ДЕТАЛИЗАЦИЯ ФЛАВОНОИДНОГО СОСТАВА НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ GLYCYRRHIZA GLABRA L. С ПОМОЩЬЮ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

Полный текст

Введение Солодка голая (Glycyrrhiza glabra L.) - одно из популярных лекарственных растений семейства Бобовые (Fabaceae), подземные органы которого пользуются большим спросом в медицине и различных отраслях промышленности [7, 9, 10]. Несмотря на то, что в медицине используются только корни солодки, надземная часть лекарственного растения также представляет научный интерес. Ряд исследований свидетельствует о присутствии в зеленых частях различных групп биологически активных соединений (сапонинов, фенольных соединений, аминокислот и др.) [3, 4, 14]. При этом отмечено высокое содержание флавоноидов 3-5%, обуславливающих противомикробное, противовспалительное свойства травы солодки голой [6]. Среди метаболитов флавоноидной природы в надземных частях лекарственного растения обнаружены пиноцембрин, нарингенин, витексин, а также типичные для многих растений кемпферол, кверцетин, изорамнетин, рутин [5, 17]. Группой ученых впервые установлена структура изофлавона - глабризофлавона, выделенного из травы солодки голой [12]. Научный интерес также представляют обнаруженные в данном растительном объекте пренилфлавоноиды, которые совсем недавно выделены в самостоятельную подгруппу ввиду особенностей их строения и связанной с этим высокой биологической активностью [11]. Однако более подробные данные о структурно-групповом составе соединений флавоноидной природы, количестве отдельных флавоноидов в траве солодки голой на сегодняшний день отсутствуют. Поэтому становится актуальным его детальное изучение посредством точных и современных методов, одним из которых является хромато-масс-спектрометрия. Сочетание хроматографического разделения смеси веществ с их масс-спектрометрическим анализом позволяет с высокой достоверностью дать их количественную оценку [2]. Этот метод находит широкое применение в фармакогностическом анализе для изучения индивидуальных компонентов химического состава лекарственных растений [8]. Цель данного исследования - углубить и детализировать сведения о компонентном составе флавоноидов надземной части солодки голой методом хромато-масс-спектрометрии и определить количественное содержание идентифицированных в извлечениях из растительного сырья соединений данной группы биологически активных соединений. Методика Объектом исследования являлись этанольные вытяжки из надземной части солодки голой, заготовленной на территории Кумылженского (вблизи ст. Букановская), Иловлинского (окр. с.п. Ольховка), Среднеахтубинского районов (окр. с.п. Фрунзенское) Волгоградской области в период массового цветения дикорастущих популяций лекарственного растения. Цветущие облиственные верхушки длиной 25-35 см (без одревесневших частей побега) срезали и сушили воздушно-теневым способом. Для наиболее полного выделения флавоноидой фракции в качестве экстрагента использовали спирт этиловый 70% ввиду его наибольшего сродства. Измельченное до размера частиц 2 мм растительное сырье экстрагировали методом перколяции до его истощения. Полученный жидкий экстракт сгущали под вакуумом в испарителе ротационном UL-1100, затем досушивали в сушильном шкафу при температуре 50-55oC. Эксперименты выполнены с использованием оборудования ЦКП передовой масс-спектрометрии Сколковского института науки и технологий. Навеску образцов сухого экстракта (примерно по 15 мг) переносили в полипропиленовые пробирки на 2 мл и добавляли 100% метанол (HPLC-grade, J.T. Baker) из расчета 1 мл на 10 мг сухого вещества. Для анализа использовали систему ВЭЖХ с последовательно соединенным с масс-спектрометрическим детектором Q-Exactive HF-X (ThermoScientific) с электроспрейным источником ионизации. Хроматографический анализ проводили в следующих