Введение в культуру in vitro зелёных неодревесневших черенков дуба черешчатого (Quercus robur L.) разных возрастных групп

Полный текст

Введение. Дуб черешчатый является основной лесообразующей породой таких биоценозов, как дубравы. Дубовые леса России в основном располагаются в европейской (3,52 млн. га) и дальневосточной частях (2,46 млн. га) [1]. Однако представители рода Quercus подвержены множеству негативных факторов, среди которых: большое количество паразитирующих насекомых, ухудшение санитарного состояния, снижение общей и удельной продуктивности дубовых биоценозов; снижение репродуктивной способности (т. е. увеличение промежутков между урожайными годами и снижение обилия урожаев); синдром усыхания (отмирания) дуба и т. д. [2, 3]. Эти проблемы приводят к сокращению общей площади дубовых биоценозов. В связи с длительным сокращением площадей естественных дубрав разработаны федеральные программы их сохранения и изучения, причём эта проблема характерна не только для России [3–5]. Таким образом, малая эффективность традиционного размножения дуба черешчатого на фоне снижения общей и удельной продуктивности дубрав является объективной проблемой для всего мира и России в частности. Решить проблему можно благодаря применению современных методов биотехнологии, например, культуры ткани in vitro. Данный метод отличается внесезонностью проведения исследований, ювенилизацией посадочного материала, высокой эффективностью. Однако ключевым фактором является оздоровление получаемого посадочного материала. Кроме того, культура ткани растений является эффективным инструментом сохранения биологических ресурсов, а полученные стерильные экспланты могут при необходимости быть использованы для ещё более надёжного криодепонирования, создания «банков» ценных генотипов [6]. Частным случаем метода культуры ткани in vitro является клональное микроразмножение [7–8].

Проблематика клонального микроразмножения дуба черешчатого и введение этого растения в культуру in vitro освещена в работах Г. Л. Бутовой [9–10], В. И. Белоус [11–12], С. Ю. Белоус и Ю. Коломиец [13], А. А. Марчук и В. И. Кирилюк [14], В. Г. Краснова с соавт. [15], G. Vengadesan, Р. М. Pijut [16], Е. Gatti, Е. Sgarbi [17], D. Civinova, Z. Sladky [18], А. Grigorescu et al. [19] и др. Основной проблемой является стабильное получение стерильной хорошо растущей культуры эксплантов дуба черешчатого. Причина – значительная доля заражения во взрослых растениях (до 92 %) в зависимости от вида, ареала произрастания и т. д. [5]. Таким образом, разработка эффективных и вариативных методов введения в культуру in vitro биоматериала дуба черешчатого является актуальным направлением в лесной биотехнологии.

При введении в культуру in vitro растительные экспланты проходят процедуру поверхностной стерилизации, при этом используются различные дезинфицирующие средства, способные эффективно удалять с поверхности эксплантов бактериальные и грибные инфекции. Например, сотрудники ВНИИЛГИС-биотех смогли получить 80–100 % жизнеспособных асептических эксплантов при использовании 0,02 % раствора мертиолята в течение 10 мин. [20].

Цель настоящего исследования – разработать методику получения первичных эксплантов дуба на основе зелёных черенков.

Задачи исследования – 1) оценить влияние минерального состава питательной среды и обработки эксплантов аскорбиновой кислотой на эффективность введения эксплантов дуба разных возрастных групп; 2) определить воздействие питательной среды и режима стерилизации на экспланты дуба на ювенильной, имматурной и генеративной стадиях развития.

Объекты и методы исследования. Объектами исследования были выбраны черенки дуба черешчатого Quercus robur L. разных возрастных групп – ювенильной, имматурной и генеративной. Источником ювенильного биоматериала послужили сеянцы дуба черешчатого возрастом 2–2,5 мес., высотой до 20–25 см, имматурного – растения высотой 65–70 см, генеративного – около 10 м высотой. Все группы растений были разнесены по местоположению – сеянцы были выращены в комнатных условиях, имматурный биоматериал был получен в деревне Малые Мазары (Республика Марий Эл), а генеративный биоматериал был получен в городских условиях – микрорайон Дубки (г. Йошкар-Ола).

Исследование выполнено на базе Центра коллективного пользования «Экология, биотехнологии и процессы получения экологически чистых энергоносителей» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Поволжский государственный технологический университет». Методы исследования были основаны на общепринятых классических приёмах работы с культурами изолированных тканей и органов растений [8], в результате которых были получены жизнеспособные экспланты дуба черешчатого, а также проведены корреляционно-регрессионный и дисперсионный анализы.

1. Получение жизнеспособных эксплантов дуба черешчатого на ювенильной фазе онтогенеза. Для проведения исследования в январе 2023 года были посеяны жёлуди дуба черешчатого (в кассеты), появившиеся в феврале 2023 года проростки были пересажены в отдельные ёмкости большего объёма и доращивались до возраста 2–2,5 месяцев. Для посева и пересадки использовали садовую почву, обработанную в целях обеззараживания раствором марганцево-кислого калия (0,5 %). Двухмесячные растения затем использовали в качестве источника эксплантов: зелёные побеги срезали до первой розетки в пять листьев, после чего разделяли на фрагменты длиной 3–4 см, удаляли все листовые пластинки (таким образом, чтобы не повредить пазушные почки) и погружали в водопроводную воду на 60 мин. Затем экспланты очищали от механических загрязнений с помощью губки и моющего средства «Ника» (5 мл средства на 500 мл воды), промывали в проточной водопроводной воде в течение 5 мин., а затем трёхкратно промывали в дистиллированной воде.

Дальнейшие операции проводили в условиях ламинар-бокса. Экспланты помещали в 3 % раствор стерилизующего средства Лизоформин 3000 на 5 мин., после чего двукратно промывали в стерильной дистиллированной воде в течение 5 мин., а затем (в зависимости от варианта опыта, табл. 1) помещали либо в стерильную дистиллированную воду на 20 мин., либо в стерильный раствор аскорбиновой кислоты концентрацией 100 мг/л. Затем на эксплантах, для удаления повреждённых стерилизующим веществом тканей, обновляли все срезы. После этого экспланты переносили на агаризованную питательную среду, либо по прописи MS (контроль) [21], либо по прописи WPM [22] в зависимости от варианта опыта (табл. 1). Во все варианты питательных сред добавлялся регулятор роста – бензиламинопурин (БАП) в концентрации 1 мг/л. Культивирование вели в условиях световой комнаты при температуре 23–24 °C. Подсчёт заражённых, жизнеспособных и не жизнеспособных эксплантов проводили после одной недели культивации.

 

Таблица 1. Схема эксперимента по стерилизации ювенильных эксплантов дуба черешчатого при обработке аскорбиновой кислотой

Table 1. Scheme of the experiment on sterilization of juvenile explants of English oak when treated with ascorbic acid

№	Состав питательной среды	Наличие обработки эксплантов аскорбиновой кислотой, да/нет
1	MS 1 БАП, контроль	нет
2	WPM 1 БАП	нет
3	WPM 1 БАП	да

 

2. Получение жизнеспособных эксплантов дуба черешчатого на имматурной и генеративной фазах онтогенеза. Для проведения исследования использовали свежесрезанные (не более суток до введения в культуру in vitro) зелёные побеги растущего дуба черешчатого в период с начала по конец мая 2023 года. Зелёные побеги дуба черешчатого в имматурной фазе онтогенеза из-за своей малочисленности были вынесены в отдельный вариант. Зелёные побеги дуба черешчатого подготавливали аналогично эксперименту 1 (получение жизнеспособных эксплантов на ювенильной фазе онтогенеза).

Дальнейшие операции проводили в условиях ламинар-бокса. Экспланты помещали в 3 % раствор стерилизующего средства Лизоформин 3000. Время экспозиции варьировалось от 3 мин. 30 сек. до 5 мин. с шагом в 30 сек. для черенков, взятых со взрослого растения, и только 5 мин. для частично одревесневших зелёных черенков и имматурных. После этого экспланты во всех вариантах промывали, обрабатывали аскорбиновой кислотой и культивировали аналогично эксперименту 1. Контролем выступал вариант среды по прописи MS [21] с добавлением БАП в концентрации 1 мг/л.

Результаты и их обсуждение. Во всех вариантах эксперимента по введению в культуру зелёных черенков двухмесячных саженцев дуба черешчатого была достигнута высокая стерильность эксплантов – заражение проявилось лишь в одном варианте с показателем 3,57 % (табл. 2). Большое количество жизнеспособных эксплантов было получено на питательной среде по прописи WPM – от 96,43 до 100 % [22]. Наибольшая доля не жизнеспособных растений приходится на вариант опыта с питательной средой по прописи MS – 22,22 % [21]. Оценить влияние обработки раствором аскорбиновой кислоты эксплантов на жизнеспособность растений не удалось (относительная доля жизнеспособных эксплантов между вариантами на среде WPM отличалась незначительно). Однако в процессе выполнения эксперимента было замечено, что возникновение потемнения эксплантов в варианте с аскорбиновой кислотой значительно замедлялось (до 1 сут. вместо 30–60 секунд после обновления срезов в вариантах без обработки). Возможно, лучших результатов можно было бы достичь при включении аскорбиновой кислоты в состав питательной среды, как в опыте María José Cernadas et al. [3]. После проведения подсчётов (спустя одну неделю культивирования) экспланты переносили на свежую питательную среду и вели культивирование дальше. В результате большинство эксплантов образовали зелёные побеги, а также каллус на местах срезов (рис. 1). Образование каллуса в вариантах опыта с концентрацией бензиламинопурина 1 мг/л также наблюдалось в опыте Quinsheng Li et al. [4].

 

Таблица 2. Стерилизация ювенильных эксплантов дуба черешчатого при обработке аскорбиновой кислотой

Table 2. Sterilization of juvenile explants of English oak when treated with ascorbic acid

№	Вариант	Всего эксплантов, шт.	Заражённые экспланты, %	Стерильные экспланты, %
				жизнеспособные	не жизнеспособные
1	MS 1 БАП, 5 мин., без аск. к-ты, контроль	27	0	77,78	22,22
2	WPM 1 БАП, 5 мин., без аск. к-ты	26	0	100	0
3	WPM 1 БАП, 5 мин., с аск. к-той	28	3,57	96,43	0

 

Рис. 1. Эксплант дуба черешчатого спустя месяц культивации, с каллусом на срезе и зелёными побегами

Fig. 1. Explant of English oak after one month of cultivation, with callus at the cut edge and green shoots

 

В эксперименте по получению жизнеспособных эксплантов дуба черешчатого на имматурной и генеративной фазах онтогенеза были получены данные о влиянии минерального состава питательных сред и экспозиции в стерилизующем средстве Лизоформин 3000 на жизнеспособность эксплантов из зелёных неодревесневших черенков дуба черешчатого (табл. 3). Наибольшее количество жизнеспособных стерильных эксплантов на генеративной фазе было получено на питательной среде по прописи WPM – от 70,59 до 100 % по сравнению с 50 % на питательной среде по прописи MS. При этом наибольшее число жизнеспособных стерильных эксплантов получено при использовании экспозиции от 4 мин. 30 сек. (100 %). Схожий результат был получен при стерилизации ювенильного материала в эксперименте В. Г. Краснова и др. [15], где наибольшее число жизнеспособных эксплантов было получено при 4 мин. стерилизации в 3 % растворе лизоформина. Появление доли не стерильных эксплантов в варианте опыта с экспозицией в 5 мин. может быть обусловлено наличием эндогенной инфекции. По вариантам опыта с эксплантами, взятыми с растения в генеративной фазе, проведён корреляционно-регрессионный анализ (рис. 2), результаты дисперсионного анализа приведены в табл. 4. После проведения подсчёта жизнеспособные экспланты переносили на свежую питательную среду и продолжали культивацию, при этом замечено образование побегов (рис. 3). Экспланты, взятые с растения в имматурной фазе онтогенеза, показали 100 % жизнеспособность при выбранном режиме стерилизации, что аналогично таковым показателям при таком же режиме стерилизации и для зелёных неодревесневших черенков, взятых с взрослого растения, и для эксплантов, взятых с саженцев. Высокий показатель заражённости частично одревесневших черенков предположительно обусловлен значительной обсеменённостью исходного материала (рис. 3), поскольку высокие показатели заражённости (48 %) биоматериала дуба были обнаружены в опыте Andrea N. Brennan et al. [5], причём эти показатели сильно варьировались не только между видами, но и в пределах одного вида дуба (например, для дуба брусниколистного 60–92 %).

 

Таблица 3. Получение жизнеспособных эксплантов дуба черешчатого на имматурной и генеративной фазах онтогенеза при варьируемой экспозиции в лизоформине

Table 3. Obtaining viable explants of English oak at the immature and generative stages of ontogenesis with varying lengths of exposure to Lysoformin

№	Вариант	Всего эксплантов, шт.	Заражённые экспланты, %	Стерильные экспланты, %
				жизнеспособные	не жизнеспособные
1	MS 1 БАП, 5 мин., ген., контроль	28	3,57	50	46,43
2	WPM 1 БАП, 5 мин., ген.	16	12,5	87,5	0
3	WPM 1 БАП, 4.5 мин., ген.	16	0	100	0
4	WPM 1 БАП, 4 мин., ген.	20	15	85	0
5	WPM 1 БАП, 3.5 мин., ген.	17	29,41	70,59	0
6	WPM 1 Гб, 5 мин., одрев., ген.	70	55,71	44,29	0
7	WPM 1 БАП, 5 мин., имм.	14	0	100	0

 

Рис. 2. Влияние экспозиции в стерилизующем растворе на долю жизнеспособных растений

Fig. 2. Effect of exposure to a sterilizing solution on the proportion of viable plants

 

Таблица 4. Влияние режима стерилизации на количество жизнеспособных растений

Table 4. Effect of sterilization regime on the number of viable plants

Источник вариации	Сумма квадратов	Число степеней свободы	Средний квадрат	Критерии Фишера		Доля влияния, %
				F-расч.	F-таб.
Время стерилизации	13 291,84	1	13291,84	182,18	5,99	96,8
Прочие факторы	437,76	6	72,96	-	-	3,2
Итого	13 729,6	7		-	-	100

 

Рис. 3. Заражённый одревесневший эксплант дуба черешчатого (1) и жизнеспособный эксплант дуба черешчатого с зелёным побегом (2) на свежей питательной среде

Fig. 3. (1) Infected lignified explant of English oak. (2) Viable explant of English oak with a green shoot on fresh nutrient medium

 

Результаты однофакторного дисперсионного анализа показали, что в F_расч.(182,18) > F_таб. = 5,99, что доказывает достоверность данного суждения. Доля влияния режима стерилизации на количество жизнеспособных эксплантов 96,8 %, а остальные 3,2 % объясняются влиянием других факторов.

Выводы. Наибольшее количество жизнеспособных стерильных эксплантов на ювенильной фазе было получено на питательной среде по прописи WPM – от 96,43 до 100 % [22], в то время как по прописи MS – 77,78 % [21]. Таким образом, среда WPM является лучшим выбором при введении в культуру зелёных черенков дуба черешчатого при выбранном режиме стерилизации. Оценить влияние обработки раствором аскорбиновой кислоты на жизнеспособность растений не удалось.

Наибольшее количество жизнеспособных стерильных эксплантов на генеративной фазе было получено на питательной среде по прописи WPM – от 70,59 до 100 % по сравнению с 50 % на питательной среде по прописи MS. Значительное влияние на количество жизнеспособных стерильных эксплантов оказал режим стерилизации (коэффициент детерминации R² = 0,91) и оптимальная экспозиция зелёных черенков дуба черешчатого в генеративной фазе в 3 % растворе Лизоформина 3000 начинается от 4,5 мин. с показателями жизнеспособности эксплантов от 87,5 до 100 %.

Полученные результаты можно использовать для разработки технологии размножения и выращивания дуба черешчатого in vitro.

Вклад авторов:

Тимаков А. А. – методология исследования, проведение экспериментов, анализ полученных результатов, подготовка исходного текста.

Сергеев Р. В. – редактирование текста, научная консультация.

Романов Е. М. – научное руководство, научная консультация.

Хусаинова А. Р. – подготовка исследования (приготовление питательных сред), информационный поиск.

Краснов В. Г. – редактирование текста, проведение статистического анализа, окончательное утверждение версии для публикации.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Contribution of the authors:

Timakov A. A. – research methodology development, performing the experiments, analysis of the results obtained, preparation of the initial draft.

Sergeev R. V. – reviewing and editing, scientific guidance.

Romanov E. M. – research supervision, scientific guidance.

Khusainova A. R. – research process preparation (preparation of nutrient media), information search.

Krasnov V. G. – reviewing and editing, statistical analysis, approval of the final version of the manuscript for publication.

The authors declare that they have no conflict of interest.

All authors read and approved the final manuscript.

Об авторах

Алексей Александрович Тимаков

Поволжский государственный технологический университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: TimakovAA@volgatech.net
SPIN-код: 6306-1287

аспирант кафедры лесных культур, селекции и биотехнологии

Россия, Йошкар-Ола

Роман Владимирович Сергеев

Поволжский государственный технологический университет

Email: TimakovAA@volgatech.net
SPIN-код: 1479-7956

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент кафедры лесных культур, селекции и биотехнологии

Россия, Йошкар-Ола

Евгений Михайлович Романов

Поволжский государственный технологический университет

Email: TimakovAA@volgatech.net
SPIN-код: 8291-5546

доктор сельскохозяйственных наук, профессор кафедры лесных культур, селекции и биотехнологии

Россия, Йошкар-Ола

Алия Ренатовна Хусаинова

Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К. А. Тимирязева

Email: TimakovAA@volgatech.net
SPIN-код: 2342-8951

аспирант

Россия, Москва

Виталий Геннадьевич Краснов

Поволжский государственный технологический университет

Email: TimakovAA@volgatech.net
SPIN-код: 3179-8907

доктор сельскохозяйственных наук, профессор кафедры лесных культур, селекции и биотехнологии

Россия, Йошкар-Ола

Список литературы

Дополнительные файлы