ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТОЦИАНОВ В АРОНИИ МИЧУРИНА ЛИСТЬЯХ

Полный текст

Введение Вещества-антоксиданты обеспечивают регуляцию оксидативного стресса, который является одним из механизмов развития многих заболеваний человека, в особенности заболеваний сердечно-сосудистой системы [1]. В настоящее время повышенное внимание уделяется исследованию антиоксидантной активности (АОА) растительного сырья. Это связано с более широким спектром действия и низкой токсичностью в сравнении с синтетическими препаратами [6]. Лекарственное растительное сырье (ЛРС), являющееся источником полифенолов и флавоноидов, наиболее часто рассматривается как источник антиоксидантов (АО) [6, 14, 21]. В том числе АОА обладают антоцианы - полифенольные пигменты растений. В зеленых частях растения они могут встречаться в форме бесцветных предшественников - лейкоантоцианов. Переход лейкоантоцианов в антоцианы происходит при сезонном изменении природных условий, а также в присутствии хлористоводородной кислоты [11]. Согласно литературным данным, употребление антоциансодержащих продуктов приводит к снижению рисков сердечно-сосудистых заболеваний, ожирения, диабета, нейродегенеративных заболеваний и др. [9]. Таким образом, интерес к поиску и изучению новых перспективных источников антоцианов растительного происхождения в настоящее время высок. Одним из таких источников является арония Мичурина или рябина черноплодная - широко культивируемый в нашей стране и ближнем зарубежье кустарник рода Арония, который является гибридом аронии черноплодной и рябины обыкновенной [20, 23]. Антоцианы считаются основной группой биологически активных веществ (БАВ) плодов всех представителей рода Арония. В них представлены производные цианидина: цианидин-3-О-глюкозид, цианидин-3-О-арабиноз, цианидин-3-О-галактозид и цианидин-3-О-ксилозид [15, 22], преобладающим из которых по ряду исследований является галактозид [4], хотя количественное определение проводится в пересчете на глюкозид [3, 10]. Кроме того, качественно в плодах были обнаружены пеларгонидин-3-арабинозид и пеларгонидин-3-галактозид [25]. Исследования состава БАВ листьев представителей рода Арония, в том числе и аронии Мичурина ограничены. Подтверждено присутствие в них флавоноидов, дубильных веществ, сапонинов, аскорбиновой кислоты [2, 17], а также антоцианов в лейкоформах [11, 18]. Существуют данные о присутствии в листьях аронии цианидин-3-галактозида и цианидин-3-арабинозида с преобладанием первого [24]. Представленные данные делают перспективным более глубокое изучение содержания в аронии Мичурина листьях антоциановых соединений. На этапе предварительных исследований была разработана методика количественного спектрофотометрического определения антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид в листьях аронии Мичурина [18, 19]. Целью работы являлась валидация спектрофотометрической методики количественного определения суммы антоцианов в аронии Мичурина листьях, как завершающего этапа ее разработки и внедрения в нормативную документацию. Методика Объектом исследования служили высушенные аронии Мичурина листья сорта «Мулатка», заготовленные от культивируемого растения в Тамбовской области в 2022-2023 г. Сушку проводили воздушно-теневым методом до остаточной влажности, не превышающей 10%. Валидацию проводили на сырье, заготовленном в сентябре 2022 г. С помощью валидированной методики определяли содержание антоцианов в листьях, заготовленных в 2023 г. на разных стадиях развития растения: образец 1 - на стадии цветения, май (влагосодержание 9,12%); образец 2 - на стадии начала плодоношения, июнь (влагосодержание 9,16%); образец 3 - на стадии зрелости плодов, август (влагосодержание 9,48%); образец 4 - на стадии начала покраснения листьев, сентябрь (влагосодержание 9,52%). Количественное определение проводили по следующей методике [18, 19]: около 0,2 г (точная навеска) сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито размером 0,5 мм, помещают в колбу со шлифом, вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 96% спирта этилового, подкисленного кислотой хлористоводородной до концентрации 1% и взвешивают. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 3,5 часов. Охлаждают до комнатной температуры, взвешивают и при необходимости доводят подкисленным 96% этиловым спиртом до первоначальной массы. Охлажденную смесь фильтруют через бумажный фильтр, отбрасывая первые 10 мл фильтрата. 