ТЕРМОГРАВИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФРАКЦИЙ ВОДЫ - НОВЫЙ МЕТОД ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ВЫРАЖЕННОСТИ ОСТРОЙ ГИПОКСИИ И ЕЁ ПРОФИЛАКТИКИ ХИМИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Полный текст

Введение Гипоксия представляет собой типовой патологический процесс, обусловленный снижением содержания кислорода в организме, что может быть вызвано как внешними, так и внутренними факторами, например, заболеваниями. При этом, различные формы экзогенной гипоксии можно рассматривать как частные проблемы нормальной физиологии. Газовый состав воздушной среды, соотношения в ней кислорода и углекислого газа приобретают особую значимость в экстремальных ситуациях, таких, например, как высотные полёты, восхождение в горы, погружение в воду без специального оборудования или же в герметичных аппаратах [5]. Установлено, что состояние воды в тканях организма изменяется при различных физиологических и патологических процессах. Уникальную роль воды в живых системах известный биохимик Альберт Сент-Дьёрдьи [8] выразил фразой: «Вода не только мать, но и матрица жизни». Замещение этой матрицы более плотными образованиями ведёт, как правило, к трудностям в реализации физиологических процессов. Человек постепенно на протяжении жизни теряет воду. У новорожденного содержание воды составляет около 80%, в организме взрослого - 60-70%, у старого человека 50-60% [13]. При изменении внешних условий нарушается не только общее содержание воды - наблюдаются сдвиги в соотношении структурных фракций воды. Высказываются предположения, что содержание связанной и свободной воды должно измениться под воздействием гипоксии и в условиях применения антигипоксантов, т.к. вода является объединяющим компонентом всех биологических жидкостей и мягких тканей. Это не только среда, в которой протекают биологические процессы, но и активный компонент живой системы [13]. Для воды характерна способность к самоорганизации вследствие образования водородных связей [9]. Цель исследования - осуществить тестирование термогравиметрического метода исследования содержания фракций воды на модели острой гипоксии с гиперкапнией (ОГ+Гк) для оценки степени её выраженности, а также в условиях профилактики ОГ+Гк металлокомплексными соединениями. Методика Опыты выполнены на мышах-самцах линии F1 CBA/Bl6 массой 18-20 г в соответствии с «Руководством по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ». Для оценки антигипоксического действия химических соединений использовали модель ОГ+Гк. Состояние гипоксии формировали путём помещения животных в герметичные стеклянные ёмкости со свободным объёмом 0,25 л. В ходе эксперимента оценивали продолжительность жизни животных в условиях гипоксии (группа контроля), а также после профилактического введения веществ - потенциальных антигипоксантов (опытные группы). Гибель констатировали после возникновения стойкого апноэ. В качестве протекторов ОГ+Гк использовали 12 ранее не изучавшихся металлокомплексных соединений - πQ1311, πQ2075, πQ2830, πQ2836, πQ2843, πQ2848, πQ2851, πQ2852, πQ2853, πQ2856, πQ2857, πQ2891). Синтез веществ выполнен Парфеновым Э.А. в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического центра РАМН [6]. Вещества вводили однократно в/б в дозах 10, 25 и 50 мг/кг за 60 мин. до помещения животных в модельные условия. Мышам группы контроля вводили равный объём физиологического раствора NaCl. Изучение в крови структуры водных фракций воды проводили термогравиметрическим методом. Забор крови осуществляли сразу же после декапитации. Декапитацию выполняли на разных стадиях ОГ+Гк: 1) при появлении первых признаков гипоксии (учащенное дыхание, учащенное сердцебиение, повышенная двигательная активность), 2) при наступлении стойкого апноэ. Из полученной пробы крови забирали 0,1 мл и наносили тонкий мазок на взвешенное заранее предметное стекло, после чего стекло высушивали до постоянного веса на чашке аналитических весов при комнатной температуре (18ºС) с поэтапной регистрацией веса через каждые 30 с. Затем образец досушивали в термостате в течение 2 ч. при температуре 105ºС для полного удаления воды. По массе сухого остатка рассчитывали содержание общей воды. mобразца = mобразца на стекле - mстекла mсухого остатка= mсухого остатка на стекле - mстекла m(Н2O)общая = mобразца - mсухого остатка Содержание общей воды, в % = По результатам высушивания при комнатной температуре строили график зависимости массы образца от времени (рис.). Рис. Зависимость