotaenia mogurndae Yamaguti et Miyata, 1940	28	нет4	AJ287545.1
Atractolytocestus huronensis Anthony, 1958	24 (3n)	есть9	OM972659.1
TREMATODA
Schistosoma mansoni Sambo, 1907	16	есть5	U65657.1
S. haematobium Bilharz, 1852	16	есть5	Z11976.1
S. japonicum Katsurada, 1904	16	нет5	Z11590.1
S. sinensium Pao, 1959	16	нет5	AY157225.1
Clonorchis sinensis Looss, 1907	14	нет6	JF823988.1
Metorchis xanthosomus Creplin, 1846	14	нет6	OK384552.1
M. bilis (Braun, 1790) Odening, 1962	14	нет6	OK384551.1
M. orientalis Tanabe, 1920	-	-	JF314771.1
Opisthorchis viverrini (Poirier, 1886) Stiles & Hassal, 1896	14	нет6	JF823987.1
O. felineus Rivolta, 1884 Blanchard, 1895	14	нет6	MF077357.1
Bucephalus minimus (Stossich, 1887) Nicoll, 1914	14	нет7	-
B. australis (Szidat, 1961) Yamaguti, 1971	14	нет7	-
Monascus filiformis (Rudolphi, 1819) Looss, 1907	18	нет7	-
Cercaria longicaudata Tang, 1990	16	нет7	-
Bacciger bacciger (Rudolphi, 1819) Nicoll, 1914	12	нет7	-
MACROSTOMORPHA
Macrostomum lignano Ladurner, Schärer, Salvenmoser, & Rieger, 2005	8	нет8	FJ715306.1
ACOELOMORPHA (внешняя группа)
Hofstenia miamia Correa 1960	-	-	AM701817.1

Примечание: 1 – получены нами; 2 - Joffe et al., 1996; 3 - Tasaka et al., 2013; 4 - Bombarová et al., 2009; 5 - Hirai et al., 2000, Hirai, 2014; 6 - Zadesenets et al., 2012; 7 - García-Souto and Pasantes, 2015; 8 - Zadesenets et al., 2016; 9 - Špakulová et al., 2019. Тире означают отсутствие информации.

 

Мы использовали FISH с теломерными зондами для выявления локализации теломерных повторов в хромосомах двух видов эндемичных планарий рода Baikalobia, автохтонной группы байкальских Dendrocoelidae. ITS были обнаружены у обоих видов червей. Также в этой работе мы проанализировали филогенетические отношения плоских червей с учетом ITS в их хромосомах.

2. Материалы и методы

Планарии были собраны в сентябре 2011 г в заливе Листвяничный озера Байкал (51°52’02.4»N 104°49’55.2»E). Сбор осуществлялся вручную кисточкой с глубины 1 м с камней. Особи были помещены в термоконтейнер с байкальской водой и доставлены в лабораторию, где содержались до анализа. Для FISH использовались ткани двух видов эндемичного байкальского рода Baikalobia: B. guttata Gerstfeldt, 1858 и B. variegata Korotneff, 1912 (по три особи каждого вида). Виды, включенные в филогенетический анализ, представлены в Таблице 1.

2.1. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

Хромосомные препараты готовили из гомогенизированных тканей червей. Ткани помещали 0.56% KCl, измельчали и оставляли при 37°С на 15 мин. Затем фиксировали смесью метанола и уксусной кислоты (3:1), выдерживали при +5°С 15 мин, центрифугировали, убирали надосадочную жидкость и снова повторяли процедуру три раза. На охлажденные до -20°С предметные стекла капали суспензию клеток над водяными парами (70-80°С) и высушивали в течение 10 мин. Перед гибридизацией препараты выдерживали при комнатной температуре несколько суток.

Теломерную пробу получали безматричной ПЦР (Ijdo et al., 1991) и метили ее Bio-11-dUTP посредством ПЦР с праймерами на теломерные районы. FISH теломерной пробы на препаратах проводили в соответствии с протоколом (Joffe et al., 1998) с некоторыми изменениями. После отмывки в 1-кратном PBS, содержащем 50 мМ Mg2+, препараты обрабатывали 0.12% трипсином в течение 20 с. Далее препараты фиксировали в 0.5% формальдегиде и 1-кратном PBS 10 мин, промывали в 2-кратном SSC и дегидрировали в этаноле. Гибридизационная смесь (20 мкл) содержала 50% формамид, 2хSSC и теломерный зонд. Перед гибридизацией смесь денатурировали в течение 5 мин при 96°С, охлаждали во льду и наносили на препарат. Гибридизация шла в течение ночи при 42°С. Детекция биотинилированного зонда проводилась с помощью флуоресцентно меченого стрептавидина (Streptavidin-Cy3, Sigma, США). Препараты окрашивали флуорохромом DAPI (4,6-диамино-2-фенилиндол, 0.5 мкг/мл) в среде Vectashield (Vector laboratories, Великобритания) и анализировали на флуоресцентном микроскопе OIympus BX51. Хромосомы фотографировали при увеличении 100х (камера DP70, источник света X-Cite 120Q).

