Способы синхронизации клеточного цикла кариопластов для повышения результативности соматического клонирования сельскохозяйственных животных

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Соматическое клонирование (somatic cell nuclear transfer, SCNT) является технологией получения многоклеточных организмов с применением ооцитов, генетический материал которых заменён на содержимое ядер донорских клеток (кариопластов). В 1952 году на амфибиях была проведена работа, результатом которой стало получение первых клонированных животных из клеток на стадии бластоцисты [1]. Затем последовал ряд исследований, приведших к рождению млекопитающих разных видов, однако их объединяло использование в качестве кариопластов бластомеров ранних эмбрионов [2], тогда как первое клонированное потомство, при создании которого были применены соматические клетки взрослого животного, получено в 1996 году [3]. В настоящее время путём SCNT клонированы разнообразные виды млекопитающих, включая обезьян [2]. Следует отметить, что данный метод имеет потенциальное применение в различных областях сельского хозяйства и медицины: производство генетически модифицированных животных [4]; размножение ценных и сохранение вымирающих видов животных; получение эмбриональных стволовых клеток [5], обладающих доказанным терапевтическим потенциалом. Несмотря на востребованность данной процедуры, эффективность eё остаётся на невысоком уровне [6–8]. Низкая результативность во многом объясняется тем, что SCNT включает в себя комплекс последовательных этапов, неоптимальные условия на любом из которых могут оказать существенное негативное влияние на развитие клонированных эмбрионов и потомства. Более того, в ряде случаев у животных-реципиентов выявляются нарушения формирования плаценты, а клонированное потомство нередко погибает от пороков развития, не совместимых с жизнью [9]. Основными стадиями технологии клонирования являются подготовка ооцитов и соматических клеток, энуклеация созревших ооцитов (цитопластов) с последующим получением комплексов ооцит–соматическая клетка, слияние цитопластов с кариопластами, активация полученных цитогибридов, культивирование эмбрионов и их трансплантация [10, 11]. В результате многочисленных исследований, проводимых с целью получения клонированных животных, накоплен большой опыт по совершенствованию технологии SCNT. Современные способы повышения эффективности данной процедуры включают оптимизацию каждого из её этапов [11–23]. Большинство публикаций отражают достижения при работе с ооцитами: модернизацию условий их созревания с целью замедления процессов старения, снижения апоптотических изменений и продукции активных форм кислорода [13, 21]; совершенствование техники энуклеации вплоть до роботизированной [19, 23]. Ведётся поиск способов восстановления цитопластов после энуклеации, в том числе путём инъекций цитоплазмы донорских ооцитов [14]. Ведутся также работы, направленные на регуляцию наследования митохондриальной ДНК [17]. Важное значение имеют исследования, целью которых является повышение имплантации клонированных эмбрионов как на эмбриологическом этапе [15], так и на этапе работы с животными-реципиентами. Отдельного внимания заслуживает тот факт, что условия, оптимальные для проведения SCNT одного вида животных, могут оказаться не вполне подходящими для другого вида.