массы образца крови животных от времени его высушивания при комнатной температуре (18ºС) На графике находили точку пересечения прямых (точка А), соответствующую точке полного испарения свободной воды и начала испарения связанной, на основании чего рассчитывали содержание фракций воды в образце. m (Н2Oсвободная) = mобразца на стекле (первое взвешивание) - mочка А m (Н2Oсвязанная) = m (Н2Oобщая) - m (Н2Oсвободная) Содержание свободной воды, в %= Содержание связанной воды, в % = Накопление, корректировку, систематизацию исходной информации и визуализацию полученных результатов осуществляли в электронных таблицах Microsoft Office Excel 2016. Статистический анализ проводили с помощью программы «STATISTICA 10». Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению. В случае описания количественных показателей, имеющих нормальное распределение, полученные данные объединяли в вариационные ряды, в которых проводили расчёт средних арифметических величин и стандартных отклонений. Проверку статистических гипотез о равенстве средних значений проводили на фиксированном уровне значимости 0,05. Результаты исследования и их обсуждение Как было установлено, из 12 изученных соединений, вводимых в/б в дозах 10, 25 и 50 мг/кг антигипоксическим эффектом обладали всего 3 вещества - πQ1311, πQ2830, πQ2853. Одно соединение (πQ2856) проявило себя в двух дозах - 25 и 50 мг/кг (табл. 1). Таблица 1. Влияние металлокомплексных соединений на продолжительность жизни мышей в условиях острой гипоксии с гиперкапнией (до возникновения стойкого апноэ) Вещества Доза, мг/кг Число животных Продолжительность жизни, мин. Продолжительность жизни, % Контроль - 6 29,58±1,54 100 πQ 1311 10 6 40,02±3,19 135,30* πQ 2075 10 6 31,00±0,70 104,82 πQ 2830 10 6 41,81±0,70 141,35* πQ 2836 10 6 33,80±1,13 114,28* πQ 2843 10 6 43,57±3,72 147,31* πQ 2848 10 6 33,43±1,28 113,02* πQ 2851 10 6 30,59±3,22 103,41 πQ 2852 10 6 36,57±0,55 123,65* πQ 2853 10 6 47,24±1,64 159,71* πQ 2856 10 6 26,79±1,30 90,57 πQ 2857 10 6 31,17±1,52 105,37 πQ 2891 10 6 30,22±0,68 102,17 Контроль - 6 29,51±0,83 100 πQ 1311 25 6 40,38±5,52 136,86* πQ 2075 25 6 32,44±0,46 109,93* πQ 2830 25 6 66,63±1,08 225,82* πQ 2836 25 6 42,09±3,14 142,64* πQ 2843 25 6 35,76±3,71 121,19* πQ 2848 25 6 35,88±2,24 121,58* πQ 2851 25 6 32,84±2,92 111,29* πQ 2852 25 6 29,53±2,46 100,07 πQ 2853 25 6 62,35±4,33 211,31* πQ 2856 25 6 39,67±3,71 134,43* πQ 2857 25 6 35,22±1,50 119,35* πQ 2891 25 6 28,65±1,00 97,09 Контроль - 6 31,35±2,68 100 πQ 1311 50 6 43,26±2,55 137,97* πQ 2075 50 6 29,73±0,59 94,82 πQ 2830 50 6 54,21±3,10 172,93* πQ 2836 50 6 37,83±1,87 120,66* πQ 2843 50 6 36,07±4,21 115,06* πQ 2848 50 6 34,14±0,18 108,88* πQ 2851 50 6 34,46±2,77 109,90 πQ 2852 50 6 45,17±4,19 144,09* πQ 2853 50 6 83,52±3,12 266,40* πQ 2856 50 6 44,61±3,83 142,30* πQ 2857 50 6 35,23±3,77 112,38 πQ 2891 50 6 28,79±1,79 91,83 Примечание: * - p< 0,05 по отношению к контрольной группе животных Следует отметить, что комплексообразователем в составе вещества πQ1311 является титан, в πQ2830 - железо, в πQ2853 - цинк, в πQ2856 - ванадий. Известно, что при образовании комплексного соединения металла с редокс-активным лигандом, редокс потенциал нового соединения отличается от редокс-потенциала как металла, так и лиганда [13, 20, 22]. В этом случае, кроме сдвига редокс-потенциала биометалла нередко отмечают улучшение биодоступности металла в составе комплексного соединения, а также повышение устойчивости лиганда к окислению. В отличие от соединений πQ2830 и πQ2853, в основе которых содержатся биометаллы железо и цинк, металлы, входящие в вещества πQ1311 и πQ2856 к биометаллам не относятся. При использовании подобных соединений возникает проблема защиты биологической системы от свободных ионов этих металлов. Тем не менее, в литературе имеются сведения о применении аскорбата титана (IV) - препарате «Титавит», который был рекомендован в качестве стимулятора роста растений [17], повышения продуктивности животных и для укрепления иммунной системы по отношению к вирусной и бактериальной инфекции [7]. Как видно из таблицы, наиболее ярким антигипоксическим эффектом обладало соединение πQ2853, увеличивающее продолжительность жизни после введения в дозах 10, 25 и 50 мг/кг на 59,7, 111,3 и 166,4% соответственно. Комплексообразователем в данном случае выступали ионы Zn2+. Как известно, металлокомплексные соединения на основе Zn2+ могут обратимо подавлять процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях, что