Тканеспецифичность экспрессии и альтернативный сплайсинг гена белка активации фибробластов альфа (FAPα) в стромальных клетках человека

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Обоснование. Белок активации фибробластов альфа (fibroblast activation protein alpha, FAPα) является ключевым маркёром активированных стромальных клеток, которые играют важную роль в репарации и восстановлении целостности тканей после повреждений. По-видимому, FAPα участвует в регуляции функций стромальных клеток, особенно при развитии фиброза. Однако мало что известно о тканевых различиях в экспрессии и возможных сплайс-вариантах этого белка в стромальных клетках.

Цель исследования — установить тканеспецифичность экспрессии FAPα, включая синтез продуктов альтернативного сплайсинга, в стромальных клетках человека, выделенных из разных источников.

Методы. С помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени анализировали экспрессию отдельных участков гена, кодирующих функциональные домены белка FAPα, в стромальных клетках человека, выделенных из пяти тканевых источников, которые различаются по эмбриональному происхождению и репаративным реакциям на повреждение (кожа, подкожная жировая ткань, жировая ткань орбиты, лёгкие, эндометрий). Для активации стромальных клеток использовали ключевой профибротический фактор — трансформирующий фактор роста бета.

Результаты. В стромальных клетках из кожи, лёгких и жировой ткани отмечается низкая фоновая экспрессия всех последовательностей рибонуклеиновой кислоты (РНК), кодирующих функциональные домены FAPα, которые отвечают за конфигурацию белка или за его ферментативные функции. Их экспрессия значимо (в 2–2,5 раза) повышается при индукции активации стромальных клеток с помощью трансформирующего фактора роста бета. В эндометриальных мезенхимных стромальных клетках экспрессия этих участков крайне низка и сопоставима с уровнем экспрессии в эпителиальных клетках, что указывает на наличие тканеспецифичности экспрессии гена FAPα в стромальных клетках. Во всех линиях стромальных клеток наблюдается повышение относительного уровня экспрессии последовательности РНК, кодирующей трансмембранный домен FAPα.

Заключение. Полученные результаты позволяют предположить, что в проанализированных клеточных линиях альтернативный сплайсинг FAPα либо отсутствует, либо проявляется с очень низкой вероятностью при их активации в виде относительного повышения экспрессии участка гена, кодирующего трансмембранный домен FAPα. Вероятнее всего, исследуемые стромальные клетки синтезируют матричную РНК, несущую все исходные экзоны и кодирующую преимущественно полный белок FAPα (включает в себя все функциональные домены).

Об авторах

Анастасия Евгеньевна Толстолужинская

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: tolstoluzhinskayaae@my.msu.ru
ORCID iD: 0000-0001-8362-2902
SPIN-код: 6592-9889
Россия, Москва

Наталия Андреевна Басалова

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: basalovana@my.msu.ru
ORCID iD: 0000-0002-2597-8879
SPIN-код: 2448-4671

канд. биол. наук

Россия, Москва

Максим Николавевич Карагяур

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: m.karagyaur@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4289-3428
SPIN-код: 9504-4257

канд. биол. наук
Россия, Москва

Анастасия Юрьевна Ефименко

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: efimenkoan@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0696-1369
SPIN-код: 5110-5998