Ключевым событием, определяющим эффективность SCNT, служит репрограммирование ядерного материала кариопласта цитоплазмой ооцита, в результате клетки приобретают свойства тотипотентности [24]. В процессе дифференцировки соматических клеток из стволовых происходит метилирование участков их генома, которые ответственны за связывание с транскрипционными факторами, обусловливающими поддержание плюрипотентного состояния [25]. Несмотря на стабильность эпигенетического статуса соматических клеток, в том числе терминально дифференцированных, метилирование не фиксируется необратимо, а может быть репрограммировано в эмбриональное состояние [26]. Известно, что процесс репрограммирования включает эпигенетическое и метаболическое ремоделирование, однако молекулярная регуляция, лежащая в его основе, все ещё остаётся не до конца изученной [27]. Потенциал к развитию эмбрионов, полученных в ходе клонирования, зависит от способности ядра соматической клетки к репрограммированию факторами цитоплазмы ооцита. В ходе изменений, наблюдающихся после слияния энуклеированного ооцита и донорской клетки, происходят разрушение ядерной оболочки кариопласта и преждевременная конденсация хромосом (что опосредовано высокой концентрацией содержащегося в цитоплазме ооцита фактора, способствующего созреванию (maturation-promoting factor, MPF) и представляющего собой комплекс p34^cdc2–циклин B [28–31]), а также последующая репликация ДНК. Замена ряда структурных компонентов хроматина на соответствующие компоненты ооцитарного происхождения, происходящая после слияния мембран кариопласта и цитопласта, необходима для удаления эпигенетических меток с ДНК, лежащего в основе репрограммирования донорских ядер в тотипотентное состояние [32–34]. Данные перестройки важны в том числе для деконденсации хроматина, необходимой для более эффективного связывания регуляторов транскрипции с их сайтами узнавания и более эффективного репрограммирования [35]. Закономерно, что интенсивность экспрессии и уровень фосфорилирования ключевых гистонов и шаперонов, степень ацетилирования и метилирования гистонов ооцита оказывают влияние на эффективность репрограммирования [36]. Чтобы повысить данный показатель, исследователи применяют различные подходы: использование ингибиторов деацетилаз [37, 38] и метилтрансфераз ДНК [39], индукцию гиперэкспрессии деметилаз [40], коррекцию аномального реметилирования ДНК [41]. Тем не менее одним из необходимых условий является координация клеточного цикла донорской соматической клетки и ооцита-реципиента, поскольку использование донорских клеток в неподходящей фазе может приводить к повреждению хромосом вследствие их преждевременной конденсации и несвоевременного разрушения ядерной оболочки [42, 43].

Согласно результатам исследований, проведённых с целью выявления оптимальной стадии клеточного цикла кариопласта, развитие эмбрионов отмечается при использовании соматических клеток в фазах G0, G1, G2 и M [44, 45]. Принимая во внимание тот факт, что в подавляющем большинстве экспериментов по получению клонированных животных в качестве клеток-реципиентов применяют ооциты в МII-фазе мейоза (по причине высокой активности MPF) [46] без предварительной активации, для переноса следует использовать клетки с диплоидным ядром в фазе G0/G1, ожидающие репликации [31, 47]. Действительно, результаты многочисленных исследований выявляют более высокую эффективность SCNT с применением в качестве кариопласта соматических клеток в данной фазе [48]. Перенос клеток в фазе G2 приводит к нарушению развития эмбрионов вследствие репликации генома, направляемой цитоплазмой ооцита; применение кариопласта в фазе S вызывает фрагментацию хромосом [42]. Если клеточный цикл цитоплазмы реципиента войдёт в фазу G2/M, когда кариопласт находится в фазе G1/S, может произойти инициация преждевременной конденсации хромосом и распада ядерной оболочки, в то время как синтез ДНК ещё не завершён, что в свою очередь приведёт к потере хромосом и анеуплоидии [49].

Остановка клеток в стадии G0/G1 достигается несколькими путями, наиболее распространёнными среди которых являются сывороточное голодание — культивирование соматических клеток в среде, содержащей экстремально низкую концентрацию фетальной бычьей сыворотки (ФБС) [50–53], контактное ингибирование (культивирование соматических клеток до монослоя с конфлюэнтностью, близкой к 100%) [52–55] или комбинация данных способов [43, 56]. Ряд исследователей применяют химические ингибиторы клеточного цикла [57, 58].

СЫВОРОТОЧНОЕ ГОЛОДАНИЕ

Сывороточное голодание — эффективный метод обратимой остановки соматических клеток в фазе G0/G1: согласно результатам многих исследований, культивирование соматических клеток в среде с экстремально низким содержанием ФБС (0,2–0,5%) ведёт к остановке 70–90% из них в данной фазе цикла [43, 58–64]. Этот показатель повышается при увеличении продолжительности культивирования клеток в условиях сниженного содержания ФБС [43, 59, 61, 65], причём в исследовании F. Sadeghian-Nodoushan с соавт. повышение количества овечьих клеток гранулёзы в фазе G0/G1 при культивировании их в течение 48 и 72 ч было статистически значимо выше, чем при 24-часовом культивировании в условиях сывороточного голодания [61]. Восстановление содержания сыворотки в среде до значений, достаточных для активной пролиферации (15–20%), приводит к явному увеличению количества клеток в фазах S и G2/M [59, 66].