2.2. Филогенетический анализ

Выделение ДНК, ПЦР гена 18S рРНК и секвенирование проводились, как описано в работе Порфирьева с соавторами (Porfiriev et al., 2018). Выравнивание полученных нуклеотидных последовательностей осуществлялось в программе ClustalW1.6 (Thompson et al., 1994). Филогенетическая реконструкция проводилась в программе MrBayes (3.2.7) (Huelsenbeck and Ronquist, 2001) при использовании модели GTR+G. Цепи Маркова (MCMC) рассчитывались в течение 10000000 поколений (4 цепи параллельно) с частотой записи параметров каждую 1000 генераций. Первые 25% генераций использовались для стабилизации метода правдоподобия, а остальные – для оценки апостериорной вероятности. Критерием достоверности служила апостериорная вероятность, превышающая 95%. Также реконструкция деревьев проводилась в пакете программ MEGA7 (Kumar et al., 2016), где использовались метод ближайших соседей (Neighbor-Joining) и двупараметрическая модель Кимуры (К2P) с бутстреп тестом (1000 репликаций). Графическая редакция дерева осуществлялась в программах FigTree v1.4.2 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) и MEGA7.

3. Результаты

3.1. FISH

FISH была проведена для двух видов байкальских планарий B. guttata и B. variegata (Рис. 1). Гаплоидный набор у них одинаков и составляет 15 хромосом, что было показано Т. М. Умылиной в 70-ых годах (Умылина, 1973; 1976; 1977). Из рисунка 1 видно, что повторы TTAGGG присутствуют не только на концах, но и внутри хромосом, что говорит о наличии ITS у анализируемых видов. При этом у вида B. guttata они располагаются в одной хромосоме (Рис. 1 c, d), а у вида B. variegata ITS, вероятно, они располагаются на двух разных хромосомах (Рис. 1 h).

 

Рис.1. Теломерные сигналы (розовый) в мейотических хромосомах байкальских планарий (хромосомы окрашены DAPI, синий): a, e – внешний вид червей, шкала 1 см; b, f – 15 пар хромосом; c, d, g, h – FISH показывает теломерные повторы TTAGGG у B. guttata и B. variegata. Стрелки указывают на хромосомы с ITS. Желтыми звездочками отмечены ITS. Несколько хромосомных наборов показано на рисунке d.

 

3.2. Филогенетический анализ видов и ITS

Для проведения филогенетического анализа были получены нуклеотидные последовательности гена 18S рРНК для B. guttata и B. variegata, для других видов плоских червей последовательности этого гена были взяты из базы данных GenBank (Таблица 1). Длина анализируемых регионов после выравнивания составила около 2000 пн. 655 информативных сайта было выявлено. В обеих программах MrBayes 3.2.7 и MEGA7 были получены деревья схожей топологии. На рисунке 2 представлено филогенетическое дерево, полученное в MrBayes. В целом представители разных отрядов кластеризуются в отдельные клады с высокой статистической поддержкой, представитель Macrostomorpha образует отдельную ветвь, наряду с внешней группой Hofstenia miamia.

 

Рис.2. Филогенетическое дерево, реконструированное по последовательностям гена 18S рРНК (MrBayes 3.2.7). Розовым цветом выделены виды с ITS. Справа приведены названия отрядов. В узлах указаны значения апостериорной вероятности. Шкала демонстрирует генетические расстояния.

 

4. Обсуждение и выводы

4.1. ITS у паразитических и свободноживущих плоских червей

В эволюции некоторых групп животных внутри- или межхромосомные перестройки, а также геномные мутации сыграли решающую роль (Trifonov et al., 2012; 2016; Dehal and Boore, 2005). В связи с этим, отслеживание таких маркеров хромосомных мутаций как ITS позволяет оценить вклад хромосомных перестроек в видообразование.

