Таксономическое разнообразие микробиоты толстого кишечника коров при различном уровне эссенциальных элементов в организме животных

Полный текст

Введение.

Минеральный обмен в организме крупного рогатого скота оказывает существенное влияние на реализацию генетического потенциала животных и увеличение объёмов производства молочной продукции (Wagner JJ et al., 2023). Обеспеченность микроэлементами – один из лимитирующих факторов, определяющий продуктивность коров (Гойлян Д. и др., 2022; de Sousa Ferreira JM et al., 2023). Эффективность минерального обмена в организме животных оказывает значительное влияние на качество получаемой сельскохозяйственной продукции (Воронина О.А. и др., 2022; van der Reijden et al., 2019).

Микроэлементы в организме животных влияют на работу ферментов, синтез витаминов, обеспечивают правильную работу системы кроветворения, иммунной и эндокринной систем (Lynch RJM and Duckworth RM, 2020; Weiss WP, 2017; Khan MZ, 2022). Нарушения в минеральном обмене, вызванные избытком или недостатком микроэлементов, в организме коров приводят к отклонениям в работе отдельных систем, развитию патологий и заболеваний у сельскохозяйственных животных (Эленшлегер А.А. и Афанасьев К.А., 2017; Kalaeva E et al., 2020). При составлении рационов для крупного рогатого скота особое внимание уделяют содержанию таких микроэлементов, как железо, медь, цинк, марганец, йод, кобальт и селен (Калашников А.П. и др., 2003; Séboussi R et al., 2016). Данные микроэлементы оказывают значительное влияние на здоровье дойных коров, продуктивность и воспроизводительные функции (Grešáková et al., 2021; Anchordoquy JM et al., 2019).

Поступление необходимых микроэлементов в организм сельскохозяйственных животных обуславливается составом рациона, тогда как их усвоение или выведение из организма связано с работой желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и его здоровьем (Plaizier JC et al., 2018). Одним из ключевых факторов, определяющим эффективность расщепления и усвоения компонентов корма является микробиом ЖКТ.

Микробиом ЖКТ жвачных животных является сложной системой, которая определяет эффективность процесса пищеварения и участвует в поддержании иммунного гомеостаза кишечника. Процессы переваривания питательных веществ в ЖКТ жвачных животных имеют основополагающее значение для продуктивности и здоровья животных (Zhang L et al., 2023).

Наряду с рубцом и тонким кишечником выделяют важную роль пищеварительных процессов, протекающих в толстом отделе кишечника. Микробиом толстого кишечника жвачных животных осуществляет расщепления питательных компонентов корма, не переваренных в рубце, и синтез ферментов, короткоцепочечных жирных кислот, метаболизм аминокислот и вторичных метаболитов (Virgínio Júnior GF and Bittar CMM, 2021). Микробные процессы, протекающие в толстом кишечнике, являются важным источником энергии для всех остальных метаболических процессов и опосредованно влияют на все этапы переваривания и усвоения компонентов корма (Teseo S et al., 2022; Wang L et al., 2023). В ряде исследований описана взаимосвязь между микробиотой кишечника и продуктивностью жвачных животных (Prasetiyono BWHE et al., 2022; Liu L et al., 2023). Отмечается взаимосвязь между обилием ряда таксонов в фекальной микробиоте, маркерами воспаления в сыворотке крови и изменениями в продуктивности животных (Loch М et al., 2024). Однако закономерности изменения таксономического состава микробиома ЖКТ на фоне дефицита или избытка микроэлементов в организме животных является не достаточным.

 

Цель исследования.

Исследование взаимосвязи между элементным составом волоса животных, молока и состоянием микробиома толстого кишечника.

 

Материалы и методы исследования.

Объект исследования. Коровы чёрно-пёстрой породы возрастом 4-5 лет.

Обслуживание животных и экспериментальные исследования были выполнены в соответствии с инструкциями и рекомендациями нормативных актов: Модельный закон Межпарламентской Ассамблеи государств-участников Содружества Независимых Государств "Об обращении с животными", ст. 20 (постановление МА государств-участников СНГ № 29-17 от 31.10.2007 г.), протоколы Женевской конвенции и принципы надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009), Руководство по работе с лабораторными животными (http://fncbst.ru/?page_id=3553). При проведении исследований были предприняты меры для обеспечения минимума страданий животных и уменьшения количества исследуемых опытных образцов. Протокол настоящего исследования одобрен комитетом по Биоэтике ФГБНУ ФНЦ БСТ РАН (протокол № 1 от 17.01.2024).