Несмотря на широкое использование данного метода с целью синхронизации клеточного цикла кариопластов при проведении клонирования животных, необходимо принимать во внимание тот факт, что культивирование соматических клеток в среде с пониженным содержанием сыворотки в течение 48 ч ведёт к повреждению эндоплазматического ретикулума [67], а в течение 72 ч и более — к нарастанию в клетках продукции активных форм кислорода [57], изменению морфологии митохондрий [68], нарастанию фрагментации ДНК [59], повышению содержания апоптотических клеток [60, 62, 69]. Одним из последствий индукции апоптоза является изменение мембранного потенциала клеток [70], что может приводить к снижению эффективности электрослияния в ходе получения цитогибридов [71]. Тем не менее, согласно результатам работы [72], использование в качестве кариопласта аннексин-позитивных и аннексин-негативных клеток не оказывало значимого влияния на количество полученных цитогибридов.

О негативном эффекте применения кариопластов в стадии раннего апоптоза на эффективность SCNT свидетельствуют результаты, полученные Mdos S. Miranda с соавт.: согласно проведённому ими исследованию, применение аннексин-позитивных фибробластов в качестве донорских клеток при SCNT снижает потенциал к развитию полученных эмбрионов, ведёт к сокращению количества клеток в бластоцистах и повышает в них число апоптотических клеток [72]. В данном контексте следует отметить, что статистически значимое повышение уровня апоптоза при синхронизации цикла методом сывороточного голодания отмечается при культивировании соматических клеток в среде с пониженным содержанием ФБС в течение 48 и 72 ч, в то время как сывороточное голодание в течение 24 ч не вызывает значимого повышения количества апоптотических клеток в культуре по сравнению с клетками, культивируемыми в среде, содержащей 10% ФБС [61].

Существует мнение, что повреждения соматических клеток, вызванные культивированием в условиях сывороточного голодания, могут быть причиной низкого потенциала к развитию эмбрионов, полученных методом SCNT: в исследовании H.J. Park с соавт. выявлено, что количество эмбрионов свиней, развивающихся до стадии бластоцисты, при использовании кариопласта, синхронизированного методом сывороточного голодания в течение 72 ч, ниже по сравнению с другими методами остановки клеточного цикла [69]. В то же время, согласно результатам другого исследования [65], число коровьих бластоцист, полученных методом SCNT, при использовании кариопластов, культивированных 24 ч в среде, содержащей 0,5% ФБС, было выше по сравнению с соответствующим показателем при синхронизации фибробластов методом контактного ингибирования. Данные результаты подтверждают, что увеличение продолжительности культивирования кариопластов в условиях сывороточного голодания негативно отражается на их состоянии и, как следствие, снижает результативность SCNT.

КОНТАКТНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ

Вторым распространённым методом снижения пролиферативной активности, применяемым в настоящее время, является контактное ингибирование [54, 73–76]. В результате формирования плотного монослоя площадь контакта поверхности соседних клеток нарастает, вызывая ингибирование клеточного цикла, несмотря на достаточную концентрацию питательных веществ и факторов роста в культуральной среде [77]. Известно, что остановка клеток в фазе G0/G1 происходит вследствие повышения экспрессии р27Kip1 — ингибитора циклин-зависимых киназ (cyclin-dependent kinases, CDKs) [78], принимающих участие в делении клеток, а также посредством диссоциации циклина D из комплекса с CDK4 [79] с последующей её инактивацией. Важно отметить, что при контактном ингибировании снижается уровень внутриклеточной продукции активных форм кислорода по сравнению с клетками, растущими в условиях более низкой плотности [80], и отмечается активация PGC1α — ключевого регулятора энергетического обмена, участвующего в снижении концентрации активных форм кислорода и защите клеток от окислительного стресса [81]. Применение данного метода позволяет остановить 65–84% клеток на стадии G0/G1 цикла [61–63]. Следует отметить, что в соматических клетках, синхронизированных способом контактного ингибирования, уровень апоптоза соизмерим с таковым в активно делящихся клетках [61, 63]. Фактором, ограничивающим применение данного способа, является то, что в ряде случаев не удаётся достичь конфлюэнтности монослоя, достаточной для возникновения контактного ингибирования, поскольку отдельные культуры клеток, используемых в качестве кариопласта при процедуре SCNT (например, после редактирования генома), могут обладать невысокой пролиферативной активностью.