канд. мед. наук

Россия, Москва

Список литературы

  1. Henderson NC, Rieder F, Wynn TA. Fibrosis: from mechanisms to medicines. Nature. 2020;587(7835):555–566. doi: 10.1038/s41586-020-2938-9 EDN: KNAIWV
  2. Herrera J, Henke CA, Bitterman PB. Extracellular matrix as a driver of progressive fibrosis. J Clin Invest. 2018;128(1):45–53. doi: 10.1172/JCI93557
  3. Acharya PS, Zukas A, Chandan V, et al. Fibroblast activation protein: a serine protease expressed at the remodeling interface in idiopathic pulmonary fibrosis. Hum Pathol. 2006;37(3):352–360. doi: 10.1016/j.humpath.2005.11.020
  4. Hu HH, Chen DQ, Wang YN, et al. New insights into TGF-β/Smad signaling in tissue fibrosis. Chem Biol Interact. 2018;292:76–83. doi: 10.1016/j.cbi.2018.07.008
  5. Kanisicak O, Khalil H, Ivey MJ, et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nat Commun. 2016;7:12260. doi: 10.1038/ncomms12260
  6. Ugurlu B, Karaoz E. Comparison of similar cells: Mesenchymal stromal cells and fibroblasts. Acta Histochem. 2020;122(8):151634. doi: 10.1016/j.acthis.2020.151634 EDN: LTJEXX
  7. Kilvaer TK, Rakaee M, Hellevik T, et al. Tissue analyses reveal a potential immune-adjuvant function of FAP-1 positive fibroblasts in non-small cell lung cancer. PLoS One. 2018;13(2):e0192157. doi: 10.1371/journal.pone.0192157
  8. Yang P, Luo Q, Wang X, et al. Comprehensive analysis of fibroblast activation protein expression in interstitial lung diseases. Am J Respir Crit Care Med. 2023;207(2):160–172. doi: 10.1164/rccm.202110-2414OC EDN: NUYIKK
  9. Kimura T, Monslow J, Klampatsa A, et al. Loss of cells expressing fibroblast activation protein has variable effects in models of TGF-β and chronic bleomycin-induced fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2019;317(2):L271–L282. doi: 10.1152/ajplung.00071.2019
  10. O’Brien P, O’Connor BF. Seprase: an overview of an important matrix serine protease. Biochim Biophys Acta. 2008;1784(9):1130–1145. doi: 10.1016/j.bbapap.2008.01.006
  11. Zhang HE, Hamson EJ, Koczorowska MM, et al. Identification of novel natural substrates of fibroblast activation protein-alpha by differential degradomics and proteomics. Mol Cell Proteomics. 2019;18(1):65–85. doi: 10.1074/mcp.RA118.001046
  12. Xin L, Gao J, Zheng Z, et al. Fibroblast activation protein-α as a target in the bench-to-bedside diagnosis and treatment of tumors: a narrative review. Front Oncol. 2021;11:648187. doi: 10.3389/fonc.2021.648187 EDN: CSKJMI
  13. Fan MH, Zhu Q, Li HH, et al. Fibroblast activation protein (FAP) accelerates collagen degradation and clearance from lungs in mice. J Biol Chem. 2016;291(15):8070–8089. doi: 10.1074/jbc.M115.701433
  14. Aertgeerts K, Levin I, Shi L, et al. Structural and kinetic analysis of the substrate specificity of human fibroblast activation protein alpha. J Biol Chem. 2005;280(20):19441–19444. doi: 10.1074/jbc.C500092200
  15. Fitzgerald AA, Weiner LM. The role of fibroblast activation protein in health and malignancy. Cancer Metastasis Rev. 2020;39(3):783–803. doi: 10.1007/s10555-020-09909-3 EDN: GFJRDK
  16. Goldstein LA, Chen WT. Identification of an alternatively spliced seprase mRNA that encodes a novel intracellular isoform. J Biol Chem. 2000;275(4):2554–2559. doi: 10.1074/jbc.275.4.2554
  17. Niedermeyer J, Enenkel B, Park JE, et al. Mouse fibroblast-activation protein — conserved Fap gene organization and biochemical function as a serine protease. Eur J Biochem. 1998;254(3):650–654. doi: 10.1046/j.1432-1327.1998.2540650.x
  18. Eremichev SH, Yang HJ, Kim DS, et al. Clinical efficacy of retrograde urethrogra-phy-assisted urethral catheterization after failed conventional urethral catheterization. BMC Urol. 2021;21(1):17. doi: 10.1186/s12894-021-00788-6 EDN: YWRTPN
  19. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 2001;25(4):402–408. doi: 10.1006/meth.2001.1262
  20. Gorrell MD, Gysbers V, McCaughan GW. CD26: a multifunctional integral membrane and secreted protein of activated lymphocytes. Scand J Immunol. 2001;54(3):249–264. doi: 10.1046/j.1365-3083.2001.00984.x EDN: BAUZCV
  21. Barbosa-Morais NL, Irimia M, Pan Q, et al. The evolutionary landscape of alternative splicing in vertebrate species. Science. 2012;338(6114):1587–1593. doi: 10.1126/science.1230612 EDN: RJWAAB
  22. Will CL, Lührmann R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011;3(7):a003707. doi: 10.1101/cshperspect.a003707
  23. Marasco LE, Kornblihtt AR. The physiology of alternative splicing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24(4):242–254. doi: 10.1038/s41580-022-00545-z EDN: KNCVSZ
  24. Liu Q, Fang L, Wu C. Alternative splicing and isoforms: from mechanisms to diseases. Genes (Basel). 2022;13(3):401. doi: 10.3390/genes13030401 EDN: RWIXTU
  25. Roberts α from skeletal muscle and bone marrow results in cachexia and anemia. J Exp Med. 2013;210(6):1137–1151. doi: 10.1084/jem.20122344
  26. Meletta R, Müller Herde A, Chiotellis A, et al. Evaluation of the radiolabeled boronic acid-based FAP inhibitor MIP-1232 for atherosclerotic plaque imaging. Molecules. 2015;20(2):2081–2099. doi: 10.3390/molecules20022081
  27. Harvey SE, Lyu J, Cheng C. Methods for characterization of alternative RNA splicing. Methods Mol Biol. 2021;2372:209–222. doi: 10.1007/978-1-0716-1697-0_19
  28. Ang CJ, Skokan TD, McKinley KL. Mechanisms of regeneration and fibrosis in the endometrium. Annu Rev Cell Dev Biol. 2023;39:197–221. doi: 10.1146/annurev-cellbio-011723-021442 EDN: CAHZNB

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Структура белка активации фибробластов альфа: a — белковая последовательность FAPα: аминокислоты 1–4 отвечают за внутриклеточный домен; 5–25 составляют трансмембранный домен; остальные аминокислоты вплоть до 760 — внеклеточная часть белка, при этом β-пропеллерный домен состоит из аминокислот 54–492, а домен α/β-гидролазы — 493–760; b — строение белка, вид сбоку.