Схема эксперимента. Исследование было выполнено на коровах чёрно-пёстрой породы (ЗАО «Калинина», Ташлинский район). В эксперименте использованы животные (n=60), подобранные методом пар-аналогов по возрасту (4-5 лет), живой массе (600-650 кг), месяцу лактации (50-60 суток после отёла) и находящиеся в одинаковых условиях содержания. Коровы были клинически здоровы и находились на пастбищном содержании. Рацион составлен согласно рекомендациям по кормлению для дойных коров и представлен в таблице 1 (Калашников А.П. и др., 2003). На основании сравнения данных элементного состава волоса коров с физиологическими нормами животные были разделены на 2 группы (n=15): I группа (контроль) – уровень микроэлементов (Cu, Zn, Co, Se, Mn, Fe) в пределах физиологической нормы, II группа – уровень микроэлементов ниже физиологической нормы или находится в пределах нижней границы. За физиологическую норму были приняты референтные интервалы по содержанию элементов в волосе коров молочной направленности (Мирошников С.А. и др., 2019б). Отбор проб волоса проводился в верхней части холки (0,4 г) (Мирошников С.А. и др., 2019а).

Исследование таксономического состава микробиома у животных I и II групп (n=5) проводилось в толстом кишечнике. Содержимое толстого кишечника отбирали с использованием стерильного инструмента в пробирки с раствором консерванта (DNA/RNA Shield, США), после чего замораживали при температуре -60 °С.

 

Таблица 1. Состав рациона

Table 1. Composition of the diet

Корма / diets	Количество на голову в сутки / Quantity per head per day
Трава пастбищ, кг / Pasture grass, kg	50,0
Сено, кг/ Hay, kg	1,5
Комбикорм, кг / Compound feed, kg	6,0
Ячмень плющ.,экструд., кг / Barley ivy, extruded, kg	1,0
Патока, кг / Molasses, kg	0,75
Соль поваренная, г / Table salt, g	75,0
Ca, г / Ca, g	52,3
P, г / P, g	30,1
Mg, г / Mg, g	21,6
K, г / K, g	61,2
Co, г / Co, g	4,98
Cu, г / Cu, g	68,4
Fe, г / Fe, g	580,9
I, г / I, g	2,71
Mn, г / Mn, g	429,0
Zn, г / Zn, g	385,6
S, г / S, g	26,2

 

Оборудование и технические средства. Элементный анализ волоса и молока животных проводился в ЦКП БСТ РАН http://цкп-бст.рф на одноквадрупольном масс-спектрометре с индуктивно-связанной плазмой Agilent 7900 ICP-MS (Agilent, США). Исследование микробиома толстого кишечника проводилось с помощью NGS-секвенирования на платформе MiSeq (Illumina, США) в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Персистенция микроорганизмов» Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (Оренбург, Россия).

Статистический анализ. Статистический анализ проводили с помощью офисного программного комплекса Microsoft Office с применением программы «Excel» («Microsoft», США) с обработкой данных в «Statistica 10.0» («StatSoft Inc.», США). Достоверными считали результаты при Р≤0,05 (U-критерий Манна-Уитни). Анализ бактериальных сообществ микробиома толстого кишечника включал расчёт альфа-разнообразия (индекс Chao1, индекс разнообразия Шенона (Shannon), индекс разнообразия Симпсона (Simpson), статистический метод: Mann-Whitney) и бета-разнообразия (метод ординации: NMDS; дистанционный метод: индекс Брея-Кертиса; статистический метод: PERMANOVA).

 

Результаты исследований.

Анализ элементного состава волоса коров позволил выявить группу животных из общей выборки с более низким содержанием селена, меди, кобальта и марганца в сравнении с физиологическими нормами. Во II группе в сравнении с I уровень селене, меди, кобальта цинка, железа и марганца был достоверно (Р≤0,05) ниже на 21,4; 20; 30,1; 17,9; 40,3 и 30,2 % (рис. 1). Также в волосах коров II группы было отмечено более низкое содержание кальция (-7,3 %, Р≤0,05) и хрома (-5,67 %, Р≤0,05) и более высокая концентрация кремния (+36,4 %, Р≤0,05). Оценка содержания токсичных элементов в волосах коров группы II показала более высокие концентрации ртути (+6,73 %, Р≤0,05) в сравнении с группой I.

