РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРОТИНОИДОВ И ХЛОРОФИЛЛОВ В ЛИСТЬЯХ АРОНИИ МИЧУРИНА

Полный текст

Введение Биологически активные вещества (БАВ) фенольной природы - флавоноиды, дубильные вещества и лейкоантоцианы, как известно, являются основными целевыми группами, определяющими фармакологические свойства листьев аронии Мичурина [1, 5-9, 12-13, 17]. Изучению химического состава данного нефармакопейного вида растительного сырья известного фармакопейного растения посвящено в последнее время достаточно много научных работ [4, 11]. Данный интерес обусловлен развитием ресурсосберегающих подходов и технологий к использованию ограниченных природных ресурсов. Листья у растения являются побочным продуктом при заготовке плодов в промышленных масштабах. Кроме полифенольной фракции листья, участвуя в процессе фотосинтеза, как известно, в составе липофильной фракции БАВ содержат пигменты (каротиноиды и хлорофиллы), однако в литературе эти данные практически не представлены. При этом, следует учитывать, что активно изучаемые на предмет выявления различных видов фармакологической активности спирто-водные извлечения из листьев характеризуются многокомпонентным составом БАВ (в т.ч. присутствуют каротиноиды и хлорофиллы), а следовательно, и комплексным характером действия. Поэтому всестороннее изучение химического состава БАВ листьев аронии Мичурина является актуальной задачей. Целью исследования являлась разработка и валидация методики определения пигментов (каротиноидов и хлорофиллов) в листьях аронии Мичурина. Методика Объектом исследования служили высушенные аронии Мичурина листья сорта «Мулатка», заготовленные от культивируемого растения в Тамбовской области в 2023 году. Сушку проводили воздушно-теневым методом до остаточной влажности, не превышающей 10%. Определение содержания пигментов в листьях проводили на разных стадиях развития растения: образец 1 - на стадии цветения, май; образец 2 - на стадии начала плодоношения, июнь; образец 3 - на стадии зрелости плодов, август; образец 4 - на стадии начала покраснения листьев, сентябрь. Разработку методики определения пигментов (каротиноидов и хлорофиллов) в листьях аронии Мичурина осуществляли методом прямой спектрофотометрии в видимой области спектра на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ «Спектр», Россия). Валидацию разработанной методики проводили в соответствии с ОФС.1.1.0012 «Валидация аналитических методик» по показателям специфичности, правильности, линейности, сходимости, межлабораторной прецизионности [3]. Статистическая обработка результатов проведена в Microsoft Excel 2016. Результаты исследования и их обсуждение При изучении спектральных характеристик спирто-водных извлечений из листьев в диапазоне волн 400-800 нм (рис. 1) наблюдали основные максимумы поглощения в диапазоне волн 414±3 нм, 439±2 нм и 467±2 нм, характерные, согласно литературным данным [14], для неоксантина, а также при 667±2 нм, свойственный хлорофиллам. Рис. 1. Спектр поглощения спиртового извлечения листьев аронии Мичурина На этапе выбора экстрагента проведен анализ содержания каротиноидов и хлорофиллов при извлечении спиртом этиловым 70% и 96%, а также гексаном, согласно рекомендациям литературы [1, 10, 15-16]. Максимальный выход каротиноидов и хлорофиллов наблюдался при экстрагировании спиртом этиловым 70% (табл. 1) при использовании сырья со степенью измельчения от 0,5 до 1 мм (табл. 2). Таблица 1. Влияние экстрагента на выход каротиноидов и хлорофиллов из листьев аронии Мичурина Экстрагент Длина волны максимума, нм Выход каротиноидов, % Выход хлорофиллов, % Спирт этиловый 70% 439±2 667±3 0,056±0,005 0,073±0,003 Спирт этиловый 96% 439±2 667±3 0,026±0,005 0,046±0,004 Гексан 439±2 670±3 0,014±0,007 0,019±0,010 При увеличении количества частей экстрагента на 1 часть