КОМБИНИРОВАННЫЙ СПОСОБ

По мнению ряда исследователей, культивирование соматических клеток до монослоя с последующей сменой культуральной среды на среду с пониженным содержанием ФБС является способом повышения числа клеток на стадии G0/G1 цикла. Так, согласно результатам L. Ma и соавт., количество овечьих фибробластов в данной фазе было статистически значимо выше при комбинированном способе синхронизации по сравнению с группами, синхронизированными методом контактного ингибирования и сывороточного голодания: 80,07% против 66,82% и 71,24% соответственно [82]. В то же время исследование N.A. Gómez и соавт., в котором сравнивали способы синхронизации клеточного цикла бычьих фибробластов (сывороточного голодания, контактного ингибирования и комбинированного метода), не выявило значимых различий в количестве фибробластов в фазе G0/G1 [65]. Разногласия в результатах можно объяснить как неодинаковой продолжительностью культивирования клеток в заданных условиях, так и, возможно, разной видовой принадлежностью животных, от которых получены клетки, поскольку существуют данные, подтверждающие различия в восприимчивости соматических клеток, полученных от разных видов животных, к одинаковым методам синхронизации цикла [83, 84].

Эффективность синхронизации соматических клеток во многом определяется также типом клеток, используемых в качестве кариопласта: результаты исследования S. Yagcioglu и соавт., проведённого на овцах, показывают, что фетальные фибробласты и фибробласты, полученные от взрослого животного, по-разному реагируют на синхронизацию клеточного цикла [63].

ХИМИЧЕСКИЙ СПОСОБ СИНХРОНИЗАЦИИ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА КАРИОПЛАСТОВ

Клеточный цикл — однонаправленный процесс, в течение которого клетка последовательно проходит разные его периоды, чётко разграниченные морфологически и биохимически, без их пропуска или возврата к предыдущим стадиям. Общепринято разделение цикла на интерфазу, включающую синтетический (S) период, когда происходит удвоение хромосом; и интервалы, отделяющие его от деления: периоды G1 и G2. В фазе G1 синтезируются белки, амплифицируются органеллы, увеличивается размер клетки, на стадии G2 осуществляются анализ корректности репликации ДНК и подготовка к митозу. Клетки в фазе G1 могут выйти из клеточного цикла и войти в фазу G0 — обратимое состояние покоя [85]. Продвижение клетки по фазам клеточного цикла регулируется способностью активированных CDKs фосфорилировать специфичные субстраты, приводя к их активации, инактивации и локализации в клетке. Активация CDKs происходит при связывании их с циклинами, концентрация и активность которых определяется фазой клеточного цикла [85, 86].

Исходя из понимания процессов, лежащих в основе продвижения клетки по фазам клеточного цикла, для остановки их в той или иной фазе применяют ингибиторы CDKs (росковитин*, бутиролактон I*, статины: ловастатин*, мевастатин*), ингибиторы репликации ДНК (афидиколин*, мимозин*, статины), полимеризации микротрубочек (нокодазол*, колхицин) [87], синтеза необходимых белков (циклогексимид*) [88]. Главными принципами синхронизации цикла соматических клеток для SCNT служат его обратимость и отсутствие токсического эффекта, в связи с чем необходимо принимать во внимание, что следствием воздействия ряда ингибиторов помимо остановки клеток в необходимой фазе цикла нередко является индукция апоптоза. В табл. 1 [57–61, 63, 69, 89–93] представлены сведения о химических ингибиторах клеточного цикла, применяемых для синхронизации донорских клеток при SCNT сельскохозяйственных животных.