Скачать (642KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Микрофотографии используемых клеточных культур, фазовый контраст (инвертированный микроскоп Leica DM IL Led; Leica Microsystems, Швейцария): a — дСК (стромальные клетки, полученные из дермы человека); b — лСК (стромальные клетки, полученные из лёгких человека); c — жСК (стромальные клетки, полученные из жировой ткани человека); d — эСК (стромальные клетки, полученные из менструальных выделений эндометрия матки); e — оСК (стромальные клетки, полученные из орбитального жира); f — HEK (HEK-293T) — линейные клетки эмбрионального почечного эпителия человека. Бар 100 мкм.

Скачать (916KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Электрофорез продуктов полимеразной цепной реакции комплементарной ДНК линии лСК (лёгочных стромальных клеток). Праймеры, используемые в данных реакциях, были связаны с участками гена FAPα, кодирующими различные функциональные домены белка (слева направо): 1 — GAPDH — конститутивный ген для нормирования результатов (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), 2 — внутриклеточный домен, 3 — трансмембранный домен, 4 — внеклеточный домен, 5 — домен β-пропеллера, 6 — α/β-гидролазный домен, и далее GeneRuler 100 bp DNA Ladder с указанием 300, 200 и 100 п.о. (пар оснований).

Скачать (132KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Графики, отображающие уровень экспрессии фрагментов гена FAPα (в условных единицах), кодирующих функциональные домены белка в культурах стромальных клеток, выделенных из разных тканевых источников: лёгкие (лСК), кожа (дСК), орбитальный жир (оСК), абдоминальный жир (жСК), эндометрий (эСК), а также линия HEK. Исследуемые фрагменты FAPα кодируют различные функциональные домены белка: a — внутриклеточный, b — трансмембранный, c — внеклеточный, d — β-пропеллерный и e — α/β-гидролазный.

Скачать (750KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Графики, отображающие уровень экспрессии фрагментов гена FAPα (в условных единицах), кодирующих функциональные домены белка в клеточных культурах до (синие столбцы) и после (красные столбцы) добавления фактора TGFβ: a — лСК (лёгочные стромальные клетки, b — дСК (дермальные стромальные клетки), c — жСК (стромальные клетки, полученные из жировой ткани). Исследуемые последовательности гена кодируют различные функциональные домены соответственно: 1 — внутриклеточный домен, 2 — трансмембранный домен, 3 — внеклеточный домен, 4 — домен β-пропеллера, 5 — α/β-гидролазный домен. Указанные числа — величина р, которая была получена в результате расчёта критерия Манна–Уитни для пары выборок без и с добавлением TGFβ и критерия Краскела–Уоллиса для групп выборок без добавления TGFβ и после добавления TGFβ.

Скачать (497KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Графики, отображающие уровень экспрессии фрагментов гена FAPα (в условных единицах), кодирующих функциональные домены белка в клеточных культурах: a — стромальные клетки, полученные из орбитального жира (оСК); b — стромальные клетки, полученные из эндометрия матки (эСК). Исследуемые последовательности гена кодируют различные функциональные домены соответственно: 1 — внутриклеточный домен, 2 — трансмембранный домен, 3 — внеклеточный домен, 4 — домен β-пропеллера, 5 — α/β-гидролазный домен. Значение р рассчитано по критерию Краскела–Уоллиса.

Скачать (286KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Электрофорез продуктов ПЦР, полученных на основе комплементарной ДНК образцов дермальных стромальных клеток (дСК) и лёгочных стромальных клеток (лСК) без и после добавления TGFβ, а также эндометриальных стромальных клеток (эСК). Крайняя правая полоса — маркёр длин ДНК DNA Ladder 1 kb (NL001; «Евроген», Россия). Слева направо: первые пять полос после маркёра — продукты амплификации целого гена FAPα; следующие три полосы — ПЦР-продукты образцов лСК до и после индукции TGFβ, полученные с использованием пар праймеров № 1–3 из табл. 2 соответственно; следующие три полосы — ПЦР-продукты образцов эСК, полученные с использованием пар праймеров № 1–3. Жёлтыми цифрами указаны полосы, отобранные для секвенирования. ПЦР — полимеразная цепная реакция, «–TGFβ» — без добавления TGFβ, «+TGFβ» — после добавления TGFβ.

Скачать (402KB)
Метаданные

© Эко-Вектор, 2025

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».