может быть обусловлено их способностью изменять редокс-состояние внутренней среды [25, 27]. При поступлении ионов цинка из вне облегчаются условия для поддержания гомеостаза, в том числе и водно-электролитного. Таким образом, на основании предварительных результатов исследования вещество πQ2853 было выбрано для углублённого изучения его влияний на фракционный состав воды при формировании ОГ+Гк. Как известно, вода в живых системах находится в двух фазовых состояниях - свободном и связанном с биомакромолекулами тканей. Свободная вода, та её часть, которая не ассоциирована с макромолекулами, обладает способностью совершать изотропное движение в пределах мембраны, характерном для жидкой воды. Она может покидать пределы биологической мембраны, обмениваясь с молекулами воды вне- или внутриклеточного пространства, в то время как связанная (структурированная) вода формирует гидратную оболочку высокомолекулярных соединений. Связанная вода присутствует в мембранах клеток в виде одиночных молекул и гидратных оболочек. Одиночные молекулы располагаются в углеводородной зоне мембраны. Гидратные оболочки образуются вокруг полярных частей молекул белков и липидов [1, 9]. Для проявления специфичности белков, наряду с характером и последовательностью составляющих их аминокислот, важным фактором является количество и структура связанной с ними воды. Эта фракция воды влияет на активность ферментов, строение и функции мембран [13]. Современная квантовая химия может с высокой точностью рассчитать свойства единичной молекулы воды. Для изучения ассоциативных свойств воды создаются её структурные модели. Существует множество теорий и моделей, объясняющих структуру и свойства воды. Всех их объединяет представление о водородных связях как основном факторе, определяющем образование структурированных ассоциатов. На основании результатов изучения структур, образуемых взаимодействующими молекулами воды в различных условиях, сделаны заключения об способности последних формировать микрокристаллы. Микрокристалл из молекул воды имеет размеры 2×2×3 нм. В обычном, жидком состоянии при температуре от 0 до 100°C вода состоит из таких или подобных структурных элементов, в каждом из которых содержится 912 молекул. Микрокристаллы воды, в свою очередь, объединены в более крупные образования - ячейки размером 0,5 мкм, которые можно видеть в контрастно-фазовом микроскопе [1]. В последних исследованиях отмечается, что в воде находится до пяти надмолекулярных комплексов диаметром от 1 до 100 мкм. Они имеют характерные свойства и обозначены как «эмулоны». Существование эмулонов подтверждено методом дифференциального термического анализа. Размеры и пространственная организация эмулонов зависят от состава водных растворов, температуры. Эмулоны в воде образуют единую систему. Ионы водорода [H+] и гидроксила [OH-] играют решающую роль в формировании эмулонов в воде. Гидратированные ионы H+⋅n1H2O и OH-⋅n2H2O образуют ионные пары, из которых, вероятно, и строятся эмулоны, включающие до 107-109 этих частиц [9]. Трансформации микрокристаллической структуры воды возникают при физических и физико-химических воздействиях - инфракрасном, рентгеновском облучении, воздействии ультра- и инфразвуком, концентрации ионов водорода, электролитов, различных органических соединений изменении редокс-потенциала [1]. Живые организмы, от дрожжей [16], морских водорослей [26] и зелёных растений [28] до позвоночных [19] отвечают на данные стресс-воздействия изменением редокс-потенциала в клетке за счёт повышения генерации биологически активных частиц, при этом изменяется структура воды и белковых молекул. На следующем этапе исследования методом термогравиметрического анализа было установлено, что ОГ+Гк вызывает изменение водных фракций в крови (табл. 2). Таблица 2. Характеристика содержания фракций воды в крови животных, подвергшихся воздействию ОГ+Гк, а так же получавших защиту в качестве вещества πQ2853 Группа животных Содержание свободной воды Содержание связанной воды Содержание общей воды Контроль 63,36±2,46 9,06±1,22 72,42±3,11 ОГ+Гк (первые признаки) 58,97±1,00* 13,63±1,21* 72,60±2,11 ОГ+Гк (стойкое апноэ) 66,73±0,50* 6,56±0,35* 73,29±1,20 ОГ+Гк (на фоне вещества πQ2853) 64,16±0,79∆ 8,27±0,49∆ 72,43±2,15 Примечание: * - p<0,05 по отношению к контрольной группе животных; ∆ - p<0,05 по отношению к группе животных, подвергшихся воздействию ОГ+Гк до наступления стойкого апноэ Как было установлено в ходе исследования, при первых признаках гипоксии в крови мышей