Роль мелатонина в формировании Т-хелперных субпопуляций, одновременно синтезирующих маркёры Th17 и Treg

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Гормон мелатонин, секретируемый в основном шишковидной железой, обладает широким спектром функций, в том числе способностью эффективно регулировать активность клеток иммунной системы [1–3]. Важными мишенями действия мелатонина в иммунной системе являются Т-лимфоциты, продуцирующие IL-17, — Th17, и регуляторные Т-клетки — Treg: обе субпопуляции имеют рецепторы для мелатонина — как мембранные (МТ1/МТ2), так и внутриклеточный (RORα) — и находятся под непосредственным контролем гормона [4, 5]. Клетки Th17 играют важную роль в защите организма от экстраклеточных патогенов, в развитии воспаления, в том числе аутоиммунного, а клетки Treg, выполняя реципрокные функции, участвуют в предупреждении развития аутоиммунных, аллергических процессов и реакций отторжения трансплантата [6–10]. Однако данные субпопуляции крайне неоднородны и обладают высокой пластичностью. Так, дифференцированные Th17 способны трансформироваться в IFNγ⁺Th17⁺-клетки, так называемые Th17/Th1-клетки [11], или в Treg [12], тогда как регуляторные Т-лимфоциты при поляризующих условиях трансдифференцируются в IL-17-продуцирующие клетки [13, 14]. Механизмы пластичности наивных и зрелых клеточных популяций в полной мере не изучены, но этот процесс очень важен, поскольку именно неклассическим популяциям Th17 и Treg отводят в настоящее время ведущую роль в патогенезе различных заболеваний.

Цель исследования — оценка роли мелатонина в формировании Т-хелперных субпопуляций, одновременно синтезирующих маркёры Th17 и Treg.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использовали лейкоциты здоровых небеременных женщин (n=10, средний возраст — 38,30±1,95 года). От всех доноров получали добровольное информированное согласие на участие в исследовании, которое было одобрено Комитетом по этике Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН — филиала Пермского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН (протокол № 15 от 20 мая 2022 г.) и проведено в соответствии с положениями Хельсинкской декларации (2013) об исследованиях с участием человека.

Лейкоциты выделяли из гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла–верографина (1,077 г/см³; Pharmacia, Швеция). Из фракции мононуклеарных клеток получали Treg-обогащённую суспензию (CD4⁺CD25⁺-Т-лимфоциты) методом иммуномагнитной сепарации (R&D Systems, США). Фракционированные Т-клетки (1×10⁶ кл./мл) культивировали в течение 48 ч в среде RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Serva, Германия), 1 мМ HEPES (Sigma-Aldrich, США), 2 мМ L-глутамина (Serva, Германия) и 40 ед./мл гентамицина (Pharmacia, Швеция) при 37 °С и 5% СО₂ в двух вариантах: без активатора (спонтанный вариант) и в условиях поликлональной активации (система для активации на основе моноклональных антител к CD3/CD28; Invitrogen, США).

Синтез клетками транскрипционных факторов RORγt (маркёра дифференцировки Th17) и FOXP3 (маркёра Treg), а также внутриклеточного IL-17 определяли через 48 ч культивирования проточной цитометрией (CytoFLEX S; Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител: анти-CD4-FITC, анти-RORγt-PerCP, анти-FOXP3-PE и анти-IL-17/IL-17A-PerCP (Biolegend, Novus Biologicals, R&D Systems, США). Оценивали как количество Т-клеток, несущих данные маркёры, так и среднюю интенсивность свечения в условных единицах (mean fluorescence intensity, MFI), отражающую уровень конкретного маркёра в клетках.

Мелатонин (Sigma-Aldrich, США) вносили в культуру Т-клеток за 30 мин до активации в концентрациях, соответствующих фармакологическим уровням гормона в крови — 0,5 и 5 нг/мл [15]. Вклад мембранных мелатониновых рецепторов в реализацию эффектов гормона определяли с использованием соответствующих антагонистов — неселективного (лузиндол — для МТ1/МТ2) и селективного (4-P-PDOT – для МТ2) [16]. Их вносили в интактную и стимулированную (CD3/CD28) культуру Т-клеток за 1 ч до активации.

Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флуоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли: Mouse IgG2B-PerCP и Mouse IgG2B-PE (R&D Systems, США). Жизнеспособность лимфоцитов, определяемая в тесте с эозином после 48 ч культивирования, составляла 95–98%.

Статистический анализ выполняли с применением парного t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование in vitro показало снижение содержания классических клеток Treg (CD4⁺FOXP3⁺-Т-клеток) в культуре интактных лимфоцитов в присутствии мелатонина (табл. 1), хотя в условиях поликлональной активации эффект гормона не выявлен. При этом блокада мембранных рецепторов для мелатонина отменяла супрессивный эффект гормона в отношении классической субпопуляции клеток Treg (количество CD4⁺FOXP3⁺-Т-клеток, спонтанный вариант: 4,510±0,847% на фоне лузиндола, 3,810±0,648% на фоне лузиндола и 0,5 нг/мл мелатонина, р >0,05; 4,85±1,05% на фоне 4-P-PDOT; 4,350±0,753% на фоне 4-P-PDOT и 0,5 нг/мл мелатонина, р >0,05). В отношении классической субпопуляции клеток Th17 (CD4⁺RORγt⁺-Т-клеток) статистически значимого действия мелатонина не обнаружено (см. табл. 1), хотя также имелась тенденция к снижению. Тем не менее баланс CD4⁺RORγt⁺/CD4⁺FOXP3⁺-Т-клеток в присутствии гормона сдвигался в направлении клеток Th17 (см. табл. 1). Этот эффект был подтверждён и ростом соотношения уровня соответствующих транскрипционных факторов в клетке, который оценивали по средней интенсивности свечения (MFI RORγt/MFI FOXP3, спонтанный вариант: 0,615±0,103 у.е. — контроль, 1,010±0,260 у.е. — на фоне 0,5 нг/мл мелатонина, р >0,05; 1,070±0,202 — на фоне 5,0 нг/мл мелатонина, р <0,05).

 

Таблица 1. Влияние мелатонина на дифференцировку клеток Th17 и Treg in vitro

Экспериментальные условия		Контроль	Концентрация мелатонина в культуре
			0,5 нг/мл	5,0 нг/мл
Количество CD4+RORγ	Спонтанный вариант	1,990±0,388	1,520±0,378	1,390±0,245
	Анти-CD3/CD28	13,70±3,82	12,80±2,72	14,20±3,72
Количество CD4+FOXP3+- Т-клеток, %	Спонтанный вариант	6,260±0,871	3,380±0,725*	4,470±0,926
	Анти-CD3/CD28	26,60±5,31	23,90±3,46	27,20±5,41
Количество CD4+RORγ	Спонтанный вариант	0,538±0,084	2,240±0,647*	1,350±0,482
	Анти-CD3/CD28	8,92±3,34	7,96±1,68	9,39±2,55
Соотношение CD4+RORγ	Спонтанный вариант	0,334±0,054	0,589±0,150**	0,516±0,142
	Анти-CD3/CD28	0,596±0,116	0,679±0,170	0,685±0,184

* р <0,05 при сопоставлении с контролем; **р=0,05 при сопоставлении с контролем.

 

Более детальный анализ показал, что на уровне конкретного донора эффекты мелатонина в отношении CD4⁺RORγt⁺- и CD4⁺FOXP3⁺-Т-клеток, как правило, однонаправленные, разница только в интенсивности воздействия: ингибирующее действие было выше в отношении FOXP3, а стимулирующее — для RORγt (рис. 1). По-видимому, мелатонин в данном случае регулирует ранние этапы дифференцировки клеток Th17 и Treg, общие для обеих субпопуляций [17]. В итоге преимущественное развитие получают клетки Th17. Эти результаты согласуются с полученными нами ранее данными для нефракционированной культуры интактных CD4+-Т-лимфоцитов [5, 18].

 

Рис. 1. Эффекты мелатонина в отношении дифференцировки клеток Th17 и Treg.

 

Важно отметить, что в культуре интактных Т-лимфоцитов мелатонин в фармакологической концентрации 0,5 нг/мл существенно увеличивал количество CD4⁺-T-клеток, одновременно синтезирующих маркёры как Treg (FOXP3), так и Th17 (RORγt) (см. табл. 1, рис. 2).