2 мл полученного излечения помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора экстрагентом до метки, перемешивают. В качестве раствора сравнения используют 96% спирт этиловый, подкисленный кислотой хлористоводородной до концентрации 1%. Определяют оптическую плотность в максимуме поглощения (рис. 1) при длине волны 540±2 нм. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ «Спектр», Россия). Рис. 1. Вид спектра поглощения извлечения из листьев аронии Мичурина, полученного с применением подкисленного спирта этилового 96% Валидацию разработанной методики проводили в соответствии с ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик» по показателям специфичности, правильности, линейности, сходимости, межлабораторной прецизионности [3]. Статистическая обработка результатов проведена в Microsoft Excel 2016. Результаты исследования и их обсуждение Основные метрологические характеристики методики представлены в табл. 1. В качестве опорного значения при валидации принято содержание 9,82±0,4% в сырье. Таблица 1. Метрологические характеристики спектрофотометрического определения антоцианов в листьях аронии Мичурина (P=95%, t (P, f)=2,57) ,% n f S,% ∆x ∆ 9,82 6 5 0,13 0,39 0,16 1,60 0,99 0,40 4,11 Специфичность методики оценивали по совпадению положения максимумов на спектрах поглощения индивидуального цианидин-3-О-глюкозида (литературные данные) и исследуемого извлечения (рис. 1). Для цианидин-3-О-глюкозида характерен широкий пологий максимум поглощения, расположенный при 540±2 нм [3]. Линейность подтверждали путем приготовления растворов, отбирая извлечение в диапазоне от 70 до 130% номинального значения (табл. 2). Таблица 2. Схема разбавления извлечения для определения линейности методики Концентрация, % от исходного Объем извлечения, мл Объем разведения, мл 70% 2,1 25 80% 2,4 25 90% 2,7 25 100% 3,0 25 110% 3,3 25 120% 3,6 25 130% 3,9 25 Зависимость оптической плотности от содержания суммы антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид линейна, что отражено на рис. 2 и подтверждается значением коэффициента корреляции, близким к 1,0. Рис. 2. График линейной зависимости оптической плотности от содержания антоцианов в извлечении в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид Сходимость методики определялась в шести повторениях одним исполнителем. Межлабораторную прецизионность подтверждали проведением измерения разными исполнителями в разные дни в шести повторениях каждый. Результаты приведены в табл. 3. Относительные стандартные отклонения не превысили критериев приемлемости в 5%. Правильность методики считается доказанной, если свободный член уравнения линейности меньше своего доверительного интервала. В нашем случае свободный член равен нулю. Таким образом, было доказано, что разработанная методика валидна и, как следствие, может использоваться для определения содержания антоцианов в листьях аронии Мичурина для цели их стандартизации. С помощью валидированной методики определяли оптимальные сроки заготовки аронии Мичурина листьев, обеспечивающие максимальное содержание антоцианов в них (табл. 4). Согласно полученным данным, содержание антоцианов в листьях аронии Мичурина достаточно высоко во все периоды заготовки. Максимальным оно является в сырье, заготовленном на стадии начала покраснения листьев в сентябре 12,77%±0,95% (фаза начала покраснения листьев). Литературные данные о результатах исследования содержания антоцианов в листьях рябины черноплодной также подтверждают, что при заготовке сырья в осенний период уровень антоцианов выше [11]. Таблица 3. Валидационные характеристики методики определения антоцианов в аронии Мичурина листьях Характеристика Статистическая характеристика Результат Сходимость Проба Содержание суммы антоцианов, % 1 9,60 2 9,72 3 9,21 4 10,16 5 10,02 6 10,20 Доверительный интервал (Р=95%), % 9,82±0,40 Относительное стандартное отклонение (RSD), % 1,60 Cтандартное отклонение (SD), % 0,42 Межлабораторная прецизионность Проба Исследователь 1 (день 1) Исследователь 2 (день 2) 1 9,21 8,01 2 9,60 8,12 3 9,72 8,18 4 10,16 8,53 5 10,02 8,93 6 10,20 8,97 Доверительный интервал (Р=95%), % 9,17±1,42 Относительное стандартное отклонение (RSD), % 2,90 Cтандартное отклонение (SD), % 0,92 Таблица 4. Содержание антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид в листьях аронии Мичурина различных