статистически достоверно повышается уровень связанной воды (+50,4%) при одновременном снижении уровня свободной (-6,9%). В свою очередь, содержание общей воды практически не менялось. Напротив, в терминальную стадию ОГ+Гк после развития у мышей стойкого апноэ уровень связанной воды снижался (-27,6%), а содержание свободной воды возрастало (+5,3%) при стабильном уровне общей воды. Таким образом, были выявлены качественные изменения в структуре биомакромолекул, обусловленные, по-видимому, процессами адаптации организма к неблагоприятным условиям среды обитания. Можно предположить, что при первых проявлениях гипоксии содержание связанной воды в крови теплокровных организмов повышается в результате запуска физиологических и биохимических механизмов срочной адаптации. Возможно, на начальных стадиях острой гипоксии вода переходит в активное состояние, при котором образуются неустойчивые метастабильные ассоциаты, что, в конечном счёте, приводит к увеличению уровня связанной воды. Если же воздействие на организм острой гипоксии не прекращается и достигает стадии агонии, содержание связанной воды снижается. На этом этапе, вероятно, и происходит распад эмулонов. В ряде работ отмечается, что перевести воду в активное состояние возможно посредством обработки ультразвуком, замораживанием, нагреванием, кипячением, дезинтегрированием и другими способами [9]. Так, например, в опытах с острым перегреванием было установлено, что в период возбуждения животных, находящихся в стадии «тревоги», содержание связанной воды в крови уменьшается, а свободной - увеличивается. При продолжении нагрева происходит увеличение содержания связанной воды. Это соответствует стадии резистентности, когда завершается мобилизация защитных механизмов, происходит восстановление нарушенного равновесия функциональных систем и организм становится более устойчив к воздействию внешнего раздражителя. Вероятно, в этот период происходит образование нестабильных ассоциатов. К моменту теплового удара содержание связанной воды в крови и тканях снижается, наступает стадия истощения [12]. Полученные данные согласуются с теорией Бернала-Фаулера, которая рассматривает три возможных состояния конденсированной воды. Вода-1 (существует при температуре менее 277ºК и имеет расположение молекул, аналогичное кристаллу льда. Вода-2 (существует при средних температурах и содержит агрегаты молекул воды, подобные кристаллам кварца). Переход от воды-1 к воде-2 осуществляется при повышении температуры за счёт отрыва молекул от тетраэдрического каркаса и образования структур с более плотной упаковкой. Это вероятно, и происходит при смене стадии тревоги на стадию резистентности. Вода-3 существует при высоких температурах и не содержит никаких структур [4], поэтому в период истощения наблюдается снижение связанной воды. При термическом анализе воды было установлено, что повышение температуры выше порогового уровня приводит к последовательному распаду эмулонов [9]. В опытах с воздействием на животных ионизирующей радиации также наблюдали разноплановые изменения в содержании в крови связанной воды применительно к экспозиции и дозе. При 4 и 6 Гр через сутки после облучения отмечали повышение содержания связанной воды в крови, с последующим снижением. При 8 Гр содержание связанной воды уже в первые сутки наблюдения было ниже, чем в контроле [12]. В ходе собственного исследования было изучено влияние вещества πQ2853 на структурные фракции воды на фоне развития ОГ+Гк. Профилактическое введение вещества в дозе 25 мг/кг способствовало увеличению содержания связанной воды в крови в сравнении с группой животных, подвергшихся воздействию ОГ+Гк до наступления стойкого апноэ. Установлено, что вещество πQ2853 повышает способность белков крови связывать воду, что и приводит к перераспределению фракций воды. В качестве комплексообразователя соединение πQ2853 включает ионы Zn2+. Многие исследователи в своих работах подтвердили антигипоксический эффект цинксодержащих соединений [2, 3, 10]. Около 3000 белков человека содержат цинк, в качестве кофактора или структуру стабилизирующего фактора. Цинк как микроэлемент необходим для правильного функционирования от 3 до 10% всех белков животного организма [23]. При окислительном стрессе, гипоксии, повышенной температуре и других видах стресса содержание свободных ионов цинка повышается [18, 20, 21], что может способствовать перераспределению фракций воды, наблюдаемому в данном эксперименте. Известна теория строения воды Самойлова О.