ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МЕТОД ОЦЕНКИ РЕАКЦИИ САМОСТИМУЛЯЦИИ ЛАТЕРАЛЬНОГО ГИПОТАЛАМУСА, ОТРАЖАЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬ ПОДКРЕПЛЯЮЩИХ СИСТЕМ ГОЛОВНОГО МОЗГА

Полный текст

Введение Реакция самораздражения мозга традиционно рассматривается как одна их основных при изучении механизмов центральных подкрепляющих систем. Самостимуляция (СС) воспроизводится из многих структур лимбической системы мозга, ответственной за эмоционально-мотивационную деятельность организма. Чаще других ее воспроизводят с латеральных ядер гипоталамуса, в этом случае СС характеризуется стабильностью и достаточно высоким уровнем нажатий на педаль в камере Скиннера. Напомним, что подкрепляющие системы в головном мозге представлены рядом мозговых структур, иннервируемых медиальным передним мозговым пучком, по своей природе дофаминергическим. Первоначально описанный еще в середине 1970-х гг. как маленькие топографические точки А9 и А10 в области вентральной области покрышки среднего мозга [7], в настоящее время он воспринимается иначе, прежде всего, как своеобразный «подкрепляющий нерв головного мозга», поскольку от дофаминергических нейронов вентральной области покрышки аксоны медиального переднего пучка идут к разным лимбическим структурам, включая прилежащее ядро, миндалину, ядра ложа конечной полоски, гипоталамус и префронтальную кору, которые в настоящее время объединены в группу ядер, описанных как структуры расширенной миндалины, или параамигдалярный комплекс. По оценкам морфологических исследований, медиальный передний мозговой пучок содержит аксоны около 50 тысяч нейронов, которые по мере иннервации эмоциогенных мозговых структур постепенно редеют и уменьшаются числом [2]. Реакция СС головного мозга выбрана для оценки безусловного подкрепления, так так мозговая ткань специфически реагирует на электрический ток, в конечном случае формируя двигательный акт (в классической камере Скиннера это нажатие на педаль). Количественными характеристиками реакции СС для оценки физиологического или фармакологического эффекта рассматривают число нажатий на педаль (абсолютное и относительное) и его прирост после введения психоактивирующих средств, а также показатели чувствительности ткани головного мозга к раздражающему действию тока, определяемыми по пороговым значениям тока, вызывающим нужную (ожидаемую) двигательную реакцию (как правило, нажатие на педаль). Важно специально оговорить, что пороги тока, вызывающие СС (измеряются в микроамперах), значительно варьируют от одного животного к другому, что связано с небольшими отклонениями в локализации кончиков электродов в гипоталамусе и постепенном формировании соединительнотканной сумки в области электрода после длительного использования животного с вживленными в мозг электродами (более одного-полутора месяцев). С целью преодоления этих технических проблем в Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии АН СССР Г.А. Григорьяном [1] было предложено рассчитывать специальный коэффициент, который позволил учитывать поведенческие характеристики крыс в педальной камере Скиннера и получил название «коэффициент рассогласования» (mismatch). Его было предложено рассчитывать по специальной формуле на основании разницы между временем нажатия педали после окончания стимуляции в случае длительных нажатий, по длительности больших, чем 0,4 сек (Т1) и временем от момента отжатия педали до окончания стимуляции (Т2) отнесенной к сумме этих величин. Было найдено, что «коэффициент рассогласования» принимает значения от -1 до +1 и показывает долю активации положительной и отрицательной подкрепляющей фазы CC [5]. Если данный коэффициент принимает положительные значения, то это означает, что крыса продолжала нажимать на педаль даже после того, как раздражение мозга прекратилось. При отрицательных значениях «коэффициента рассогласования» крыса заканчивала нажимать на педаль раньше, чем прекратилась стимуляция мозга. Необходимость введения «коэффициента рассогласования» было обусловлено теоретическими представлениями, что реакцию СС можно рассматривать как одновременное включение положительного и отрицательного механизмов подкрепления. Сдвиг в сторону увеличения и снижения коэффициента позволяет говорить как об изменении частоты СС, так и об изменениях подкрепляющих свойств мозга. Поэтому, как дополнительный критерий изменения подкрепляющих свойств СС, «коэффициент рассогласования» является удобным показателем для оценки действия