Примечание: * – Р≤0,05/ Note: * – Р≤0.05

 

Рисунок 1. Разница по величине концентраций химических элементов в волосе коров II группы в сравнении с I

Figure 1. Difference in concentrations of chemical elements in the hair of cows of group II in comparison with group I

 

Сравнение элементного состава молока исследуемых животных показало аналогичные изменения только по содержанию меди (-23,3 %, р≤0,05), кальция (-3,19 %, р≤0,05) и селена (-7,96 %, р≤0,05) во II группе относительно I (рис. 2).

Примечание:* – Р≤0,05/Note:* – Р≤0.05

 

Рисунок 2. Разница по величине концентраций химических элементов в молоке коров II группы в сравнении с I

Figure 2. The difference in the concentration of chemical elements in the milk of cows of group II compared to group I

 

Корреляционный анализ (по Спирмену) по элементному составу молока и волоса животных II группы был проведён для элементов с достоверными различиями между группами (табл. 3). Выявлена сильная положительная корреляционная связь для концентраций селена в волосе и этого же элемента – в молоке. Аналогично сильная положительная корреляция была отмечена для концентраций кальция в молоке и волосе животных.

 

Таблица 3. Коэффициенты корреляции (по Спирмену) между содержанием химических элементов металлов в волосе и молоке коров II группы

Table 3. Correlation coefficients (according to Spearman) between the content of chemical elements of metals in hair and milk of cows of group II

Элементы молока / Elements of milk	Элементы волос / Hair Elements
	Fe	Zn	Mn	Cо	Сu	Se	Ca	Cr	Hg
Сu	0,43	0,18	-0,01	0,12	-0,21	-0,15	0,17	0,31	0,58
Se	-0,37	0,14	0,35	0,17	0,38	0,66*	0,52	0,18	-0,44
Ca	0,39	0,24	0,55	0,08	0,05	-0,17	0,76*	0,26	0,33

 Примечание: * – значимые корреляции на уровне Р≤0,05

 Note: * – significant correlations at the level of P≤0.05

 

Исследование бактериального состава микробиома толстого кишечника коров исследуемых групп показало, что основная доля идентифицированных бактерий относится к филумам Bacteroidota (30,6-35,5 %) и Bacillota (54,7-58,2 %) (рис. 3). Минорной группой в микробиоме толстого кишечника являлись бактерии таксона Pseudomonadota (2,2-6,6 %) в обеих опытных группах.

Примечание: * – Р≤0,05/Note: * – Р≤0.05

 

Рисунок 3. Обилие таксономических групп (на уровне филума) в микробиоме толстого кишечника коров I и II

Figure 3. Abundance of taxonomic groups (at the phylum level) in the colon microbiome of cows I and II

 

Значимые различия между таксономическими составами микробиомов толстого кишечника при сравнении II группы с I были отмечены на уровне семейств и родов (рис. 4). Во II группе в сравнении с I была выявлена более низкая доля бактерий семейств Lachnospiraceae (-3,68 %, Р≤0,05) и Oscillospiraceae (-6,6 %, Р≤0,05), р. Alistipes (-3,51 %, Р≤0,05) и р. Prevotella (-2,9 %, Р≤0,05). Также отмечено в микробиоме кишечника II группы, при сравнении с I, более низкая относительная численность unclassified Oscillospiraceae (-4,1 %, Р≤0,05) и unclassified Lachnospiraceae (-3,69 %, Р≤0,05). Наоборот, доля микроорганизмов Succinivibrionaceae (р. Ruminobacter) в микробиоме толстого кишечника коров II группы была выше чем в I группе на 4,2 % (Р≤0,05).

Примечание: * – Р≤0,05

Note:* – Р≤0.05

 

Рисунок 4. Различия в обилии таксономических групп (на уровне семейств и рода) в микробиоме толстого кишечника коров II группы в сравнении с I

Figure 4. Differences in the abundance of taxonomic groups (at the family and genus level) in the large intestine microbiome of cows of group II compared to group I

 

Расчёт индексов альфа-разнообразия для микробиоты толстого кишечника показал более низкие значения во II группе в сравнении с I, что свидетельствовало о снижении таксономического разнообразия и видового богатства в микробиоме (табл. 4).

 

Таблица 4. Индексы альфа-разнообразия микробиоты толстого кишечника коров I и II групп

Table 4. Alpha diversity indices of the large intestine microbiota of cows of groups I and II

Группа / Group	Индекс альфа-разнообразия / Alpha diversity index
	Chao 1	Shannon	Simpson
I	298,4±1,87	2,66±0,03	0,92±0,005
II	273,2±1,55***	2,32±0,04***	0,77±0,008**

Примечание: ** – Р≤0,01; *** – Р≤0,001

Note: ** – Р≤0.01; *** – Р≤0.001

 

Анализ бета-разнообразия микробиомов исследуемых групп показал отсутствие различий в организации бактериальных сообществ (р=0,018) (рис. 5).