сырья при получении извлечения выход каротиноидов и хлорофиллов из листьев аронии Мичурина увеличивался. Оптимальным выбрано соотношение сырье-экстрагент 1:200, так как в сравнении с соотношением 1:150 выход пигментов в извлечение увеличивался незначительно, выходя на плато. Дальнейшее увеличение степени разведения экономически нерационально, так как потребовало значительного расхода экстрагента (табл. 3). Таблица 2. Влияние степени измельчения на выход каротиноидов и хлорофиллов из листьев аронии Мичурина Степень измельчения, мм Выход каротиноидов, % Выход хлорофиллов, % 2,0-3,0 0,046±0,005 0,060±0,011 1,0-2,0 0,056±0,005 0,073±0,003 0,5-1,0 0,062±0,003 0,087±0,004 0,2-0,5 0,056±0,014 0,069±0,022 Таблица 3. Влияние соотношения сырье-экстрагент на выход каротиноидов и хлорофиллов из листьев аронии Мичурина Соотношение сырье-экстрагент Выход каротиноидов, % Выход хлорофиллов, % 1:25 0,051±0,003 0,097±0,013 1:50 0,062±0,003 0,087±0,004 1:100 0,065±0,009 0,096±0,021 1:150 0,074±0,003 0,111±0,004 1:200 0,078±0,001 0,115±0,004 Оптимальным временем получения извлечения выбраны 45 минут. При увеличении времени экстракции до 60 мин выход исследуемых БАВ снижался. Дальнейшее увеличение времени экстракции приводило к постепенному снижению выхода каротиноидов, а выход хлорофиллов выходил на плато (рис. 2). Рис. 2. График зависимости содержания каротиноидов и хлорофиллов в зависимости от времени извлечения Выход каротиноидов и хлорофиллов максимален при использовании кратности экстракции равной 2 (табл. 4). На основании результатов исследования разработана методика количественного определения каротиноидов и хлорофиллов в листьях аронии Мичурина. Около 1,0 г (точная навеска) высушенных измельченных листьев аронии Мичурина, измельченных до размеров частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм, помещают в коническую колбу, вместимостью 250 мл, заливают 100 мл спирта этилового 70%, взвешивают и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником 45 минут. По истечении времени колбу с извлечением быстро охлаждают, доводят по массе до первоначального значения и фильтруют через 10 слоев марли в колбу на 200 мл. Экстракцию повторяют второй порцией растворителя. Фильтраты объединяют в колбе на 200 мл и доводят объем до метки (раствор А). 15 мл раствора А помещают в колбу на 25 мл, доводят объем до метки 70% этиловым спиртом (раствор Б). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при 439±2 нм для каротиноидов и 667±3 нм для хлорофиллов. Раствор сравнения - спирт этиловый 70%. Таблица 4. Влияние кратности экстракции на выход каротиноидов и хлорофиллов из листьев аронии Мичурина Кратность Выход каротиноидов, % Выход хлорофиллов, % 1 0,075±0,012 0,115±0,016 2 0,095±0,005 0,146±0,016 3 0,073±0,004 0,115±0,010 Расчет содержания каротиноидов (в пересчете на неоксантин) и хлорофиллов (в пересчете на хлорофилл а) в % в абсолютно сухом сырье проводили по формулам: , где A - оптическая плотность раствора Б при 439±2 нм для каротиноидов и при 667±3 нм для хлорофиллов; Vк1 и Vк2 - объемы мерных колб, использованных для разведения, мл; m - масса сырья, г; E1см1% - удельный показатель поглощения (2243 для каротиноидов в пересчете на неоксантин и 944,5 для хлорофиллов в пересчете на хлорофилл α); - объем аликвоты, взятой на анализ, мл; - потеря в массе при высушивании, %. Проведена метрологическая оценка разработанной методики. Относительная ошибка определения составила 3,03% для каротиноидов и 1,81% для хлорофиллов, что свидетельствует о нахождении в пределах средней ошибки 5% (табл. 5). Таблица 5. Метрологическая характеристика методики количественного определения каротиноидов (1) и хлорофиллов (2) в листьях аронии Мичурина (Р=95%, n=6) БАВ хср S2 S Sхср Sхср, % ∆х ∆хср ε,% 1 0,075 0,00000474 0,00217 0,00089 2,89 0,0056 0,0023 