фармакологических препаратов, что показано во многих исследованиях нашей лаборатории [8, 9]. Указанные представления привели к тому, что расчет «коэффициента рассогласования» был заложен в программу обработки данных по СС и рассчитывался автоматически, то есть весь спектр поведенческих изменений крыс при СС был автоматизирован и объективизирован. Однако обоих показателей изучения СС (изменения числа нажатий и «коэффициента рассогласования»), как показала практика, часто недостаточно, поскольку они могут меняться разнонаправленно (то есть ожидаемо как активация/депрессия подкрепляющих систем мозга) или однонаправлено, тогда сложно сделать однозначный вывод и один из показателей выделяется при замалчивании (необсуждении) другого. Более того, на основании этих двух показателей не всегда можно сравнивать реальные аддиктивные потенциалы психоактивных веществ, например, психостимуляторов и опиатов: показатели, полученные при введении психостимуляторов (амфетамин, фенциклидин) всегда выше, чем аналогичные индексы после введения морфина, фентанила, диацетилморфина и других наркотических анальгетиков [10]. Безусловно и ранее предпринимались попытки введения дополнительных показателей для оценки реакции СС. Так, основным направлением рассуждений было выделить или рассчитать показатель аддиктивности, на основании которого можно было бы оценить наркогенный потенциал вещества, процедуру, крайне важную при доклиническом исследовании психотропных веществ. Посылкой было использовать лишь дозы психоактивных веществ, вызывающих приблизительно равный эффект [3], однако такой подход также не всегда оказался возможном при сравнении, например, диацетилморфина (героина) и этанола по эквипотенциальным дозам, вызывающим активацию подкрепляющих систем и потенциальную зависимость. В первом случае она будет достаточно низкой (5-10-20 мг/кг), во втором более 4 г/кг, что соответствует «глубокому» опьянению. То есть такой показатель не всегда объективен, поскольку расчетные эквивалентные дозы сравниваемых с эталоном (что выбрать в качестве эталона?) веществ могут быть весьма высокими и вызывать больше нежелательных эффектов, чем реального влияния на подкрепляющие системы мозга. Целью исследования была разработка дополнительного объективного количественного способа оценки показателя аддиктивности на основе анализа влияния фенамина, морфина и этанола на СС латерального гипоталамуса у крыс. Методика Опыты выполнены на 78 крысах самцах Вистар массой 200-220 г, содержавшихся в группе по 5 особей в стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария ФГБНУ «ИЭМ» и инвертированного света 08.00-20.00. Температура воздуха поддерживалась в пределах 20-22°C, относительная влажность - 50-70%. Для животных обеспечивали свободный доступ к воде и пище. Все опыты проводили в осенне-зимний период. Использовали классический вариант изучения самораздражения мозга в виде педальной СС в камере Скиннера. С этой целью под нембуталовым наркозом (50 мг/кг) в мозг крысам вживляли электроды с использованием стереотаксического прибора фирмы «Medicor», Венгрия. Использовали нихромовые монополярные электроды в стеклянной изоляции (диаметр электрода 0,25 мм, длина оголенного кончика 0,25-0,30 мм, его толщина 0,12 мм), которые имплантировали билатерально в латеральное гипоталамическое ядро по следующим координатам: АР=2,5 мм назад от брегмы, SD=2,0 мм латерально от сагиттального шва, Н=8,4 мм от поверхности черепа [12]. Индифферентный электрод из нихромовой проволоки закрепляли на черепе животного. Все электроды выводили и коммутировали на микроразъеме, который фиксировали на черепе самотвердеющей пластмассой. Через 10 дней после вживления электродов в мозг крыс обучали нажимать на педаль в камере Скиннера для получения электрического раздражения мозга (прямоугольные импульсы отрицательной полярности, длительностью 1 мс, с частотой 100 Гц, в течение 0,4 с, пороговые значения тока в режиме «фиксированных пачек»). Для повторного раздражения животное было вынуждено вновь нажимать на педаль. Частоту и длительность нажатий регистрировали автоматически. На основании этих результатов вычисляли «коэффициент рассогласования» [4, 5, 11], который принимает значения от -1 до +1 и показывает долю активации положительной и отрицательной подкрепляющей фазы СС. Фармакологические препараты начинали вводить на 3-й день эксперимента после стабилизации реакции при использовании фиксированного значения силы тока. Регистрировали число нажатий на педаль и коэффициент «рассогласования» в течение 10 мин. эксперимента, затем производили внутрибрюшинную инъекцию препарата, и через 30 мин. регистрировали те же показатели за 10-минутный интервал времени. Дополнительно ввели расчетный «коэффициент аддиктивности» как отношение прироста числа нажатий на педаль к «коэффициенту рассогласования». По окончании всех опытов производили морфологический контроль локализации кончиков электродов на серии фронтальных срезов мозга, которые окрашивали по методу Ниссля, предварительно производили коагуляцию через вживленные электроды током силой 1 мА в течение 30 с. Все животные были разделены на несколько групп, которые внутрибрюшинно в 4-х дозах получали: 1) физиологический раствор (контроль; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 мл/крысу), 2) психомоторный стимулятор фенамина (амфетамина) гидрохлорид (0,5; 1; 2; 4 мг/кг); 3) наркотический анальгетик морфина гидрохлорид (1; 2; 4; 8 мг/кг), 4) этанол (0,5; 1; 2; 4 г/кг). Для статистической обработки полученных количественных данных применяли программное обеспечение Graph Pad Prizm v.6. Все данные были представлены как среднее±стандартное отклонение. Статистическую значимость различий между группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA. Для сравнения только между двумя группами применялся t-критерий Стьюдента для независимых выборок. Результаты исследования Анализ действия разных доз фенамина на СС латерального гипоталамуса показал (табл.), что регистрируется дозозависимый прирост числа нажатий на педаль от +33% после введения 0,5 мг/кг до +66% после введения 4 мг/кг. Параллельно снижался «коэффициент рассогласования» с 0,60 до 0,34. Оба данных показателя указывают, что фенамин активирует подкрепляющие системы мозга. Но наиболее показательными были значения «коэффициента аддиктивности», которые градуально возрастали с 2,22±0,03 (0,5 мг/кг) до 4,88±0,09 (4 мг/кг) в сравнении с контролем (1,15±0,02), демонстрируя, что с повышением дозы психостимулятора подкрепляющие системы мозга вовлекаются все больше и больше. Несколько иную картину наблюдали при изучении действия морфина на СС латерального гипоталамуса. Число нажатий на педаль при введении препарата в дозе 1-2 мг/кг статистически не отличалась от контрольных значений, возрастая только при введении в дозах 4 мг/кг (+27%) и 8 мг/кг (+31%). Однако уже после введения морфина в дозе 2 мг/кг достоверно снижался «коэффициент рассогласования» с 0,22±0,02 до 0,13±0,04 (р<0,01). Но более отчетливо вовлечение подкрепляющих систем мозга видно при расчете «коэффициента аддиктивности», который умеренно (но достоверно) возрастал, начиная с дозы 1 мг/кг, подчеркивая, что уже и начальная доза активирует подкрепляющие системы мозга. Еще более сложно оценить действие этанола на подкрепляющие системы мозга. Среди исследованных доз этанола (от 0,5 до 4 г/кг) только одна (2 г/кг/кг) вызывала небольшой прирост (+22%) нажатий на педаль, хотя «коэффициент рассогласования» достоверно уменьшался уже после введения 0,5 и 1 г/кг. Однако предлагаемый нами «коэффициент аддиктивности» достоверно возрастал при использовании всех исследуемых доз этанола от 0,5 г/кг до 4 г/кг, указывая на вовлечение подкрепляющих систем мозга. Таблица. Влияние фенамина, морфина и этанола в разных дозах на СС латерального гипоталамуса у крыс (M±m) Вещества, доза Число нажатий на педаль за 10 мин. (доля) Коэффициент рассогласования, отн. ед. Коэффициент аддиктивности, отн. ед. До После До После Контроль (0,9%-ный раствор NaCl) 147±16 161±12 (1,10±0,08) 0,21±0,02 0,20±0,01 (0,95) 1,15±0,01 Фенамин 0,5 мг/кг 245±33 325±23*# (1,33±0,09) 0,15±0,03 0,09±0,02*# (0,60) 2,22±0,03* 1 мг/кг 234±17 322±29*# (1,38±0,12) 0,25±0,05 0,11±0,02*# (0,44) 3,14±0,05*** 2 мг/кг 214±16 307±23*# (1,43±0,11) 0,21±0,04 0,12±0,03# (0,57) 2,51±0,05** 4 мг/кг 203±31 337±26*# (1,66±0,13) 0,32±0,10 0,11±0,03*# (0,34) 4,88±0,09*** Контроль (0,9%-ный раствор NaCl) 152±12 144±23 (0,94±0,15) 0,34±0,03 0,26±0,05 (0,76) 1,24±0,07 Морфин 1 мг/кг 210±19 242±18 (1,15±0,09) 0,28±0,03 0,23±0,06 (0,82) 1,40±0,07* 2 мг/кг 214±21 247±15 (1,18±0,11) 0,22±0,02 0,13±0,04*# (0,59) 2,00±0,07** 4 мг/кг 202±31 257±13*# (1,27±0,06) 0,20±0,03 0,18±0,05 (0,90) 1,41±0,06* 8 мг/кг 177±19 232±25*# (1,31±0,14) 0,20±0,05 0,16±0,03 (0,8) 1,64±0,04* Контроль (0,9%-ный раствор NaCl) 161±11 145±24 (0,89±0,15) 0,14±0,03 0,18±0,06 (1,29) 0,69±0,05 Этанол 0,5 г/кг 155±21 167±17 (1,07±0,11) 0,33±0,11 0,21±0,07# (0,64) 1,67±0,11** 1 г/кг 134±13 148±20 (1,10±0,15) 0,21±0,02 0,14±0,05*# (0,67) 1,64±0,07* 2 г/кг 156±14 192±16*# (1,22±0,10) 0,25±0,05 0,21±0,12 (0,84) 1,45±0,14* 4 г/кг 147±16 162±12 (1,10±0,08) 0,21±0,02 0,20±0,01 (0,95) 1,16±0,03* Примечание: *р<0,05 **р<0,01; ***р<0,001 в сравнении с группой контроля; #р<0,05 в сравнении с показателями до введения наркогенов Таким образом, предложенный нами «коэффициент аддиктивности» во всех группах животных и всех исследованных дозах оказался достаточно информативным количественным показателем, демонстрирующим вовлечение подкрепляющих систем мозга в действие психоактивных веществ. Обсуждение результатов исследования Полученные данные показывают, что реакция СС латерального гипоталамуса является надежным методом изучения подкрепляющих систем головного мозга и в определенной степени отражает психический компонент зависимости. На последнее указывает возрастание «коэффициента аддиктивности» при увеличении доз исследованных психоактивных веществ. Ранее и нами, и другими специалистами влияние психотропных средств на СС латерального гипоталамуса рассматривали исключительно как их первично-подкрепляющие свойства, имея в виду биологические свойства мозговой ткани специфически реагировать на электрическое раздражение снижением порога раздражения и двигательной реакцией [5, 11]. Однако градуальный возрастающий характер ответа на повышение дозы наркогена, особенно при введении психостимуляторов типа фенамина, позволяет рассматривать и саму СС, и особенно «коэффициент аддиктивности» как некий эквивалент психической зависимости, то есть «желание повторно употреблять вещество для достижения специфической эйфории» [6]. В исследование были включены три психоактивных вещества с разным аддиктивным потенциалом - этанол (0,5-4 г/кг), морфин (1-8 мг/кг) и фенамин (0,5-4 мг/кг). Начальные дозы были подобраны как пороговые для влияния на СС латерального гипоталамуса. Однако, прежде всего, следует рассмотреть данные, полученные при введении 0,9%-ного раствора хлорида натрия (физиологического раствора) на СС. В трех группах повторное введение физиологического раствора приводило к незначительным изменениях в виде возрастания СС или ее снижения (табл.). В любом случае степень отклонения от исходного состояния при повторной СС не превышала 11%. Это позволило рассчитать прежде всего «коэффициент рассогласования», который не менялся, снижался или возрастал (см. табл.). Стало быть, ориентироваться только на «коэффициент рассогласования» при оценке действия психотропных веществ не следует, но следует учитывать его исходное значение, которое в значительной мере и определяет расчет «коэффициента аддиктивности»: в наших опытах он составил 1,15±0,02, 1,24±0,07 и 0,69±0,05 (см. табл.), то есть колебался в пределах от 0,69 до 1,24. Если условно верхний уровень «коэффициента аддиктивности» принять за величину, меньшую 1,25 или близкую к ней, то возрастание «коэффициента аддиктивности» под влиянием действия психотропного препарата можно трактовать как некий количественный эквивалент психической зависимости. Следует сразу оговориться, что «коэффициент аддиктивности» нужно сравнивать с таковым при введении физиологического раствора (контроля), поскольку исходные значения «коэффициент рассогласования» существенно колеблются (в наших опытах от 0,69 до 1,24). В любом случае, как показали наши исследования, «коэффициент аддиктивности» стал самым показательным и, главное, однонаправленным, из всех трех поведенческих индексов (прирост нажатий на педаль, «коэффициент рассогласования» и «коэффициент аддиктивности»). Еще одной особенностью «коэффициента аддиктивности» является не только его прогрессивное возрастание при увеличении дозы психоактивного вещества, как, например, мы наблюдали почти прямо пропорциональную дозную зависимость в случае психостимулятора фенамина (см. табл.), а увеличение в сравнении с контрольными значениями. То есть, конечный результат расчетного «коэффициента аддиктивности» зависит от исходных контрольных значений, которые могут снижаться, не меняться или возрастать при повторной СС на введение физиологического раствора (активный контроль). В случае контроля для этанола данные получены при очень низких уровнях исходной СС (-11% от исходного) и повышенного в контроле «коэффициента рассогласования» с 0,14±0,03 при первом тестировании до 0,18±0,06 во втором, что дало соотношение «коэффициента рассогласования» 1,29, единственное положительное значение из всех полученных данных по этому показателю. Отсюда «коэффициент