ИЗУЧЕНИЕ И ВАЛИДАЦИЯ УСЛОВИЙ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Полный текст

Введение Туберкулез - опасное инфекционное заболевание, до сих пор являющееся одной из ведущих причин смертности. Несмотря на снижение общей заболеваемости, с каждым годом увеличивается число более опасных форм туберкулеза - с широкой и множественной устойчивостью [9]. Причины возникновения резистентности микобактерий к существующей терапии различны. Залог эффективной терапии - обеспечение точности дозирования лекарственного препарата за счет количественного состава лекарственной формы, советующей требованиям нормативной документации [3]. Основа безопасности и эффективности любого лекарственного препарата - его качество. Для оценки данной характеристики современный фармацевтический анализ располагает широким спектром методом, основанных на протекании физических и химических процессов и их комбинации. В первую очередь Государственная фармакопея РФ предлагает к использованию именно физико-химические методы, как более чувствительные и селективные. Но далеко не все из существующих методик доступны абсолютно всем лабораториям. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) позволяет комплексно проводить оценку качества субстанций и лекарственных форм. Для количественной оценки исследуемых препаратов рифабутина, перхлозона и теризидона в литературе [1, 4, 15] и нормативной документации [5, 6, 7, 8, 10, 11] предложены методики, ориентированные на использование импортного оборудования и комплектующих, однако высокая стоимость хроматографов, расходных материалов и реактивов особой степени очистки и в целом приостановление сотрудничества с зарубежными производителями оборудования в виду антироссийских санкций может стать серьезным препятствием для широкого использования метода в небольшой лаборатории [13]. Одним из шагов к повышению доступности может стать применение прибора отечественного производства и микроколонок. Уменьшение размеров колонки позволяет сократить расход элюентов и сорбентов, временные затраты на осуществление анализа, а снижение рабочего давления позволяет предъявлять менее жесткие требования к оборудованию [12]. Целью исследования являлось изучение особенностей хроматографического определения, разработка и валидация методик количественной оценки рифабутина, перхлозона и теризидона в субстанции и лекарственной форме с применением хроматографического оборудования российского производства. Методика В качестве объектов исследования выступали субстанции противотуберкулезных препаратов: рифабутина, перхлозона и теризидона и их лекарственные формы: капсулы Фарбутин 150 мг (производство АО «Фармасинтез»); таблетки, покрытые пленочной оболочкой Перхлозон 200 мг и 400 мг (производство АО «Фармасинтез»); капсулы Локсидон 150 мг, 250 мг и 300 мг (производство АО «Фармасинтез»);. Хроматографирование выполняли на отечественном микроколоночном жидкостном хроматографе с УФ-спектрофотометрическим детектором «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова», Новосибирск) с колонкой (75 х 2 мм), заполненной обращенной фазой ProntoSIL-120-5-C18 AQ («Bischoff Analysentechnik und Gerate GmbH», Германия). Для приготовления растворов и приготовления элюентов использовали растворители: метанол (перегоняли перед использованием), ацетонитрил (НПК «Криохром», сорт 0, г. Санкт-Петербург, Россия), диметилсульфоксид (АО «Усолье-Сибирский химфармзавод», г Усолье-Сибирское, Россия), ацетат аммония (ООО «Компания Хеликон», Москва, Россия) и дистиллированную воду и оборудование: центрифугу «Eppendorf» (13200 об./мин); рН-метр «Анион 4100»; ванну ультразвуковую «Sonorex» («Bandelin», Германия). Обработку данных осуществляли с помощью программы МультиХром. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью методов вариационной статистики, регрессионного анализа в соответствии с ОФС «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» [2]. С применением методов вариационной статистики оценивали однородность выборки и расчет показателей: среднего значения, дисперсии S2, стандартного отклонения S, стандартного отклонения среднего результата Sr, полуширины доверительного интервала ∆x, относительной ошибки результата единичного определения Ε,% и относительного стандартного отклонения Sx. Регрессионный анализ применяли для оценки линейности методик с помощью метода наименьших квадратов. Методика приготовления разведения лекарственной формы рифабутина. Точную навеску содержимого капсул рифабутина (около 0,2500 г) помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяли в 20 мл метанола и доводили до метки тем же растворителем. Аликвоту 1 мл помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят до метки метанолом. Аликвоту суспензии объемом около 1 мл переносили в пробирку и центрифугируют (5 мин., 13400 оборотов/минуту). Супернатант использовали для хроматографического анализа. Раствор готовили перед использованием. Методика приготовления рабочего стандартного образца рифабутина. Точную навеску субстанции рифабутина (около 0,0500 г) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 50 мл метанола и доводили до метки тем же растворителем. Раствор готовили перед использованием. Хранят в темноте. Методика приготовления разведения лекарственной формы перхлозона. Точную навеску растертых таблеток перхлозона около (0,1000 г) помещали в мерную колбу объемом 100 мл, добавляют 50 мл метанола, обрабатывали в УЗ ванне (подробнее об этом 15 мин, Ткомн.) и доводили до метки метанолом. Аликвоту 5 мл помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили до метки тем же растворителем. Аликвоту суспензии объемом около 1 мл переносили в пробирку и центрифугируют (5 мин., 13 400 об/мин). Супернатант использовали для хроматографического анализа. Раствор готовили перед использованием. Методика приготовления разведения рабочего стандартного образца перхлозона. Точную навеску субстанции перхлозона (около 0,1500 г) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 50 мл метанола и доводили до метки тем же растворителем. Аликвоту 25 мл помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки тем же растворителем. Методика приготовления разведения лекарственной формы теризидона. Точную навеску содержимого капсул теризидона (около 0,1000 г) помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляли 1,5 мл диметилсульфоксида (ДМСО), 20-25 мл раствора ацетонитрил : вода (50:50), обрабатывали в УЗ ванне (15 мин., Ткомн.) и доводили до метки тем же растворителем. Аликвоту 5 мл помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл доводили до метки раствором ацетонитрил: вода (50:50). Аликвоту суспензии объемом около 1 мл переносили в пробирку и центрифугировали (5 мин., 13400 оборотов/минуту). Супернатант использовали для хроматографического анализа. Раствор готовили перед использованием. Методика приготовления разведения рабочего стандартного образца теризидона. Точную навеску субстанции теризидона (около 0,0100 г) помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляли 1,5 мл диметилсульфоксида (ДМСО), 25 мл раствора ацетонитрил: вода (50:50), обрабатывали в УЗ ванне (15 мин, Ткомн.) и доводили до метки раствором ацетонитрил: вода (50:50). Результаты исследования и их обсуждение В процессе подбора оптимальных условий хроматографирования (табл. 1) исследуемых веществ было учтено влияние различных факторов. С целью минимизации взаимодействий образцов с неподвижной фазой в виду наличия в структуре атомов азота, имеющих не поделенную электронную пару, использовался полимерный сорбент ProntoSIL-120-5 C18 AQ с гидрофильным эндкеппингом. Растворители, предлагаемые в качестве подвижной фазы, обладали высокой прозрачностью и не содержали примесей поглощающих УФ-излучение. Экспериментально подобранные оптимальные условия хроматографирования исследуемых веществ представлены в табл. 1. Использование данных составов подвижной фазы обеспечивает получение симметричных пиков на хроматограмме (рис. 1-3), что подтверждают данные расчета коэффициента асимметрии пиков (не более 1,5). Подтверждение идентичности исследуемых веществ производилось по соответствию объемов удерживания исследуемых и стандартных растворов. Повышение точности определения достигалось расчетом спектральных отношений. Параметры пригодности хроматографической системы представлены в табл. 2. Таблица 1. Оптимальные хроматографические условия определения рифабутина, перхлозона и теризидона Хроматографический параметр Рифабутин Перхлозон Теризидон Колонка 2×75 мм; ProntoSIL-120-5 C18 AQ 2×75 мм; ProntoSIL-120-5 C18 AQ 2×75 мм; ProntoSIL-120-5 C18 AQ Состав подвижной фазы Элюент A: Аммония ацетата раствор 0,02 M (pH 6.5); Элюент Б: Ацетонитрил Элюент A: Аммония ацетата раствор 0,02 M (pH 6,5); Элюент Б: Ацетонитрил Элюент A: 0,1% раствор трифторуксусной кислоты в воде; Элюент Б: 0,1% раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле Режим элюирования изократический, 70% Б изократический, 15% Б изократический, 25% Б. Скорость потока 150 мкл/мин 150 мкл/мин 150 мкл/мин Температура термостата 35oC 35oC 35oC Объем вводимой пробы 2 мкл 2 мкл 2 мкл Длина волны 240 312 260 Таблица 2. Характеристики пригодности хроматографической системы. Препарат Площадь пика Коэффициент асимметрии Количество теоретических тарелок Объем удерживания, мкл Перхлозон 73,38 1,11 6630 698 Рифабутин 40,55 0,90 3716 902 Теризидон 