 

Рис. 2. Роль мелатонина в дифференцировке Т-лимфоцитов, одновременно несущих маркёры клеток Th17 и Treg.

 

Более того, соотношение уровней транскрипционных факторов RORγt/FOXP3, оцениваемых по средней интенсивности свечения, в таких клетках было повышено в присутствии гормона (MFI RORγt/MFI FOXP3 в CD4⁺RORγt⁺FOXP3⁺-Т-клетках, спонтанный вариант: 0,514±0,078 у.е. — контроль, 1,260±0,339 у.е. — на фоне 0,5 нг/мл мелатонина, р <0,05; 0,463±0,062 у.е. — на фоне 5,0 нг/мл мелатонина, р >0,05). Данный эффект подтверждался также присутствием в соответствующих пробах IL-17-продуцирующих лимфоцитов, несущих маркёр регуляторных клеток FOXP3, и тенденцией к повышению количества этих клеток на фоне мелатонина (количество CD4⁺IL-17⁺FOXP3⁺-Т-клеток, спонтанный вариант, n=4: 0,723±0,161% — контроль, 3,240±0,941% — на фоне 0,5 нг/мл мелатонина, р >0,05; 1,670±0,441% — на фоне 5,0 нг/мл мелатонина, р >0,05). Строго говоря, такая неклассическая субпопуляция может быть результатом как редифференцировки Treg или Th17 [19], так и первичной дифференцировки наивных CD4⁺-Т-клеток, также присутствующих в культуре, однако, учитывая показанное выше мелатонин-зависимое снижение уровня CD4⁺FOXP3⁺-Т-клеток, речь идёт, по-видимому, о первом варианте, т.е. о приобретении регуляторными Т-клетками маркёров и свойств провоспалительной субпопуляции Th17.

Способность субпопуляции клеток Treg дифференцироваться в IL-17-продуцирующие клетки in vitro продемонстрирована и ранее в работе H.J.P.M. Koenen с соавт. [13]: она существенно усиливалась в условиях провоспалительного окружения и была ассоциирована с эпигенетической модификацией, в частности с деацетилированием в FOXP3-домене. Наряду с этим CD4⁺IL-17⁺FOXP3⁺-Т-лимфоциты были выявлены in vivo, причём заметное повышение содержания данной субпопуляции было отмечено у пациентов с органоспецифичными аутоиммунными патологиями, такими как склеродермия [20] и псориаз [21]. Приведённые выше данные свидетельствуют о том, что мелатонин в фармакологических концентрациях может вносить вклад в этот процесс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведённое исследование позволяет сделать следующие выводы:

1. мелатонин в концентрации, соответствующей его уровню в периферической крови при фармакологическом использовании, способен стимулировать дифференцировку Т-лимфоцитов, одновременно несущих маркёры Т-хелперных субпопуляций Th17 и Treg;
2. эффекты гормона в отношении классических субпопуляций Th17 и Treg, как правило, однонаправленны, но различны по интенсивности воздействия, что в итоге приводит к сдвигу баланса в направлении клеток Th17;
3. в реализации выявленных эффектов мелатонина частично задействованы мембранные рецепторы МТ1/МТ2.

Выявленные эффекты мелатонина в отношении как классических субпопуляций Th17 и Treg, так и клеток, одновременно синтезирующих ключевые маркёры Т-хелперных субпопуляций Th17 и Treg, указывают на способность гормона сдвигать баланс в направлении провоспалительной субпопуляции клеток Th17, что может вносить вклад в развитие воспаления при различных патологических ситуациях.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда и Пермского края в рамках научного проекта № 22-25-20121.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Об авторах

Елена Михайловна Куклина

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН — филиал Пермского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН

Email: ibis_07@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2173-2724
SPIN-код: 7871-8575

д.б.н.

Россия, Пермь

Наталья Сергеевна Глебездина

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН — филиал Пермского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: glebezdina_n@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9891-0509
SPIN-код: 3985-4887

к.б.н.

Россия, Пермь

Ирина Валерьевна Некрасова

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН — филиал Пермского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН

Email: nirina5@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6706-5912
SPIN-код: 8706-1904

к.б.н.

Россия, Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы