Оценка эффективности антиостеопорозного препарата в активации цитокиновой системы RANKL/OPG в модели экспериментального остеопороза и сахарного диабета 2 типа

Полный текст

Введение Остеопороз - прогрессирующее системное заболевание скелета, характеризующееся снижением минеральной плотности кости, нарушением ее микроархитектоники, приводящее к увеличению хрупкости костной ткани и повышению вероятности переломов [8]. Ввиду отсутствия патогномоничных клинических проявлений костной дистрофии в начале заболевания, оно длительное время остается «безмолвным». Однако, по мере инициации осложнений, создаются высокие социальные и личные издержки [19]. По данным International Osteoporosis foundation (IOF) (2010) остеопорозом страдают около 75 млн. человек в Европе, США и Японии. В России этот показатель составляет 14 млн. человек [10, 22]. Этиология остеопороза имеет гетерогенную природу и обусловлена влиянием множества факторов эндогенной и экзогенной природы, а чаще их совокупностью [11]. Факторы риска так же подразделяются на модифицируемые и немодифицируемые [24]. Вес, курение, употребление алкоголя, низкая физическая активность, алиментарный дефицит кальция, длительный прием глюкокортикоидов входят в группу регулируемых факторов риска. Пол, возраст, этническая принадлежность и генетические полиморфизмы относятся к неизменным факторам риска. В связи с чем, популяция охваченная риском возникновения костной дистрофии неуклонно увеличивается. Ухудшение эпидемиологической ситуации по остеопорозу и прогнозируемый рост числа пациентов связывают с увеличением доли лиц пожилого и старческого возраста в структуре населения во всем мире и в нашей стране, в частности. Согласно статистическим прогнозам, влияние тенденции общемирового постарения населения к 2050 г. приведет к увеличению частоты патологических переломов, например шейки бедра, в два раза [24]. Ожидаемая продолжительность жизни в РФ к 2035 г. увеличится до 77,13 г. [4], в связи с чем, у мужчин число случаев перелома проксимального отдела бедренной кости вырастет на 36%, у женщин на 43% [9]. По данным Международного фонда остеопороза начиная с возраста 50 лет, одна из трех женщин и один из пяти мужчин в течение оставшейся жизни перенесут остеопоротический перелом [8]. Несмотря на многочисленность протоколов терапии нарушений фосфорно-кальциевого обмена, не теряет своей актуальности проблема поиска новых высокоэффективных препаратов и, как следствие, снижение количества осложнений и летальных исходов в целевых группах населения. Недостаточную эффективность предложенных программ профилактики и лечения остеопороза можно связать со сложностью его патогенеза, не ограничивающегося одним лишь дефицитом кальция [6]. Поэтому, для эффективной коррекции нарушений фосфорно-кальциевого обмена необходимо использовать терапевтические подходы, создаваемые в континууме механизмов регуляции обменных процессов и патофизиологии развития остеопороза [17]. Новым подходом в профилактике и лечении сенильного и постменопаузального остеопороза, состояний, обусловленных дефицитом витамина Д, является применение в лекарственной терапии комплекса кислых солей янтарной кислоты (КСЯК). Из природных субстратов-метаболитов - кислые соли сукцината являются наиболее сильными модуляторами орфановых рецепторов и рецепторов SUNCR1, кальциевых каналов L-типа Спектр действия КСЯК включает в себя потенцирование усвоения макро- и микроэлементов костной тканью, улучшение метаболизма витамина Д с повышением биодоступности его активных форм в организме [3, 16, 18]. Эффективность антиостеопорозной терапии нередко зависит от наличия сопутствующих заболеваний, в том числе и сахарного диабета 2 типа. Наряду с тем, что СД сам по себе является независимым фактором риска переломов [24], его осложнения могут вызвать устойчивое нарушение обменных процессов в костной ткани [20] и снизить эффективность патогенетической антирезорбтивной терапии. Не вызывает сомнений, что создание и исследование специфической фармакологической активности препаратов на основе уникальных биологически