аддиктивности» в группе активного контроля составил 0,69, то есть глубокую отрицательную величину. Тогда на этом фоне, если разобрать подкрепляющие эффекты этанола (0,5-1-2-4 г/кг), то «коэффициент аддиктивности» возрастал приблизительно в 2,4 раза при использовании доз 0,5 и 1 г/кг, и в значительно в меньшей степени при применении доз 2 и 4 г/кг, хотя все значения «коэффициента аддиктивности» достоверно были выше контрольных (см. табл.). И это очень важно, поскольку дозы этанола 2 и 4 г/кг соответствуют состоянию «выраженного» и «глубокого» опьянения, когда нарушаются в том числе и двигательные навыки животного. И ожидать от этих доз увеличения «коэффициента аддиктивности» не приходится. Аналогичную картину наблюдали и в случае оценки подкрепляющих свойств морфина. Максимальную степень возрастания «коэффициента аддиктивности» при использовании морфина 2 мг/кг можно оценить как +61%, в дозе 8 мг/кг - как +32%, а в случае 1 и 4 мг/кг - только +13-14%. Это тоже следует оценивать исходя из контрольных значений «коэффициента аддиктивности», который в данной группе составил 1,24±0,07, то есть почти вдвое выше, чем в группе контроля к этанолу. Поэтому из полученных данных нельзя сделать вывод, что аддиктивный потенциал морфина 1-2-4-8 мг/кг меньше, чем таковой этанола (0,5-1-2-4 г/кг), где «коэффициенты аддиктивности» составляли +68-142% от контрольных значений. В данном случае «коэффициент аддиктивности» можно использовать как дополнительный показатель, наряду с другими поведенческими характеристиками. Таким образом, в случае с «коэффициентом аддиктивности» его следует рассматривать как надежный, простой и удобный дополнительный количественный метод оценки аддиктивного потенциала психоактивных соединений. Больше всего он подходит для оценки аддиктивного потенциала психостимулирующих средств, но не только. Сам коэффициент целесообразно сравнивать внутри группы аналогичных психоактивных соединений, нежели между разными группами, например между морфином, фентанилом, тримепиридином, но не между морфином и амфетамином, фентанилом и кокаином, тримепиридином и фенциклидином. Такой подход поможет и исследователю, и практическому врачу правильнее оценить наркогенность разных психоактивных средств. Заключение Представленные данные свидетельствуют о целесообразности расчета «коэффициента аддиктивности» психоактивного вещества как соотношение доли изменения нажатий на педаль к величине «коэффициента рассогласования» при использовании метода СС латерального гипоталамуса. Для многих психоактивных групп веществ, например, психостимуляторов, этот показатель демонстрирует свою наглядность и прямо пропорциональную зависимость от дозы, вероятно, потому, что он является неким эквивалентом психической зависимости. Но такую закономерность можно наблюдать не всегда. В группах, где СС воспроизводится не на высоком уровне (анальгетики опийной группы, снотворные из группы производных барбитуровой и изобарбитуровой кислоты, транквилизаторы группы бензодиазепинов), «коэффициент аддиктивности» не так показателен, поскольку для этих наркогенов в большей степени характерна физическая зависимость, хотя может отражать реальный наркогенный потенциал. Поэтому при использовании метода СС латерального гипоталамуса «коэффициент аддиктивности» целесообразно использовать для сравнения внутри группы аналогичных психоактивных соединений, например, среди опиатов, барбитуратов, бензодиазепинов, психостимуляторов, нежели между разными группами соединений.

Об авторах

Петр Дмитриевич Шабанов

Институт экспериментальной медицины; Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: email@example.com
доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» Минобрнауки России, профессор кафедры фармакологии ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ. Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12; Россия, 194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, 6

Ян Борисович Лихтман

Институт экспериментальной медицины

Email: email@example.com
аспирант отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» Минобрнауки России Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Андрей Андреевич Лебедев

Институт экспериментальной медицины

Email: email@example.com
доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией общей фармакологии отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» Минобрнауки России Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Список литературы

Дополнительные файлы