условиях: колонкаWatersAcquityUPLCBEHC18, 1,7 мкм, 2,1 x 100 мм с предколонкой Waters Acquity UPLCBEHC18 VanGuard 1,7 мкм 2,1 x 5 мм; подвижная фаза А - вода (очищена в системе Milli-QIntegral 3) с 0,1% муравьиной кислотой, подвижная фаза Б - 100% ацетонитрил (Fisher Scientific)с 0,1% муравьиной кислотой. Градиентный режим элюирования при скорости потока 0,4 мл/мин. Промывали колонку 5 мин при 5% фазы Б, линейно увеличивали концентрацию фазы Б до 70% с 5 до 45 мин, затем линейно увеличивали концентрацию фазы Б до 99% с 45 до 48 мин, после 6 минутной промывки при 99% буфера Б, концентрацию этого буфера линейно снижали до исходных 5% за 1 мин, промывали колонку 5 минуты при концентрации буфера Б 5%. Общая длительность анализа составляла 60 мин. Объем наносимой пробы 3 мкл. Температура колонки: 60 оС. Для масс-спектрометрического анализа были установлены следующие параметры настроек: напряжение на эмиттере 4,5 кВ, температура капилляра 320°C. Панорамное сканирование проводили в режиме измерения положительных ионов в диапазоне масс от 100 m/z до 1500 m/z, при разрешении 70,000. При тандемном сканировании разрешение устанавливали 17500 в диапазоне масс от 50 m/z до верхней границы, которая определяется автоматически исходя из массы прекурсора. Изоляцию прекурсорных ионов проводили в окне±1,2 m/z. Полученные спектры визуализированы в программе XcaliburQualBrowser (ThermoScientific).Идентификация метаболитов проводилась с помощью программного обеспечения MS-DIAL (CompMS, RIKEN) по базе данных MSMS_Public_ExpBioInsilico Pos VS17 1.msp (CompMS, RIKEN) с точностью m/z = 0,001 Da (MS) и m/z = 0,01 Da (MS2). Результаты исследования и их обсуждение В результате биоинформатической идентификации субстанций в MS-DIAL в спиртовых извлечениях (в сухих экстрактах) из травы солодки голой обнаружено 295 наиболее вероятных метаболитов и их фрагментов по измеренной точной массе (m/z) веществ, среди которых 46 имели флавоноидную природу (табл. 1). Хроматографический профиль исследуемых образцов экстракта из надземной части солодки голой представлен на рис. 1. Рис. 1. Хроматографический профиль масс-спектрометрического детектирования полного ионного тока (TIC) для образца этанольного экстракта из надземной части солодки голой Изучение структурно-группового состава показало присутствие в надземной части солодки голой таких групп флавоноидов, как флавонов, флаванонов, ауронов, флавонолов, халконов, изофлавонов, а также их гликиозидов (рис. 2). Таблица 1. Флавоноидные соединения, идентифицированные в экстрактах из надземной части солодки голой Время удержи-вания, мин. m/z Соединение Группа БАС S пика, % 9,22 595,16 w/o MS2: apigenin 6,8-digalactoside Flavonoid 8-C-glycosides 0,39 9,79 503,07 w/o MS2: Myricetin, 3-Galactopyranoside Flavonoid-3-O-glycosides 0,02 10,44 565,15 w/o MS2: Isoshaftoside Flavonoid 8-C-glycosides 0,54 11,23 303,05 w/o MS2: 5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one Flavones 0,68 11,38 633,14 w/o MS2: RUTOSIDE (rutin) Flavonols 1,18 11,50 433,11 w/o MS2: Isovitexin Flavonoid C-glycosides 0,04 11,55 303,05 quercetin Flavonols 0,87 11,81 433,11 Sophoricoside Isoflavonoid O-glycosides 0,01 12,35 573,08 w/o MS2: Quercetin 3-O-malonylglucoside Flavonols 0,09 12,87 449,10 w/o MS2: luteolin 4'-O-glucoside Flavones 1,08 12,88 287,05 w/o MS2: Luteolin Flavones 0,86 12,89 471,08 w/o MS2: Kaempferol-4’-glucoside Flavonols 0,31 13,35 501,10 w/o MS2: Isorhamnetin-3-O-beta-D-Glucoside Flavonols 0,01 14,89 287,05 w/o MS2: Kaempferol Flavonols 0,12 15,48 271,06 Apigenin Flavones 0,06 15,49 433,11 w/o MS2: Apigenin-7-O-glucoside Flavones 0,03 15,66 417,11 w/o MS2: Puerarin Isoflavonoid C-glycosides 0,01 15,84 303,05 w/o MS2: Morin Flavonols 0,10 17,06 257,08 w/o MS2: Isoliquiritigenin 2’-Hydroxychalcones 0,01 17,62 271,05 Genistein Isoflavones 3,05 17,80 273,07 w/o