В эволюции плоских червей также происходили многочисленные преобразования кариотипа. Также как в случае нематод и других типов беспозвоночных животных (Stein et al., 2003; Ghedin et al., 2007; Dubinin et al., 1936), для плоских червей отмечен значительный вклад внутрихромосомных перестроек (Swain et al., 2011), что, вероятно, связано с присутствием в их геноме большого количества повторяющихся последовательностей, в том числе LTR ретроэлементов (Grohme et al., 2018). Данные по ITS получены для небольшого числа представителей разных отрядов/классов (Таблица 1). Исходя из этих данных, можно сделать вывод о том, что для хромосом этих животных ITS не характерны, как и для других беспозвоночных. Ранее только у паразитических плоских червей были обнаружены ITS (Hirai, 2014; Špakulová et al., 2019). Обнаружение ITS в половых хромосомах паразитов, в данном случае шистосом, связано с несколькими инверсиями и гетерохроматизацией (Hirai et al., 2012; Hirai, 2014). Появление ITS у них было ассоциировано с распространением этих паразитов из Азии в Африку и с последующим видообразованием (Hirai, 2012). Стоит отметить, что шистосомы имеют уникальную среди гермафродитных трематод систему определения пола (ZZ самец, ZW самка), и именно половые хромосомы подверглись значительной реорганизации в процессе эволюции этого рода, о чем свидетельствуют ITS. Байкальские планарии, также как и большинство плоских червей, являются гермафродитами и не имеют отдельных гоносом. Однако появление у представителей рода Baikalobia ITS (Рис. 1) также могло сопровождать видообразование. У свободноживущих плоских червей часто встречаются геномные мутации, связанные с изменением числа хромосом. Они могут носить случайный характер, как в случае макростоморфы Macrostemum lignano, у которой был отмечен высокий процент анеуплоидов (Zadesenets et al., 2016). В случае планарий был выявлен адаптивный характер изменения числа хромосом: с увеличением широты обитания число хромосом также увеличивалось (Lorch et al., 2016). В то же время, изменение числа хромосом в процессе эволюции планарий сопровождало видообразование, например в роде Bdellocephala, в том числе среди байкальских представителей (Умылина, 1971; Кузнеделов и др., 2000; Novikova et al., 2006). При этом происходили и изменения в морфологии хромосом, что указывает на значительную реорганизацию генома. Байкальские эндемичные планарии имеют, как правило, 30 хромосом с преобладанием в кариотипе метацентриков и субметацентриков (Умылина, 1973, 1976, 1977). Стабильность числа хромосом и редкость телоцентрических и акроцентрических хромосом у этой очень разнообразной в морфологическом и экологическом плане группы триклад может указывать на преобладание в процессе эволюции их геномов внутрихромосомных изменений, как и у других плоских червей. К сожалению, мы не знаем, имел ли общий предок всех байкальских триклад ITS в хромосомах или они появились только в процессе эволюции отдельной ветви Baikalobia.

4.2. ITS и филогения плоских червей

В самом начале эволюции плоских червей произошло важное событие, связанное с потерей центросом (Azimzadeh et al., 2012). Это сопутствовало возникновению нескольких групп плоских червей, которые сейчас объединяют в таксон Acentrosomata. Он включает четыре отряда Tricladida, Fecampiida, Prolecithophora, Bothrioplanida и три класса паразитических червей Monogenea, Cestoda и Trematoda (Egger et al., 2015; Collins, 2017). ITS были выявлены у представителей Tricladida, Trematoda и Cestoda, но отсутствовали у исследованных представителей других Acentrosomata, а также у довольно далекой клады Macrostomorpha (Рис. 2), что указывает на независимость путей, приведших к появлению ITS у свободноживущих и паразитических плоских червей. Внутри отряда Tricladida у представителей двух семейств Planariidae и Dugesiidae ITS отсутствуют, но появляются в семействе Dendrocoelidae среди байкальских эндемиков (Рис.1). В Байкале встречаются представители только этого семейства.

Дальнейшее исследование ITS у представителей семейства Dendrocoelidae поможет понять, на каком этапе эволюции произошла реорганизация генома, приведшая к появлению ITS, и было ли это особенностью байкальских эндемиков или всех дендроцелид.

Благодарности

Работа была выполнена при поддержке бюджетных проектов 0279-2021-0007 (121032300180-7) «Комплексное исследование прибрежной зоны…» and 0279-2021-0005 (121032300224-8) «Исследование трансформаций состояния водоемов…», а также грантами РФФИ №51, №12-04-32052, №13-04-01270 и №18-34-00395.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

А. Г. Королева

Лимнологический институт, Сибирское отделение Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: ankor-2015@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5255-0448
Россия, 664033, Улан-Баторская, 3, Иркутск

Е. В. Евтушенко

Институт молекулярной и клеточной биологии, Сибирское отделение Российской академии наук

Email: ankor-2015@yandex.ru
Россия, 630090, проспект Лаврентьева, 8/2, Новосибирск

Е. П. Зайцева

Байкальский музей, Сибирское отделение Российской академии наук

Email: ankor-2015@yandex.ru
Россия, 664520, Академическая, 1, Листвянка

А. Г. Порфирьев

Казанский федеральный университет, Институт фундаментальной медицины и биологии

Email: ankor-2015@yandex.ru

Отделение зоологии и общей биологии

Россия, 420008, Кремлевская, 18, Казань

О. А. Тимошкин

Лимнологический институт, Сибирское отделение Российской академии наук

Email: ankor-2015@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6476-0074
Россия, 664033, Улан-Баторская, 3, Иркутск

С. В. Кирильчик

Лимнологический институт, Сибирское отделение Российской академии наук

Email: ankor-2015@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9997-6294
Россия, 664033, Улан-Баторская, 3, Иркутск

Список литературы

Дополнительные файлы