3,032 2 0,119 0,00000426 0,00206 0,00084 1,73 0,0053 0,0021 1,813 Специфичность методики оценивали по совпадению положений максимумов на спектрах индивидуальных извлечений каротиноидов и хлорофиллов согласно литературным данным и исследуемого извлечения [13]. Линейность методики определяли на 9 уровнях концентрации. Методика линейна, так как R2 больше 0,99. Предел обнаружения 0,125 г/мл для каротиноидов и 0,072 г/мл для хлорофиллов (рис. 3). Прецизионность на этапе сходимости методики оценивали путем проведения шести измерений в одной лаборатории, одним исследователем, по одной методике на одном и том же оборудовании в течение короткого промежутка времени (табл. 6). Рис. 3. График линейной зависимости оптической плотности от содержания каротиноидов и хлорофиллов в извлечении из листьев аронии Мичурина С использованием разработанной и валидированной методики проводили оценку содержания каротиноидов и хлорофиллов в сырье разных фаз заготовки. Наибольшее содержание характерно для сырья, заготовленного на стадии начала плодоношения. К стадии начала покраснения листьев их содержание значительно снижается, что обусловлено разрушением хлоропластов и снижением процессов фотосинтеза (табл. 7). Таблица 6. Валидационные характеристики методики определения суммы каротиноидов и хлорофиллов в аронии Мичурина листьях Характери-стика Статистическая характеристика Результат Сходимость Проба Содержание суммы каротиноидов, % Содержание суммы хлорофиллов, % 1 0,075 0,119 2 0,075 0,120 3 0,073 0,119 4 0,077 0,122 5 0,073 0,116 6 0,078 0,120 Доверительный интервал (Р=95%), % 0,075±0,0023 0,119±0,0022 Относительное стандартное отклонение (RSD), % 2,89 1,73 Cтандартное отклонение (SD), % 0, 217 0, 206 Линейность Уравнение прямой y=0,1018×-0,0001 y=0,0429×-0,0003 Угловой коэффициент (a) 0,1018 0,0429 Свободный член b -0,0001 -0,0003 Коэффициент корреляции 1 1 Область линейности (по содержанию каротиноидов и хлорофиллов в извлечении), г/мл 1,25-8,03∙10-6 2,17-13,30∙10-6 Предел обнаружения, г/мл 0,125 0,072 Таблица 7. Содержание каротиноидов и хлорофиллов в листьях аронии Мичурина на различных этапах заготовки Фаза заготовки Выход каротиноидов, % Выход хлорофиллов, % Начало цветения (май) 0,072±0,002 0,131±0,003 Начало плодоношения (июнь) 0,093±0,002 0,162±0,005 Массовая зрелость плодов (август) 0,075±0,002 0,119±0,002 Начало покраснения листьев (сентябрь) 0,063±0,002 0,098±0,003 Заключение Разработана и валидирована методика количественного определения суммы каротиноидов (в пересчёте на неоксантин) и хлорофиллов методом спектрофотометрии в листьях аронии Мичурина. Разработанная методика валидна и пригодна для спектрофотометрического определения каротиноидов и хлорофиллов в листьях аронии Мичурина. Наибольшее содержание определяемых соединений наблюдается в листьях на стадии начала плодоношения (период заготовки - июнь). Однако, даже на рекомендуемом сроке заготовки листьев - в период массовой зрелости плодов (август) и начала покраснения листьев (сентябрь) изучаемое сырье следует считать также перспективным источником каротиноидов (до 75 мг%), которые в сумме с полифенольным комплексом БАВ, также вносят свой вклад в антиоксидантное действие комплексных экстракционных препаратов.

Об авторах

Ольга Валериевна Пугачева

ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» Минобрнауки России

Email: email@example.com
преподаватель кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии Россия, 394018, Воронеж, Университетская пл., 1

Ольга Валерьевна Тринеева

ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» Минобрнауки России

Email: email@example.com
доктор фармацевтических наук, доцент, профессор кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии Россия, 394018, Воронеж, Университетская пл., 1

Список литературы

Дополнительные файлы