MS2: Naringenin Flavanones 0,98 17,83 279,06 w/o MS2: Liquiritigenin Flavanones 0,01 17,88 441,11 w/o MS2: liquiritin 2'-Hydroxychalcones 0,01 18,34 275,09 Phloretin 2'-Hydroxy-dihydrochalcones 0,01 18,42 301,07 w/o MS2: (2Z)-4,6-dihydroxy-2-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)methylidene]-1-benzofuran-3-one Aurone flavonoids 0,22 18,79 321,07 w/o MS2: 2'-Methoxyformonetin 4'-O-methylisoflavones 0,01 19,03 301,07 w/o MS2: 3'-hydroxygenkwanin 7-O-methylated flavonoids 0,25 19,17 317,06 w/o MS2: isorhamnetin Flavonols 0,17 20,10 257,08 w/o MS2: (2E)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propen-1-one 2'-Hydroxychalcones 0,04 20,81 291,06 w/o MS2: Formononetin 4'-O-methylisoflavones 0,05 23,45 255,06 w/o MS2: Chrysin Flavones 0,18 23,53 357,13 w/o MS2: (2S,3S)-3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-8-(3-methylbut-2-enyl)-2,3-dihydrochromen-4-one 8-prenylated flavanones 1,85 23,67 287,09 w/o MS2: Sakuranetin 7-O-methylated flavonoids 0,95 23,78 375,10 w/o MS2: Casticin 7-O-methylated flavonoids 0,01 23,82 257,08 5,7-dihydroxy-2-phenyl-2,3-dihydrochromen-4-one Flavanones 4,16 24,29 271,05 Galangin Flavonols 1,88 24,46 315,08 w/o MS2: 3,7-Dihydroxy-3',4'-dimethoxyflavone Flavonols 0,01 24,52 307,05 w/o MS2: Glycitein Isoflavones 0,02 25,43 243,10 w/o MS2: Equol Isoflavanols 0,03 26,00 341,13 w/o MS2: 8-Prenylnaringenin 8-prenylated flavanones 2,47 26,34 425,19 w/o MS2: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-6-[(2E)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-5,7-dihydroxy-2,3-dihydrochromen-4-one 6-prenylated flavanones 0,10 26,93 241,08 w/o MS2: 6-Hydroxyflavanone Flavanones 0,01 30,03 271,09 Alpinetin 5-O-methylated flavonoids 0,04 35,67 425,19 w/o MS2: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-6-[(2E)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-5,7-dihydroxy-2,3-dihydrochromen-4-one 6-prenylated flavanones 0,05 33,75 325,14 5,7-dihydroxy-8-(3-methylbut-2-enyl)-2-phenyl-2,3-dihydrochromen-4-one 8-prenylated flavanones 5,01 Рис. 2. Структурно-групповой состав флавоноидов, идентифицированных в спиртовых экстрактах из надземной части солодки голой В ходе анализа установлено, что более 9% от суммы площади всех зарегистрированных пиков, идентифицированных в исследуемых экстрактах соединений, приходится на пренилфлавоноиды. При этом доминирующим среди данных соединений являлся 5,7-дигидрокси-8-(3-метилбутил-2-енил)-2-фенил-2,3-дигидрохромен-4-он (глабранин) (рис. 3), пик которого был зарегистрирован на хроматограмме 33,75 минуте. Точно измеренная молекулярная масса данного соединения составила 325,1432. а б в Рис. 3. Хромато-масс-спектроскопический профиль идентифицированного в траве солодки голой глабранина: а - экстрагированная ионная хроматограмма; б - масс-спектр идентифицированного соединения в RT=33,75 его фрагментарных ионов от m/z = 325.1432; в - структурная формула При этом на долю глабранина в исследуемых образцах экстрактов приходится 5,01±0,02% от общей площади, зарегистрированных на хроматограмме пиков и 18% от пиков, обнаруженных флавоноидов. Также отмечено высокое содержание таких пренилфлавоноидов, как (2S,3S)-3,5,7-тригидрокис-2-(4-гидроксифенил)-8-(3-метилбут-2-енил)-2,3-дигидрохромен-4-она (1,85±0,01%) и 8-пренилнарингенина (2,47±0,02%), идентифицированных на 26 и 23,53 минутах. Важным в составе выделенных из надземной части солодки голой соединений флавоноидной природы является наличие флаванонов. На 23,82 минуте наблюдался пик, соответствующий 5,7-дигидрокси-2-фенил-2,3-дигидрохромен-4-ону, по своей структуре являющийся пиноцебрином. Процентное содержание данного флавоноида в исследуемых экстрактах составило 4,16±0,01%. С присутствием пиноцембрина связывают способность извлечений из травы солодки голой оказывать противовоспалительное действие [6]. Доказано, что в