Таблица 1. Ингибиторы, применяемые для синхронизации клеточного цикла кариопластов при проведении соматического клонирования сельскохозяйственных животных

Table 1. Inhibitors used for synchronizing the karyoplasts cell cycle during somatic cloning of farm animals

Согласно данным литературы, среди препаратов для синхронизации соматических клеток, применяемых в качестве кариопласта при SCNT, наиболее часто авторы выбирают росковитин. Данный препарат способствует обратимой остановке клеток в фазе G0/G1 путём ингибирования CDK1, CDK2, CDK5, CDK7, CDK9 и MPF [65, 94–96]. Ряд исследований показали, что количество фибробластов в фазе G0/G1 при добавлении росковитина в среду культивирования соизмеримо с соответствующими показателями при синхронизации клеток методом контактного ингибирования [60, 63, 69]. Проведённое N.L. Selokar с соавт. исследование демонстрирует более высокую концентрацию фетальных фибробластов в стадии G0/G1 при культивировании их в течение 24 ч в среде, содержащей 30 мкМ росковитина, по сравнению с соответствующими показателями в группах, где синхронизация цикла осуществлялась методами контактного ингибирования или сывороточного голодания [92]. Данный показатель был соизмерим с таковым при совместном применении методов контактного ингибирования и сывороточного голодания.

Относительно протективного воздействия росковитина на клетки существуют противоречивые данные: добавление его в среду культивирования овечьих, фетальных свиных и фетальных фибробластов приводило к снижению числа клеток в стадии апоптоза [60, 63, 69], однако инкубация фибробластов пумы в среде, содержащей 15 мкМ росковитина, не отражалась статистически значимо на данном показателе [62]. Обращает на себя внимание тот факт, что использование фибробластов, культивируемых в присутствии росковитина, в качестве кариопластов при проведении SCNT приводило к увеличению относительного содержания эмбрионов, достигших стадии бластоцисты [69, 92]. В исследовании S. Hwang и соавт. число супоросных свинок-реципиентов было больше в группе, где в качестве донорских клеток при SCNT использовали фибробласты, культивируемые в присутствии росковитина [91]. Таким образом, согласно результатам большинства исследований, применение данного ингибитора для остановки соматических клеток в фазе G0/G1 клеточного цикла не обладает преимуществами по сравнению с контактным ингибированием и сывороточным голоданием. В то же время имеющиеся данные о протекторном воздействии росковитина на соматические клетки и более высоком количестве эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты, при применении кариопластов, культивированных в его присутствии, оправдывает использование данного ингибитора в качестве способа синхронизации соматических клеток при SCNT.

Рапамицин — макролид бактериального происхождения, способный путём ингибирования мишени mTOR (mammalian target of rapamycin) регулировать рост клеток, контролировать трансляцию белков, энергетический метаболизм и формирование цитоскелета [97]. Рапамицин поддерживает физиологию клеток путём индукции аутофагии, необходимой для своевременного удаления состаренных белков, повреждённых органелл, токсичных продуктов метаболизма и пероксисом из клетки [98, 99]; он способен снижать экспрессию циклина D1 [100–102] и генов, ответственных за синтез транспортеров глюкозы и аминокислот [58], ингибируя таким образом пролиферацию клеток и останавливая их в фазе G0/G1. Согласно результатам исследования H. Hyun с соавт., культивирование фибробластов свиней в среде с 1 мкМ рапамицина в течение трёх дней приводило к повышению концентрации клеток в фазе G0/G1 до 93,6% по сравнению с 61% в контрольной группе. Авторы отмечают, что при использовании данных клеток в качестве кариопласта число подробившихся эмбрионов и эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты, было статистически значимо выше, чем в контрольной группе, в то время как фрагментация ДНК была менее выражена, а экспрессия генов, связанных с развитием (CDX2, CDH1), напротив, была выше в группе рапамицина по сравнению с контрольной [58]. Исследование, проведённое на буйволах, показало схожие результаты: содержание фибробластов в стадии G0/G1 составило 90% при культивировании в среде, содержащей рапамицин; количество фибробластов, имеющих нормальный кариотип, было больше, а число апоптотических клеток и уровень продукции активных форм кислорода, напротив, были ниже по сравнению с группой клеток, подвергавшихся действию сывороточного голодания [57].

В исследовании на фетальных фибробластах поросят [59] убедительно показана способность бутиролактона I останавливать клетки в фазе G0/G1 цикла путём ингибирования CDK1, CDK2, CDK5, CDC2 [103, 104]. Относительно влияния данного препарата на жизнеспособность клеток имеющиеся сведения противоречивы: так, при исследовании действия бутиролактона I на опухолевые клетки показана его индуцирующая апоптоз активность [105, 106], в то время как исследование действия данного препарата на гранулярные нейроны не выявило снижения их жизнеспособности [107].