 

Рисунок 5. Бета-разнообразие микробиоты толстого кишечника коров I и II групп

Figure 5. Beta diversity of the colon microbiota of cows of groups I and II

 

Обсуждение полученных результатов.

Микроэлементы в кормлении жвачных животных являются важным фактором, определяющим их здоровье и темпы роста (Ramah A et al., 2023). Изменения в минеральном обмене организма животного на фоне дефицита или избытка отдельных микроэлементов оказывают влияние как на здоровье самого животного, в частности на эффективность работы отдельных систем, так и на качество получаемой продукции (Numa Pompilio CG et al., 2021).

В нашем исследовании у животных с более низким содержания кобальта, марганца, цинка, меди, селена и кальция в волосе наблюдалось также более высокое содержание ртути и никеля. Аналогичные взаимосвязи между содержанием эссенциальных и токсичных микроэлементов были описаны при исследовании волоса коров других пород (Miroshnikov S et al., 2021). Предполагаем, что изменение концентрации одного элемента в организме может оказывать косвенное влияние на содержание другого, что могло являться одной из причин более высокого содержания ртути и более низкой концентрации селена у животных во II группе в сравнении с I. Как известно, селен и ртуть – это взаимные антагонисты (Afzal A and Mahreen N, 2024). Также ртуть является мощным блокатором каналов транспорта кальция в клетках крупного рогатого скота, что также могло обуславливать его более низкую концентрацию у животных II группы относительно I (Weinsberg F et al., 1995). Отмечается, что дефицит кальция, цинка, железа, селена, меди, хром и марганец способствует накоплению токсичных металлов в организме (Chowdhury BA and Chandra RK, 1987).

Изменения элементного состава волоса животных согласовывались с изменениями количества некоторых минеральных веществ в молоке. Была выявлена высокая корреляция между содержанием селена и кальция в волосе коров и их концентраций в молоке. Аналогично в работе Mehdi Y и Dufrasne I (2016) отмечается, что изменения в усвоении селена ведут к изменению его концентрации в молоке. Однако увеличения содержания токсичных элементов в молоке, в сравнении с контрольной группой, на фоне их более высокого содержания в организме отмечено не было. Возможно, это обусловлено тем, что скорость накопления токсичных микроэлементов в организме животных и скорость их поступления в молочные продукты различна, так как первично создание избытка элемента в почках и печени (Sharma RP et al., 1982).

Вероятно, причиной накопления или дефицита элемента в организме при содержании животных в одинаковых условиях являлась совокупность таких факторов, как особенности обмена веществ животного, уровень продуктивности и элементный состав пастбищной травы (Nemec LM et al., 2012; Мирошников С.А. и др., 2019б).

На фоне различий в содержании ряда микроэлементов в организме исследуемых животных особый интерес вызывают изменения в микробиоте ЖКТ крупного рогатого скота. Микробиом ЖКТ крупного рогатого скота считают скрытым метаболическим органом, и от эффективности его работы во многом зависит степень расщепления и усвоения питательных веществ и, как следствие, показатели продуктивности животного. Поэтому оценка таксономического состава микробиома ЖКТ жвачных животных на фоне изменений в содержании ряда микроэлементов в организме является важным аспектом в понимании уровня обменных процессов и прогнозирования будущей продуктивности.

Таксономический состав микробиома коров с содержанием эссенциальных микроэлементов ниже физиологической нормы характеризовался более низкими значениями индексов биоразнообразия и меньшей долей бактерий, осуществляющих синтез короткоцепочечных жирных кислот. Выявлено увеличение доли бактерий Pseudomonadota и снижение доли микроорганизмов, относящихся к Bacillota. В рамках таксона Bacillota наблюдалось снижение доли бактерий семейства Lachnospiraceae, являющихся активными продуцентами бутирата, микроорганизмов р. Prevotella и р. Alistipes, которые обеспечивают в кишечнике синтез ацетата, бутирата, пропионата (Li RW et al., 2012; Zhang B et al., 2022). Численность бактерии р. Alistipes и р. Prevotella в кишечнике в ряде исследований связывают с нормальным функционированием кишечника крупного рогатого скота, так как они являются продуцентами энергетического субстрата для эпителиальных клеток толстого кишечника крупного рогатого скота (Wang Y et al., 2022; Xue MY et al., 2020). Полученные данные согласуются с результатами отдельных работ, проведённых на различных организмах, по влиянию изменений содержания микро- и макроэлементов на кишечную микробиоту. В исследовании на мышах показано, что дефицит железа приводит к снижению бактерий р. Prevotella (Smith AD et al., 2018). Аналогично в исследовании на свиньях показано, что дефицит железа негативно сказывается на доле бактерий семейств Lachnospiraceae и Ruminococcaceae в микробиоме толстого кишечника. Увеличение концентраций никеля в организме способно приводить к снижению биоразнообразия в микробиоте кишечника мышей и численности бактерий таксона Lachnospiraceae (Zhou X et al., 2019).