дозе 25 мг/кг пиноцембрин уменьшает формалиновое воспаление на 40,3%, и превосходит по своей активности индометацин [1]. Среди флаванонов также были обнаружены нарингенин, и типичный для подземных органов лекарственного растения ликвиритигенин. Наиболее разнообразными в плане компонентного состава надземной части солодки голой оказались флавоны и флавонолы. Среди последних в извлечениях из травы солодки голой идентифицированы кверцетин и его гликозиды - рутин, кверцетин 3-O-магноилглюкозид, содержание которых составило 0,87±0,01%, 1,18±0,01%, 0,09±0,0% соответственно. В меньшем количестве обнаружены кемпферол (0,12±0,01%), кемпферол-4-глюкозид (0,31±0,01%), изорамнетин (0,17±0,01 %) и другие флавонолы. Флавоны представлены лютеолином, апигенином и их гликозидами, а также хризином. В спиртовом извлечении из надземной части солодки голой обнаружены характерные для подземных органов данного вида халконы ликвиритин и изоликвиритигенин. Однако в количественном плане их значительно меньше (по 0,001% от площади всех пиков на хроматограмме) по сравнению с официнальным сырьем. В исследуемых экстрактах отмечено достаточно высокое содержание изофлавоноидов - 3,18±0,03%. Они представлены такими соединениями, как генистеин, глицитеин, формононетин, метоксиформононетин. Изофлавоноиды во многом представлены в надземных и подземных органах различных видов семейства Fabaceae. В последние годы появляется все больше доказательств того, что изофлавоноиды обладают выраженной противораковой активностью, модулируют углеводный обмен, регулируют гипергликемию, вызывают дислипидемию, уменьшают инсулинорезистентность, что, в свою очередь, способствует замедлению прогрессирования долгосрочных осложнений диабета, включая сердечно-сосудистые заболевания, нефропатию, нейропатию и ретинопатию [13, 15, 16, 18]. Таким образом, идентифицированные в траве солодки голой изофлавоноиды также могут вносить свой вклад в формирование фармакологической активности и обуславливать ее широкий спектр. Заключение Методом хромато-масс-спектрометрии изучен компонентный состав флавоноидов, входящих в состав спиртовых извлечений из надземной части солодки голой. Идентифицировано 46 соединений флавоноидной природы, а также дана их количественная оценка. Установлено, что основу флавоноидной фракции составляют пренилфлавоноиды, флаваноны, флавонолы, флавоны и изофлавоноиды. В небольших количествах в извлечениях обнаружены ауроны, халконы, а также пренилированные формы изофлавоноидов. Из индивидуальных соединенинй флавоноидной природы отмечено высокое содержание глабранина, доля которого составила 5,01±0,02% от общей площади, зарегистрированных на хроматограмме пиков, пиноцембрина - 4,16±0,01%, 8 - пренилнарингенина - 2,47%, генистеина - 3,05%, рутина - 1,18±0,01% и др. Таким образом, структурное разнообразие обнаруженных в спиртовых извлечениях из травы солодки голой флавоноидов характеризует высокую биологическую активность данного растительного сырья и обуславливает возможность его использования в качестве перспективного источника при разработке новых лекарственных средств.

Об авторах

Ольга Викторовна Недилько

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: email@example.com
старший преподаватель кафедры фармацевтической, токсикологической химии, фармакогнозии и ботаники Россия, 400066, Волгоград, пл. Павших Борцов, 1

Алефтина Владимировна Яницкая

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: email@example.com
кандидат биологических наук, доцент кафедры фармацевтической, токсикологической химии, фармакогнозии и ботаники Россия, 400066, Волгоград, пл. Павших Борцов, 1

Григорий Владиславович Гришанин

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: email@example.com
студент фармацевтического факультета Россия, 400066, Волгоград, пл. Павших Борцов, 1

Список литературы

Дополнительные файлы