Аминокислота растительного происхождения мимозин обладает ингибирующим эффектом в отношении инициации репликации ДНК и способна дозозависимо останавливать клетки в фазе G1 или S клеточного цикла. Применение мимозина в концентрации 0,5 мМ останавливало соматические клетки в фазе G1, в то время как более низкие концентрации (0,1–0,2 мМ) не предотвращали вход в фазу S [108, 109]. Согласно результатам проведённых исследований, добавление мимозина в среду культивирования позволяет остановить в фазе G0/G1 85,2% клеток гранулёзы овец [61] и 85,7% клеток гранулёзы свиней [93], что подтверждает его эффективность в синхронизации кариопластов при проведении SCNT.

Среди ингибиторов клеточного цикла, в отношении которых получены противоречивые данные, следует отметить афидиколин и нокодазол. Афидиколин — обратимый ингибитор ДНК-полимераз. Считается, что он останавливает клетки в ранней S-фазе [110], однако, согласно результатам проведённого W.A. Kues с соавт. исследования, культивирование свиных фетальных фибробластов в среде, содержащей афидиколин, привело к тому, что концентрация клеток в фазе G0/G1 составила 82%, в то время как в фазе S остановились лишь 3,9% фибробластов [59]. Кроме того, обращает на себя внимание противоречие имеющихся данных об ингибирующей активности нокодазола. Согласно результатам F. Sadeghian-Nodoushan с соавт., доля клеток гранулёзы овец в стадии G0/G1 при культивировании их в присутствии нокодазола составила 74,6% [61], в то время как в другом исследовании [111] последовательное применение афидиколина и нокодазола для синхронизации клеточного цикла свиных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток позволило остановить 77,6% клеток на 2-й день культивирования и 72,2% — на 3-й день на стадии G2/M, а количество клеток в фазе G0/G1 составило лишь 9,4 и 11,3% на 2-й и 3-й дни соответственно. В данном контексте следует отметить, что механизмом действия нокодазола служит нарушение полимеризации микротрубочек, и это способствует остановке клеток в фазе G2/M [112]. Таким образом, данный препарат не может быть рекомендован для синхронизации соматических клеток с целью их использования в качестве кариопласта при проведении SCNT.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Успех процедуры клонирования наряду с физиологическим состоянием и жизнеспособностью ооцита-реципиента во многом определяет потенциал к репрограммированию ядерного материала соматических клеток. Доказано, что наибольшей способностью к репрограммированию обладают кариопласты на стадии G0/G1 клеточного цикла, в связи с чем выбор оптимальных условий культивирования соматических клеток, обеспечивающих высокий уровень синхронизации их клеточного цикла, является одним из направлений повышения результативности соматического клонирования. Несмотря на разнообразие существующих методов остановки клеток в фазе G0/G1 цикла, в настоящее время среди исследователей нет единого мнения о наиболее оптимальном способе. При выборе способа синхронизации клеточного цикла следует обращать внимание на вид животного, от которого получены соматические клетки; допустимую продолжительность культивирования клеток в условиях, направленных на его остановку; влияние выбранного метода на жизнеспособность клеток и индукцию в них апоптотических изменений. Изучение влияния химических ингибиторов на клеточный цикл кариопластов зачастую ограничивается лишь оценкой содержания клеток в определённой фазе цикла, в то время как наибольший исследовательский интерес представляют сведения о количестве полученных эмбрионов, их приживляемости и рождении жизнеспособного потомства.

* здесь и далее — препарат не зарегистрирован в Государственном реестре лекарственных средств РФ.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (Государственное задание № FGGN-2024-0014).

Конфликт интересов. Автор декларирует отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This work was supported by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (State assignment FGGN-2024-0014).

Competing interests. The author declares that there are no competing interests.

Об авторах

Анастасия Сергеевна Жукова

Автор, ответственный за переписку.
Email: anastasia.s.belyaeva@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1155-014X
SPIN-код: 4590-3971
Scopus Author ID: 57200071274

канд. биол. наук 

Список литературы

Дополнительные файлы