В результате нами было отмечено снижение доли бактерий, связанных с энергетическими процессами в кишечнике, на фоне недостатка ряда элементов в организме, что может негативно сказаться на работе всей системы пищеварения.

В то же время в рамках таксона Pseudomonadota выявлено увеличение доли бактерий р. Ruminobacter, которые являются амилолитическими микроорганизмами и метаболизируют углеводы с образованием сукцинат и формиат, что будет приводить к изменениям направленности метаболических процессов в кишечнике, в том числе в энергетическом метаболизме (Stackebrandt E, 2015; Niwiska B, 2012). В исследованиях отмечается отрицательная взаимосвясь между долей бактерий таксона Pseudomonadota в кишечнике и уровнем потребления селена (Zhang X et al., 2022).

Изменения бактериального состава микробиома ЖКТ крупного рогатого скота на фоне воздействия различных факторов неизбежно приводят к изменению в работе всей системы пищеварения (Лиходеевский ГА и др., 2024). Снижение содержания пропионата, ацетата и бутирата в ЖКТ может оказывать влияние на метаболизм глюкозы, что приведёт к уменьшению секреции молочного жира и молочного белка (Qin L et al., 2022; Izumi K et al., 2019).

Учитывая двунаправленную взаимосвязь между составом микробиома ЖКТ и содержанием отдельных элементов, изменения, вызванные недостатком микроэлементов, будут влиять на усвоение микроэлементов в кишечнике.

Согласно литературным источникам, микробиота кишечника является барьером для всасывания ряда элементов путём изменения pH или концентрации метаболитов, участвующих в иммунологических реакциях и энергетических процессах (Claus SP et al., 2011). Предполагается, что микробиота ЖКТ может изменять метаболизм токсичных веществ и выводить их из организма (Collins SL and Patterson AD, 2020).

Однако для некоторых кишечных бактерий, оказывающих влияние на здоровье кишечника, описано положительное влияние на усвоение микроэлементов (Collins JF et al., 2018). Отмечается, что короткоцепочечные жирные кислоты (в том числе бутират) микробиного происхождения способны улучшать функции эпителиального барьера кишечника, оказывая влияние на всасывание веществ (Zheng L et al., 2017). Некоторые виды микроорганизмов могут повышать биодоступность селена и защищать организм хозяина от токсичности селена (Ferreira RLU et al., 2021).

Снижение доли бактерий таксона Bacillota и увеличение относительной численности филума Pseudomonadota, вероятно, будет приводить к недостатку цинка в организме хозяина. Описано конкурентное поглощение цинка бактериями таксона Pseudomonadota в кишечнике, что может снижать количество цинка, доступного для макроорганизма (Reed S et al., 2015).

 

Заключение.

Таким образом, была выявлена взаимосвязь между содержанием микроэлементов в волосе коров, их количеством в молоке и особенностями таксономического состава микробиома толстого кишечника. У животных с содержанием цинка, меди, кобальта, марганца и селена в пределах референтных значений отмечалась высокая доля бактерий в кишечнике, продуцирующих бутират, ацетат и пропионат. Для животных с недостатком эссенциальных микроэлементов, в сравнении с рекомендуемым референтным диапазоном, было характерно увеличение в микробиоме доли бактерий, продуцирующих сукцинат и формиат. В результате отмечалась тенденция к изменению бактериального состава микробиома на фоне снижения содержания ряда элементов в волосе коров, что неизбежно будет приводить к изменениям в метаболических процесса в ЖКТ. Полученные данные показывают важность изучения миробиоты ЖКТ на фоне дисбаланса микроэлементов в организме животных и перспективы управления метаболическими процессами в кишечнике путём коррекции элементозов.

Об авторах

Елена В. Яушева

Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: vasilena56@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1589-2211

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Россия, Оренбург

Елена А. Сизова

Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук

Email: Sizova.L78@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5125-5981

доктор биологических наук, руководитель центра «Нанотехнологии в сельском хозяйстве»

Россия, Оренбург

Список литературы

Дополнительные файлы