РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ИЗОЛИРОВАНИЯ КАРБАМАЗЕПИНА ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

Полный текст

Введение Эпилепсия является распространенным неврологическим расстройством. Важно отметить, что эпилепсия связана с психическими сопутствующими заболеваниями, включая депрессию, беспокойство и психоз. При эпилепсии распространенность самоубийств вдвое выше, чем среди населения в целом [9]. Терапевтический мониторинг лекарственных средств может внести значительный вклад в область лечения эпилепсии, позволив эффективно оптимизировать терапию, подобрать индивидуальные схемы дозирования, установить оптимальный диапазон концентраций в крови человека и сравнить концентрации при которых судороги сдерживаются или при которых возникают побочные эффекты, специфичные для противоэпилептических препаратов. Карбамазепин является противоэпилептическим средством и в настоящее время с успехом применяется для лечения генерализованных тонико-клонических судорог, а также простых и сложных парциальных припадков. Не утратило своего значения и направление терапии, по которому применили карбамазепин - лечение нейропатической боли (невралгия тройничного нерва и пр.). Препарат обычно хорошо переносится. Однако имеются данные об аллергических реакциях, лейкопении, тромбоцитопении, агранулоцитозе, кожных реакциях. В процессе лечения карбамазепином необходимо систематически следить за картиной крови. При передозировке карбамазепин может быть опасным для жизни [2, 3, 4]. Поэтому необходим терпевтический мониторинг для помощи в клиническом лечении пациентов с карбамазепиновой токсичностью. В судебно-химической практике карбамазепин изучен недостаточно. При производстве судебно-химических экспертиз для обнаружения препарата предложены реакции окрашивания, хроматография в тонком слое сорбента, флюоресцентно-поляризационный иммуноанализ, спектрофотометрия. Для изолирования использованы методы извлечения подкисленной водой или спиртом. Количественное определение рекомендовано проводить колориметрическим методом по продуктам гидролиза или окисления [1, 5]. В зарубежной литературе опубликованы данные об одновременном определении карбамазепина и его метаболитов в биологических жидкостях и лекарственных препаратах с использованием методов жидкость-жидкостной экстракции, дисперсионной жидкость-жидкостной микроэкстракции, твердо-фазной экстракции [8]. Высокоэффективная жидкостная хроматография была выбрана для определения карбамазепина в пробах воды, в тканях моллюска [7], в плазме кролика [8]. Описан метод определения карбамазепина в сыворотке крови человека на основе метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием метода трехсторонней калибровки [6]. Ряд методик требуют дорогостоящего оборудования, высококвалифицированный персонал, трудоемкий процесс подготовки образцов. Таким образом, единый подход к выделению и определению карбамазепина согласно литературным данным отсутствует, поэтому существует необходимость в разработке методов его изолирования, идентификации и количественного определения. В данной работе предложены условия для выделения карбамазепина из биологических объектов учитывающие такие факторы как: доступность реагентов, оптимальное время выполнения работ, для количественной оценки использован метод выскокоэффективной жидкостной хроматографии, характеризующийся высокой чувствительностью, позволяющий работать с низкими концентрациями веществ, специфичностью, экспрессностью. Цель исследования - провести исследования, направленные на разработку методов изолирования карбамазепина из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки). Методика Для изучения экстракции карбамазепина из водных растворов методом жидкость-жидкостной экстракции в качестве экстрагентов использовали следующие органические растворители: гексан, хлороформ, диэтиловый эфир, метилтретбутиловый эфир, этилацетат, смесь хлороформ-пропанол-1 (9:1). Исследования проводили на стандартных водных растворах карбамазепина с концентрацией 10 мкг/мл. Учитывая основные свойства карбамазепина, экстракцию осуществляли из щелочной среды (рН 9-10). Методика экстракции: к 500 мкл водного раствора аналита в пробирке типа Эппендорф добавляли 50 мкл раствора аммония гидроксида 10%, 1000 мкл экстрагента. Проводили однократную экстракцию путем встряхивания на шейкере в течение 5 минут. Органическую и водную фазы разделяли путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 5 минут, слой экстрагента после отделения упаривали в токе теплого воздуха, затем для дальнейшего исследования сухой остаток растворяли в 500 мкл элюента (фосфатный буферный раствор (рН 3) - ацетонитрил (60:40)). В качестве биологических образцов для проведения исследований выбраны: биологические жидкости (кровь, моча) и биологические ткани (печень и почки интактных лабораторных животных (крыс)). Изолирование карбамазепина из мочи и крови проводили с использованием модельных смесей с концентрацией карбамазепина 1, 10, 100 мкг/мл. В качестве экстрагентов были апробированы хлороформ и метилтретбутиловый эфир, показавшие максимальную эффективность при экстракции соединения из его водных растворов. Извлечение карбамазепина из модельных образцов мочи осуществляли по следующей методике: к 1000 мкл модельной смеси в пробирке типа Эппендорф добавляли 100 мкл раствора аммония гидроксида 10%, 1000 мкл экстрагента, однократно экстрагировали путем встряхивания на шейкере 5 минут. Содержимое пробирки центрифугировали со скоростью 5000 об/мин в течение 5 минут, слой экстрагента после отделения упаривали в токе теплого воздуха, затем сухой остаток растворяли в 500 мкл элюента. Изолирование карбамазепина из крови осуществляли следующим образом: к 250 мкл модельной смеси в пробирке типа Эппендорф добавляли 50 мкл раствора аммония гидроксида 10%, 1000 мкл экстрагента, однократно экстрагировали путем встряхивания на шейкере 5 минут. Содержимое пробирки встряхивали на лабораторном шейкере в течение 5 минут, затем центрифугировали 5 минут при 10000 об/мин. Слой экстрагента отделяли, упаривали в токе теплого воздуха, сухой остаток растворяли в 500 мкл элюента. Изучение условий изолирования карбамазепина из внутренних органов (печени и почки). Для приготовления модельных смесей биологический образец гомогенизировали в дистиллированной воде (1:4) с помощью ультразвукового гомогенизатора. К 10 г гомогената ткани добавляли 250, 500, 1000 мкл водного раствора карбамазепина с концентрацией 100 мкг/мл (вносимое количество - 25, 50, 100 мкг). Методика изолирования: модельную смесь в конической колбе вместимостью 100 мл заливали 10 мл растворителя. Учитывая хорошую растворимость карбамазепина в полярных растворителях, для извлечения апробированы подкисленные до рН 2 вода и ацетонитрил. Содержимое колбы настаивали при постоянном перемешивании в течение 1 часа. Вытяжку центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант отделяли, подщелачивали раствором аммония гидроксида 25% до рН 10 и проводили двукратную экстракцию органическим растворителем (хлороформ, метилтретбутиловый эфир) порциями по 5 мл. Время каждой экстракции составляло 5 минут. Объединенные извлечения упаривали в токе теплого воздуха, сухой остаток растворяли в 1 мл элюента. Полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 5 мкм. Эффективность экстракции оценивали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в режиме изократического элюирования с использованием диодно-матричного детектора: хроматографическая колонка: ZORBAX SB-С18 (4,6 х 250 мм х 5 мкм); подвижная фаза (А-В): фосфатный буферный раствор (рН 3) - ацетонитрил (60:40); скорость потока подвижной фазы: 1,0 мл/мин; температура термостата колонки: 40°С. По результатам эксперимента при выделении карбамазепина из образцов биообъектов проведено валидирование предложенных условий с получением удовлетворительных результатов по показателям специфичность, линейность, повторяемость. Результаты исследования В проведенном эксперименте оценивали эффективность извлечения карбамазепина из водных растворов, крови, мочи, гомогенизированной ткани печени и почки в зависимости от следующих условий: природы изолирующего агента на стадии настаивания, природы экстрагента, количества вносимого в модельную смесь вещества. Данные о степени извлечения карбамазепина представлены в таблицах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Таблица 1. Результаты исследований по изучению степени извлечения карбамазепина из водных растворов Растворитель Гексан Хлороформ Хлороформ-пропанол - 1 (9:1) Метилтретбутиловый эфир Диэтиловый эфир Этилацетат Степень извлечения, % (n=6) 15,40 93,26 90,19 92,21 80,17 85,37 16,41 93,32 90,15 92,21 81,07 81,37 16,60 93,58 90,88 92,87 81,51 85,30 16,46 93,94 90,10 91,97 81,71 85,20 16,42 93,89 91,17 92,11 82,05 84,39 15,42 94,38 92,13 92,74 82,27 82,06 Метрологические характеристики Xср. = 16,12 Xср. = 93,73 Xср. = 90,77 Xср. = 92,35 Xср. = 81,46 Xср. = 83,95 SD = 0,55 SD = 0,42 SD = 0,79 SD = 0,36 SD = 0,76 SD = 1,78 RSD = 3,43% RSD = 0,45% RSD = 0,88% RSD = 0,39% RSD = 0,93% RSD = 2,12% Таблица 2. Результаты исследований по изучению эффективности извлечения карбамазепина из мочи (модельные смеси, %, n=6) Концентрация карбамазепина в модельной смеси, 1 мкг/мл Концентрация карбамазепина в модельной смеси, 10 мкг/мл Концентрация карбамазепина в модельной смеси, 100 мкг/мл Метилтретбути-ловый эфир Хлороформ Метилтретбути-ловый эфир Хлороформ Метилтретбути-ловый эфир Хлороформ 75,08 91,98 70,58 89,28 71,23 91,12 77,15 90,45 72,95 90,10 74,11 91,47 76,77 93,25 76,54 92,13 70,12 92,69 75,35 90,66 70,93 90,22 71,66 88,93 76,52 93,39 74,11 90,44 69.70 90,96 76,24 90,84 75,35 92,94 71,24 91,81 Метрологические характеристики Xср. = 76,19 Xср. = 91,76 Xср. = 73,41 Xср. = 90,85 Xср. = 71,34 Xср. = 91,16 SD = 0,8133 SD = 1,319 SD = 2,384 SD = 1,386 SD = 1,548 SD = 1,255 RSD = 1,067% RSD = 1,437% RSD = 3,248% RSD = 1,525% RSD = 2,169% RSD = 1,377% Установлено, что наиболее полно карбамазепин из водных щелочных растворов извлекается хлороформом и метилтретбутиловым эфиром. Введение в хлороформ полярного растворителя пропанола-1 привело к некоторому снижению экстракции карбамазепина. Таблица 3. Результаты исследований по изучению эффективности извлечения карбамазепина из крови (модельные смеси, %, n=6) Концентрация карбамазепина в модельной смеси, 1 мкг/мл Концентрация карбамазепина в модельной смеси, 10 мкг/мл Концентрация карбамазепина в модельной смеси, 100 мкг/мл Метилтретбути-ловый эфир Хлороформ Метилтретбути-ловый эфир Хлороформ Метилтретбути-ловый эфир Хлороформ 68,56 88,92 63,60 89,91 66,75 85,09 69,49 91,81 68,71 86,71 68,86 88,29 67,27 88,97 65,36 90,58 69,75 87,46 70,68 86,89 65,77 92,41 67,81 86,83 69,60 90,49 68,21 91,15 67,74 92,79 68,24 90,73 67,11 92,09 69,85 85,19 Метрологические характеристики Xср. = 68,97 Xср. = 89,64 Xср. = 66,46 Xср. = 90,47 Xср. = 68,46 Xср. = 87,61 SD = 1,199 SD = 1,741 SD = 1,919 SD = 2,065 SD = 1,235 SD = 2,833 RSD = 1,738% RSD = 1,942% RSD = 2,887% RSD = 2,282% RSD = 1,803% RSD = 3,234% Полученные данные свидетельствуют о том, что карбамазепин более полно извлекается из биожидкостей хлороформом (88-93 % из мочи; 85-92 % из крови). Таблица 4. Результаты исследований по изучению степени выделения карбамазепина из ткани печени при использовании на стадии настаивания подкисленной воды (модельные смеси, %, n=6) Внесено 25 мкг карбамазепина Внесено 50 мкг карбамазепина Внесено 100 мкг карбамазепина Метилтретбути-ловый эфир Хлороформ Метилтретбут-иловый эфир Хлороформ Метилтретбутиловыйэфир Хлороформ 64,50 69,69 64,42 74,30 60,57 72,47 60,35 72,07 62,83 69,76 61,38 71,42 63.50 74,40 63,48 71,80 64,78 70,14 63,06 73,50 64,62 72,64 63,16 71,24 63,42 67,16 61,17 68,40 59,40 71,07 61,03 68,10 61,44 70,11 61,79 70,54 Метрологические характеристики Xср. = 62,64 Xср. = 70,82 Xср. = 62,99 Xср. = 71,17 Xср. = 61,85 Xср. = 71,15 SD = 1,601 SD = 2,954 SD = 1,462 SD = 2,151 SD = 1,906 SD = 0,803 RSD = 2,556% RSD = 4,171% RSD = 2,320% RSD = 3,023% RSD = 3,082% RSD = 1,128% Таблица 5. Результаты исследований по изучению степени выделения карбамазепина из ткани печени при использовании на стадии настаивания подкисленного ацетонитрила (модельные смеси, %, n=6) Внесено 25 мкг карбамазепина Внесено 50 мкг карбамазепина Внесено 100 мкг карбамазепина Метилтретбути-ловый эфир Хлороформ Метилтретбут-иловый эфир Хлороформ Метилтретбутиловыйэфир Хлороформ 65,92 84,05 72,98 84,88 72,86 83,83 67,31 78,32 73,80 81,83 71,26 80,41 69,09 78,96 72,62 83,19 70,11 81,14 67,51 82,96 70,45 83,41 69,75 82,38 65,89 85,64 70,61 82,93 69,80 80,12 66,33 83,11 69,25 78,05 70,28 81,15 Метрологические характеристики Xср. = 67,01 Xср. = 82,17 Xср. = 71,62 Xср. = 82,38 Xср. = 70,68 Xср. = 81,51 SD = 1,231 SD = 2,905 SD = 1,767 SD = 2,338 SD = 1,201 SD = 1,382 RSD = 1,836% RSD = 3,536% RSD = 2,467% RSD = 2,837% RSD = 1,699% RSD = 1,695% Таблица 6. Результаты исследований по изучению степени извлечения карбамазепина из ткани почки при использовании на стадии настаивания подкисленной воды (модельные смеси, %, n=6) Внесено 25 мкг карбамазепина Внесено 50 мкг карбамазепина Внесено 100 мкг карбамазепина Метилтретбути-ловый эфир Хлороформ Метилтретбут-иловый эфир Хлороформ Метилтретбутиловыйэфир Хлороформ 60,92 66,63 64,24 71,32 64,79 70,87 57,61 69,49 61,14 70,73 60,09 70,94 66,14 70,21 60,83 70,53 60,59 71,58 62,67 71,29 61,04 70,54 60,49 72,41 62,26 65,89 61,50 70,92 62,68 72,03 64,45 73,69 62,25 72,09 64,96 73,07 Метрологические характеристики Xср. = 62,34 Xср. = 69,53 Xср. = 61,83 Xср. = 71,02 Xср. = 62,27 Xср. = 71,82 SD = 2,946 SD = 2,916 SD = 1,28 SD = 0,599 SD = 2,213 SD = 0,859 RSD = 4,726% RSD = 4,194% RSD = 2,070% RSD = 0,8447% RSD = 3,555% RSD = 1,196% Таблица 7. Результаты исследований по изучению степени извлечения карбамазепина из ткани почки при использовании на стадии настаивания подкисленного ацетонитрила (модельные смеси, %, n=6) Внесено 25 мкг карбамазепина Внесено 50 мкг карбамазепина Внесено 100 мкг карбамазепина Метилтретбути-ловый эфир Хлороформ Метилтретбут-иловый эфир Хлороформ Метилтретбутиловыйэфир Хлороформ 65,02 81,43 70,83 82,19 68,76 83,53 67,06 81,70 70,94 80,77 68,31 81,15 68,95 85,41 71,45 82,98 69,67 81,87 70,50 81,18 71.36 83.17 70,66 83,02 65,64 83,44 68,71 82,51 71,36 79,64 61,84 79,90 69,72 78,65 71,76 80,93 Метрологические характеристики Xср. = 66,5 Xср. = 82,18 Xср. = 70,5 