25,72 1,0 2548 865 Рис. 1. Хроматограмма разведения рабочего стандартного образца рифабутина: пик 1 - рифабутин Рис. 2. Хроматограмма разведения рабочего стандартного образца перхлозона: пик 1 - перхлозон Рис. 3. Хроматограмма разведения рабочего стандартного образца теризидона: пик 1 - теризидон Вышеописанные условия были использованы для количественной оценки лекарственных форм, содержащих определяемые вещества (табл. 3). Все полученные экспериментальные данные статистически обработаны, относительная ошибка определения не превышает 2%. Таблица 3. Результаты количественного анализа содержания рифабутина, перхлозона и теризидона в лекарственных формах. ГЛФ Содержание, г Серия Х, г Метрологические характеристики (n=10, P=95%, tтабл=2,26) Фарбутин, капсулы 150 135-165 191118 0,1503 S2=6,23×10-6; S=0,0025; Sх=0,0019; Δx=0,0018; E,%=1,18; Sr=0,0166 180621 0,1501 S2=5,43×10-6; S=0,0023; Sх=0,0017; Δx=0,0017; E,%=1,10; Sr=0,0155 100321 0,1507 S2=4,01×10-6; S=0,002; Sх=0,0022; Δx=0,0013; E,%=0,95; Sr=0,0150 Перхлозон, таблетки покрытые оболочкой 200 190-210 41220 0,2009 S2=1,12×10-5; S=0,0033; Sх=0,0025; Δx=0,0024; E,%=1,19; Sr=0,0167 41020 0,1999 S2=8,54×10-5; S=0,0029; Sх=0,0023; Δx=0,0021; E,%=1,04; Sr=0,0146 400 380-420 31220 0,4036 S2=3,73×10-5; S=0,0061; Sх=0,0048; Δx=0,0044; E,%=1,08; Sr=0,0151 60918 0,4033 S2=4,05×10-5; S=0,0064; Sх=0,0051; Δx=0,0045; E,%=1,13;Sr=0,0158 Локсидон, капсулы 150 135-165 10422 0,1499 S2=4,54×10-6; S=0,0021; Sх=0,0015; Δx=0,0015; E,%=1,02; Sr=0,014 10022 0,1504 S2=3,82×10-6; S=0,0019; Sх=0,0015 Δx=0,00139; E,%=0,92; Sr=0,0129 250 225-275 30422 0,2501 S2=1,33×10-5; S=0,0037; Sх=0,0024; Δx=0,0026; E,%=1,04; Sr=0,0146 29522 0,2502 S2=1,55×10-5; S=0,0039; Sх=0,0026; Δx=0,0028; E,%=1,12; Sr=0,0157 300 270-330 260219 0,3024 S2=3,25×10-5; S=0,0057; Sх=0,0044; Δx=0,0041; E,%=1,34; Sr=0,0189 240519 0,3026 S2=2,74× 105; S=0,0052; Sх=0,0042; Δx=0,0037; E,%=1,23; Sr=0,0173 Примечание: n - объем выборки, tтабл - табличное значение критерия Стьюдента, при доверительной вероятности 95%, X̄- среднее значение результата, S2 - дисперсия, S - стандартное отклонение, Sx - стандартное отклонение среднего результата, ΔX - полуширина доверительного интервала величины, E,% - относительная ошибка среднего результата, Sr - относительное стандартное отклонение Работоспособность разработанных методик подтверждена в процессе валидации. Полученные данные не превышают допустимых значений и характеризуют такие валидационные параметры, как специфичность, линейность, правильность, прецизионность (табл. 4) [14]. Таким образом, анализ приведенных данных свидетельствует, что разработанные методики характеризуются селективностью и экспрессивностью, позволяют идентифицировать и количественно оценить содержание действующего вещества в лекарственных формах, содержащих рифабутин, перхлозон и теризидон. Внедрение описанных методик в практику позволит снизить стоимость и трудоемкость анализа. Таблица 4. Параметры валидационной оценки методик количественного определения перхлозона, рифабутина и теризидона Критерии валидности Допустимые значения Полученные результаты Перхлозон Рифабутин Теризидон Специфичность - Специфична Специфична Специфична Прецизионность: Сходимость Воспроизводимость RSD≤2,0% RSD≤2,0% 1,51 1,94 1,32 1,89 1,72 1,97 Правильность tвыч function displayCitations(citationsIndex) { var citationsIndexString = citationsIndex.toString(); if (citationsIndexString.search(/[–\-\—\–]/g) != -1) { var citationsArray = citationsIndexString.split(/[–\-\—\–]/); var citationContent = ""; for (var i = parseInt(citationsArray[0]); i < parseInt(citationsArray[1])+1; i++) { citationContent = citationContent + "

" + i + ".

" + citationData[i] + "

"; } $('#modalCitationsDataContent').html(citationContent); } else { $('#modalCitationsDataContent').html("

" + citationsIndex + ".

" + citationData[citationsIndex] + "

"); } $('#modalCitations').css('display', 'flex'); $('#modalCitations').show(); } function closeModal() { var modal = document.getElementById("modalCitations"); modal.style.display = "none"; }

×

Об авторах

Светлана Сергеевна Коновалова

Иркутский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
аспирант кафедры фармацевтической и токсикологической химии ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 664003, Иркутск, ул. Красного Восстания, 1

Елена Анатольевна Илларионова

Иркутский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
доктор химических наук, профессор, заведующая кафедрой фармацевтической и токсикологической химии ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 664003, Иркутск, ул. Красного Восстания, 1

Список литературы

Дополнительные файлы