активных соединений имеет высокую клиническую значимость. Биохимическое исследование маркеров системного костного метаболизма в свою очередь является информативным критерием оценки их эффективности на доклиническом этапе. Целью исследования являлась оценка процессов остеогенеза согласно уровню маркеров костного ремоделирования в сыворотке крови на этапах терапии экспериментального остеопороза и в его сочетании с моделью сахарного диабета 2 типа. Методика Объектом исследования являлся создаваемый лекарственный препарат на основе солей янтарной кислоты, средство для лечения остеопороза (далее - препарата Х3, патент на изобретение RU 2582973C1) [15]. Метод создания экспериментальной модели остеопороза. Суть метода заключается в двустороннем хирургическом удалении яичников у самок крыс, с последующим двукратным введением преднизолона. Для эксперимента были использованы интактные самки крыс линии Вистар 8-10 месячного возраста весом 240-260 г. Двусторонняя овариоэктомия проведена в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве Бунока (1968). Животных наркотизировали эфиром и фиксировали на операционном столе в положении на животе. Шерсть на спинке от тазовой области до реберной дуги выстригали, кожу обрабатывали спиртом и разбавленным спиртовым раствором йода. Скальпелем делали продольный разрез длиной 1,5-2,0 см по средней линии спины. Передвигая разрез, поочередно, налево и направо делали прокол в задней части брюшной полости. Найдя правый или левый рог матки, выводили его через прокол наружу, находили яичник и электокаутером отсекали его от рога матки. Аналогично удаляли и второй яичник. Проколы брюшины и надрез спины обрабатывали стрептоцидом. Ушивали спинной разрез и шов обрабатывали 5% йодной настойкой. После операции животных помещали в чистую клетку, в течение первых 4-5 дней проводили ежедневную обработку раны дезинфицирующими средствами. Заживление раны произошло на 7-9 день. Через 3 недели после операции самкам крыс вводили р-р преднизолона в дозе 25 мг/кг в/б. Второе введение производилось с интервалом в 15 дней [1, 7, 17]. Моделирование сахарного диабета. Для моделирования СД через 4 нед. от начала содержания на высокожировой диете и через 2 недели после ОЭ внутрибрюшинно вводился раствор никотинамида 230 мг/кг. Данная методика описана ранее российскими исследователями [19, 20, 21]. На 2-е и 3-и сутки в случайной точке определялся уровень глюкозы в венозной крови. СД диагностировался при гликемии, равной или более 11,1 ммоль/л, зафиксированной в двух измерениях в разные дни. В ходе теста уровень гликемии определялся исходно, после чего с помощью желудочного зонда перорально вводился 40% раствор глюкозы 3 г/кг. Повторное измерение гликемии проводилось на 15, 30, 60 и 120-й мин. теста. СД диагностировался при выявлении гликемии, равной или более 11,1 ммоль/л в любой из точек [21]. Назначение препаратов и наблюдение за животными продолжались еще 6 нед., суммарная длительность исследования - 12 нед. Биохимическое исследование маркеров системного костного метаболизма. Во всех группах производился забор крови из нижней полой для определения маркеров костного ремоделирования, отражающих процессы остеогенеза и резорбции костной ткани - остеопротегерина (OPG) и лиганд активатора ядерного фактора каппа-β (RANKL) методом иммуноферментного анализа (ИФА) и рассчитан коэффициент их соотношения OPG/RANKL. Исследование входит в комплекс доклинических исследований, необходимых для регистрации продукта и направлено на установление свойства тестируемого объекта при многократном пероральном введении в фиксированной дозе (62,5 мг/кг, композит без лекарственной основы). Исследование проводилось в соответствии со стандартами лабораторных исследований GLP в Центре доклинических и трансляционных исследований ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» МЗ РФ. Результаты исследования и их обсуждение Как видно из рис. 1, продукция лигандов рецептора RANKL при формировании остеопороза повышается, отражая процессы активации резорбции костной ткани, и, соответственно, в большем количестве попадает в циркулирующую кровь. Рис. 1. Динамика маркеров остеопороза в сыворотке крови самок крыс с экспериментальным остеопорозом при фармакотерапии антиостеопорозным препаратом (Х3) и в сочетании с Д3. Данные интактных крыс приняты за 100%. 