Я., согласно которой структура воды появляется или существенно изменяется непосредственно в зоне влияния находящихся в воде примесей [4]. Важная роль ионов в формировании структуры и характера поведения водных растворов в значительной степени определяется их природой, зарядом и размером. Все перечисленное обуславливает их способность взаимодействовать с молекулами воды. Электрическое поле ионов, по мнению учёного, изменяет ориентацию дипольных молекул воды, искажая первоначальную её структуру, поскольку взаимодействие «ион-вода» резко отличается от взаимодействия «вода-вода». Появление ионов в воде приводит к двум взаимно противоположным изменениям структуры воды. Влияние поля иона нарушает упорядоченность молекул, характерную для чистой воды. Этот дезорганизующий эффект связан с увеличением энтропии. С другой стороны, действие поля иона ориентирует молекулы воды в этом поле и приводит к упорядоченному размещению их вокруг иона, что сопровождается уменьшением энтропии. Таким образом, диссоциация электролитов приводит к появлению в воде ионов, вызывающих положительную или отрицательную гидратацию [14]. Поскольку ион Zn2+ способствует достоверному повышению количества связанной воды в условиях острой гипоксии, то, вероятно, его можно отнести к ионам, обладающим структуроупрочняющим действием на воду с положительной гидратацией. У структуроупрочняющих ионов молекулы воды в гидратных оболочках расположены так, что они соответствуют структуре окружающей воды и образуют с ней обычные водородные связи. Ионы с гидратными оболочками встраиваются в тетраэдрическую структуру воды [11]. Кроме того, при образовании комплексного соединения редокс-потенциал нового соединения отличается от редокс-потенциала как металла, так и лиганда [15, 22, 24]. В этом случае, возможно не только достичь желаемого сдвига редокс-потенциала металла, но и получить дополнительную пользу - улучшение биодоступности металла в составе комплексного соединения, а также повысить устойчивость к окислению редокс-активного лиганда [7]. В литературе присутствуют сведения о способности металлокомплексных соединений, содержащих в качестве комплексообразователя Zn2+, обратимо подавлять процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях клетки, которые в свою очередь могут базироваться на способности металлокомплексов значительно изменять редокс-состояние внутренней среды [25, 27] за счёт изменения структуры воды. Заключение Среди протестированных в опытах на мышах 12-ти металлокомплексных соединений обнаружены вещества πQ1311, πQ2830, πQ2853, πQ2856, обладающие защитным противогипоксическим эффектом в широком спектре доз. Наиболее эффективное цинксодержащее соединение πQ2853 в ходе термогравиметрического исследования крови животных послужило ярким примером, иллюстрирующим возможность протекции гипоксических состояний металлокомплексными соединениями (потенциальными антигипоксантами) путём стабилизации содержания свободной и связанной воды на различных этапах развития острой гипоксии. Выявлены различия содержания фракций воды в группе животных, подвергшихся воздействию ОГ+Гк, и в группе животных, получавших вещество πQ2853 в дозе 25 мг/кг по сравнению с контрольной группой. Показатели содержания связанной и свободной воды могут быть использованы для уточнения стадии гипоксического состояния, определения уровня адаптационных возможностей организма к гипоксическому эпизоду и эффективности антигипоксантов.

Об авторах

Екатерина Олеговна Маркова

Смоленский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
кандидат биологических наук, доцент кафедры общей и медицинской химии ФГБОУ ВО «Смоленский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 214019, Смоленск, ул. Крупской, 28

Николай Федорович Фаращук

Смоленский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
доктор медицинских наук, профессор кафедры общей и медицинской химии ФГБОУ ВО «Смоленский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 214019, Смоленск, ул. Крупской, 28

Андрей Викторович Евсеев

Смоленский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой нормальной физиологии ФГБОУ ВО «Смоленский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 214019, Смоленск, ул. Крупской, 28

Роман Андреевич Титов

Смоленский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
студент педиатрического факультета ФГБОУ ВО «Смоленский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 214019, Смоленск, ул. Крупской, 28

Список литературы

Дополнительные файлы