Xср. = 81,71 Xср. = 70,09 Xср. = 81,69 SD = 3,065 SD = 1,95 SD = 1,073 SD = 1,724 SD = 1,403 SD = 1,432 RSD = 4,608% RSD = 2,373% RSD = 1,522% RSD = 2,110% RSD = 2,002% RSD = 1,753% Полярные растворители (вода, ацетонитрил) эффективны в качестве изолирующих агентов для карбамазепина из биологических тканей. Степень извлечения карбамазепина хлороформом из биологических тканей при использовании на стадии настаивания подкисленной воды составляет 65-74%, при использовании подкисленного ацетонитрила - 78-85% Обсуждение результатов исследования Полученные результаты исследования показали, что хлороформ и метилтретбутиловый эфир перспективны для разработки методик пробоподготовки биологических объектов на основе жидкость-жидкостной экстракции. Для экстрагирования карбамазепина из биологических жидкостей предложено использовать хлороформ. Результаты изучения условий изолирования карбамазепина из биологических тканей (печени и почки) показали, что подкисленные полярные растворители (вода, ацетонитрил) эффективны в качестве изолирующих агентов для карбамазепина. Максимальное извлечение карбамазепина на всех уровнях концентраций достигалось при использовании на стадии экстракции молекулярной формы аналита хлороформа. Несмотря на то, что получены сопоставимые результаты по степени извлечения вещества, как при использовании воды, так и ацетонитрила, в качестве оптимального изолирующего агента рекомендован ацетонитрил. При выборе растворителя руководствовались следующими фактами: ацетонитрильное извлечение визуально более чистое по сравнению с водным, быстро фильтруется, при встряхивании с хлороформом практически не образует эмульсию. В соответствии с разработанной методикой изолирования карбамазепина провели эксперименты с «холостыми» пробами. Установлено, что на хроматограммах всех исследованных образцов отсутствуют интерферирующие пики со временами удерживания, близкими к карбамазепину. Выводы 1. Изучен процесс экстракции карбамазепина из водных растворов с рН 9-10. Полученные данные показали, что хлороформ и метилтретбутиловый эфир перспективны для экстракционных методик пробоподготовки биологических объектов. 2. На модельных смесях разработаны условия жидкость-жидкостной экстракции карбамазепина из биологических жидкостей. Для биоматериала в качестве оптимального растворителя на стадии настаивания тканей выбран ацетонитрил, в качестве экстрагента - хлороформ. 3. Оценена специфичность хроматографических условий с учетом отсутствия интерферирующих пиков со временами удерживания, близкими к карбамазепину, на хроматограммах всех исследованных образцов.

Об авторах

Наталия Александровна Хабиева

Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы Министерства Здравоохранения Республики Татарстан

Email: email@example.com
заведующий отделением ГАУЗ «Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ РТ» Россия, Республика Татарстан, 420029, Казань, Сибирский тракт, 31А

Елена Николаевна Люст

Пермская государственная фармацевтическая академия

Email: email@example.com
кандидат фармацевтических наук, доцент, доцент кафедры токсикологической химии ФГБОУ ВО «Пермская государственная медицинская академия» Минздрава России Россия, 614990, Пермь, ул. Екатерининская, 101

Марат Исмагилович Тимерзянов

Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы Министерства Здравоохранения Республики Татарстан

Email: email@example.com
доктор медицинских наук, начальник ГАУЗ «Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ РТ» Россия, Республика Татарстан, 420029, Казань, Сибирский тракт, 31А

Список литературы

Дополнительные файлы