1 - интактная; 2 - контроль О/Э; 3 - контроль О/П; 4 - О/П+Х3; 5 - О/П+Х3+D3 Наряду с этим, отмечается достоверное и многократное падение уровня остеопротегерина в крови. В дальнейшем, на этапе медикаментозной коррекции, содержание RANKL в крови уменьшается, что свидетельствует о снижении его выработки остеобластами на фоне стимуляции остеокластогенеза посредством продукции OPG. Необходимо отметить, что более резкое снижение OPG происходит непосредственно после овариоэктомии, что свидетельствует о гормонозависимом характере этого процесса. Назначение препарата Х3 восстанавливает исходный уровень OPG в крови. Комбинация препарата Х3 с витамином D3 вызывает еще более значительное достоверное повышение концентрации OPG, по сравнению с интактной группой, что в свою очередь приводит к закономерному снижению концентрации RANKL в крови. Как было описано в методике, у части экспериментальных животных была сформирована сочетанная патология остеопороза и сахарного диабета 2 типа, с целью выяснения эффективности антиостеопорозной терапии на фоне нарушения углеводного обмена. Поученные данные, приведенные на рис. 2, показывают, что у группы СД2-ОП+Х3+D3 проводимая антиостеопорозная терапия в дозе 62,5 мг, усиленная добавлением в схему лечения витамина D3 в дозе 500 МЕ на кг веса крысы в незначительной степени повлияла на коррекцию экспериментального остеопороза. Так, только у RANKL отмечали достоверное снижение его уровня, что предполагает падение активности остеокластов. Уровень OPG остался индифферентным к проводимой фармакотерапии препаратом Х3 и в сочетании Х3 с холекальциферолом. Рис. 2. Оценка динамики костного ремоделирования на фоне применения антиостеопорозного препарата (Х3) в экспериментальной модели остеопороза, осложненной сахарным диабетом 2 типа. Данные интактных крыс приняты за 100%. 1 - интактная; 2 - контроль СД 2; 3 - контроль О/П; 4 - СД2+О/П+Х3+D3 Основываясь на полученных результатах, были проанализирована динамика соотношения OPG/RANKL между контрольной группой животных и группами с индуцированными остеопорозом, сахарным диабетом и их сочетанием на фоне терапии исследуемым препаратом (Х3). Из рис. 3 видно, что динамика изменения коэффициента OPG/RANKL демонстрирует проградиентное снижение уровней OPG в группах с нарушениями фосфорно-кальциевого и углеводного обменов и его устойчивую обратную корреляционную связь с показателями уровней RANKL в данных группах. На фоне антирезорбтивной терапии препаратом Х3 в группе крыс с сочетанной патологией не было достигнуто значимого изменения соотношения OPG/RANKL, отражающего активацию процессов остеобластогенеза. Рис. 3. Схематичное изображение соотношения маркеров остеогенеза (коэффициент OPG/RANKL) в сравниваемых группах крыс. Данные интактных крыс приняты за 100% Ремоделирование костной ткани, как спонтанное, так и на фоне ее повреждения, представляет собой взаимодействие двух противоположно направленных процессов - резорбции и костного формирования, баланс взаимодействия которых регулируется цитокиновой (лиганд-рецепторной) системой RANK-RANKL-OPG (рис. 4). ОСТЕОБЛАСТ Рис. 4. Система управления костного ремоделирования RANK-RANKL-ORG Являясь гликопротеинами семейства фактора некроза опухолей (ФНО), данные низкомолекулярные регуляторные белки осуществляют регуляцию остеокластогенеза. Лиганд активатор ядерного фактора каппа-β (RANKL) продуцируется клетками остеобластической линии и активированными Т-лимфоцитами и может определяться в тканях головного мозга, сердца, почек, скелетной мускулатуры и кожных покровов [9]. Повышение уровня RANKL через его взаимодействие с RANK-рецептором имеет решающее значение в активации процесса резорбции кости [13]. Остеопротегерин (OPG) так же секретируется не только остеобластами, но и тканями органов всех систем, включая крупные артерии, вены, стромальные клетки костного мозга и активированные Т-лимфоциты [5, 14]. Остеопротегерин, проявляя антагонизм к RANKL, защищает костную ткань от избыточной резорбции. Коэффициент OPG/RANKL является важным фактором, для определения костной массы и скелетной целостности [13]. Являясь предикторами остеогенеза, исследуемые маркеры костного метаболизма, продемонстрировали высокую информативность в заданном диапазоне задач. Заключение Разрабатываемый препарат Х3 на экспериментальной модели патологии «постменопаузального» остеопороза показал высокую эффективность зачет увеличения биодоступности и усвоения макро и микроэлементов костной тканью [1, 2, 23]. Биодоступность компонентов препарата увеличена за счет применении в препарате солей природных конформеров янтарной кислоты и его сигнальной функцией - лиганд рецепторным взаимодействием сукцината с рецептором SUCNR1 [12, 23]. Активация системы SUCNR/SUCNR1 приводит к усилению метаболизма костной ткани, усилении остеогенеза, остеобластогенеза. Соответственно нарушение углеводного метаболизма в виде СД2 подавляет процесс остеобластогенеза, и снижает фармакологическую эффективность препарата Х3. Исходя из полученных данных можно предположить, что нарушение углеводного обмена является тормозящим фактором в лечении экспериментально индуцированного остеопороза. Нормализацию уровня маркеров костного ремоделирования в сыворотке крови и восстановление микроархитектоники костной ткани путем назначения антиостеопорозной терапии необходимо проводить совместно с тщательным подбором лекарственной терапии сахарного диабета. Таким образом, назначение антиостеопорозного препарата Х3 в комбинации с витамином Д3 самкам крыс с моделью патологии остеопороза приводит к нормализации маркеров костного ремоделирования в сыворотке крови. Нарушение углеводного обмена в сочетанной патологии остеопороза и СД2 делает неэффективным проводимую антиостеопорозную терапию, что предполагает необходимость предварительной коррекции СД2 сахароснижающими препаратами.

Об авторах

Наиля Шамилевна Мамина

Институт экспериментальной медицины

Email: email@example.com
аспирант отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» Россия 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Алекбер Азизович Байрамов

Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова; Институт экспериментальной медицины

Email: email@example.com
доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник Института эндокринологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» Минздрава России; ведущий научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины». Россия 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Татьяна Леонидовна Каронова

Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова

Email: email@example.com
доктор медицинских наук, заведующая лабораторией клинической эндокринологии Института эндокринологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» Минздрава России Россия 197341, Санкт-Петербург, ул. Аккуратова, 2

Наталья Владимировна Тимкина

Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова

Email: email@example.com
научный сотрудник Института эндокринологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» Минздрава России Россия 197341, Санкт-Петербург, ул. Аккуратова, 2

Майис Вугар оглы Амрахов

Институт экспериментальной медицины

Email: email@example.com
лаборант отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» Россия 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Наталия Николаевна Кузнецова

Институт экспериментальной медицины

Email: email@example.com
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» Россия 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Петр Дмитриевич Шабанов

Институт экспериментальной медицины

Email: email@example.com
доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом нейрофармакологии им. С.В. Аничкова. ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» Россия 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Список литературы

Дополнительные файлы