сроков заготовки Фаза сбора Содержание антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид, % май 10,71±1,33 июнь 10,81±1,01 август 11,62±0,69 сентябрь 12,77±0,95 Известно, что на содержание антоцианов в ЛРС значительно влияют регион произрастания, особенности культивирования, загрязненность почвы, а также совокупность погодных условий за период вегетации растения в разные годы [8, 13]. Для оценки влияния данных факторов на накопление изучаемых БАВ в листьях провели определение в ЛРС 2022 и 2023 гг. заготовки (табл. 5). Результаты отражены на рис. 3. Информация о погодных условиях заимствована с официального сайта www.pogodaiklimat.ru (дата обращения октябрь 2023 г). Таблица 5. Содержание антоциановых соединений в листьях различных годов заготовки № п/п Погодные условия 2022 г. 2023 г. 1 Количество осадков (суммарно с мая по сентябрь) 344 мм 183 мм 2 Средняя температура: Июнь; Июль; Август; За 3 месяца 19,5 20,8 23,0 21,1 17,0 19,8 21,0 19,3 3 Количество солнечных дней (суммарно с мая по сентябрь) 11 19 4 Тип почв Чернозём Чернозём Накоплению лейкоантоцианов в листьях способствует увеличение количества солнечных дней за период вегетации. Снижение среднесуточной температуры и количества осадков, по всей видимости, оказывает стимулирующий эффект на процессы биосинтеза данной группы БАВ в качестве защитной реакции растительного организма на ухудшающиеся факторы окружающей среды. Однако, данные результаты нуждаются в дополнительных подтверждающих исследованиях Высокое содержание антоцианов в исследуемом сырье подтверждает перспективность использования его для получения препаратов с АОА. Рис. 3. Содержание антоциановых соединений в листьях аронии Мичурина (фаза заготовки - сентябрь) Согласно данным рис. 3, при разработке раздела «Количественное определение» проекта ФС «Аронии Мичурина листья» для ГФ РФ, следует рекомендовать числовое значение данного критерия не менее 5%. Сравнительно с другими видами растительного сырья содержание антоцианов сопоставимо или выше (табл. 6) [3, 5, 7, 12, 26]. Таблица 6. Результаты анализа литературных данных о содержании антоцианов в растительных источниках в пересчете на цианидин-3-глюкозид Растительный источник Содержание антоцианов, % Рябины черноплодной плоды 0,98-3,70 Аронии черноплодной плоды свежие Не менее 4 Аронии черноплодной плоды сухие Не менее 3 Василька синего цветки Не менее 0,6* Черники обыкновенной плоды Не менее 0,5 Бузины канадской плоды 1,77-2,43 Черной смородины плоды 5,86-6,44 Черемухи виргинсой плоды 7,30-10,40 Примечание: * - в пересчете на цианидин-3,5-дигликозид Заключение В работе подтверждено, что ранее разработанная методика спектрофотометрического определения антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид в аронии Мичурина листьях валидна и может использоваться для цели их стандартизации. С применением разработанной методики определено, что оптимальным сроком заготовки сырья для обеспечения максимального выхода антоцианов является сентябрь. Содержание изучаемой группы БАВ сопоставимо или выше, чем в других, в том числе фармакопейных видов растительного сырья - источников антоцианов. Изучение вариабельности накопления антоцианов в сырье свидетельствует о том, что в качестве числового значения показателя содержания антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид для ФС «Аронии Мичурина листья» можно рекомендовать норматив не менее 5%. Полученные результаты количественного содержания антоцианов в аронии Мичурина листьях показывает перспективность использования данного сырья как источника БАВ с целью дальнейшего получения лекарственных растительных препаратов с АОА.

Об авторах

Ольга Валериевна Пугачева

Воронежский государственный университет

Email: email@example.com
преподаватель кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» Россия, 394018, Воронеж, Университетская пл., 1

Ольга Валерьевна Тринеева

Воронежский государственный университет

Email: email@example.com
доктор фармацевтических наук, доцент, профессор кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» Россия, 394018, Воронеж, Университетская пл., 1

Карина Евгеньевна Панова

Воронежский государственный университет

Email: email@example.com
студентка 4-го курса СПО фармацевтического факультета ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» Россия, 394018, Воронеж, Университетская пл., 1

Список литературы

Дополнительные файлы