РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ АНАЛИТИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ХЛОРОФИЛЛОВ В КРАПИВЫ ДВУДОМНОЙ ЛИСТЬЯХ

Полный текст

Введение По химической структуре хлорофиллы представляют собой сложные эфиры дикарбоновой хлорофиллиновой кислоты и 2 остатков метанола и фитола, являясь при этом магниевыми комплексами тетрапирролов. В настоящее время хлорофиллы используются в пищевой промышленности в качестве пигментов и в медицинской практике в виде растворов для наружного применения. Имеются исследования, показывающие наличие биологической активности хлорофиллов при пероральном применении- стимуляция гемопоэза [5]. Наличие данного вида биологической активности обосновывается схожей химической структурой хлорофилла со структурой гема- важного составляющего гемоглобина. В связи с этим, актуальна разработка лекарственных препаратов для перорального применения на основе хлорофиллов. [5] Большая часть препаратов и биологически активных добавок (БАДов) на данный момент производится на основе хлорофиллов, выделенных из листьев эвкалипта и шелковицы, люцерны травы и т.д. Обращает внимание растительное сырье крапивы двудомной листья (Urtica dioica L. (сем. Крапивные - Urticaceae)), так как оно содержит большое количество хлорофиллов и имеет значительные запасы сырья в Российской Федерации, в том числе и на Урале, неприхотливо к погодным условиям и производит большие объемы зеленой массы. В связи с этим является перспективным расширение использования фармакопейного сырья крапивы двудомной листьев в фармации. [10] Для разработки лекарственных препаратов на основе хлорофиллов из крапивы двудомной листьев необходимо выбрать оптимальные условия их экстрагирования из сырья и методики количественного определения хлорофиллов в полученных извлечениях. Актуальность определения условий экстракции и количественного определения хлорофиллов в растительном сырье подтверждается публикациями современных исследователей по изучению шлемника байкальского и обыкновенного [11], облепихи крушиновидной [6], кукурузы [3] и т.д. Цель исследования - разработка методики количественного определения хлорофиллов, выделенных из крапивы двудомной листьев и определение основных валидационных характеристик. Методика Количественное содержание хлорофиллов определяли в сырье крапивы двудомной листьев АО «Красногорсклексредства» (серия: 30222, дата производства: 02/2022, срок годности 3 года). Для вычисления потери в массе при высушивании сырье высушивалось в анализаторе влажности «Эвлас-2М» в течение часа при 100°C. [2]. Определение оптической плотности проводили на фотометре КФК-3 «ЗОМЗ» в кювете с длиной поглощающего слоя- 10 мм. Оптическую плотность определили трижды, после чего вычисляли среднее значение. Пробоподготовка заключалась в дробной экстракции в течение часа по 30 мин каждая измельченного сырья с размером частиц 1,0 мм на водяной бане при температуре 100°C 70% этиловым спиртом в соотношении сырье:экстрагент 1:100, объединение извлечений и доведение используемым растворителем до 100 мл, с последующим разведением полученного раствора в соотношении 2:25 95% этиловым спиртом. Количественное определение включало измерение оптической плотности раствора относительно 95% этилового спирта в максимуме поглощения 663±5 нм, вычисление содержания хлорофилла в процентах, в пересчете на абсолютно сухое сырьё, по формуле: , где: A - оптическая плотность раствора в соответствующем максимуме поглощения; m - масса сырья, г; W - потеря в массе при высушивании, % (W = 5,41%); 944,5 - удельный показатель поглощения хлорофилла при 663нм [9]. В ходе пробоподготовки установлено, что экстракция начинается при температуре водяной бани 85°C (температура кипения этилового спирта). С целью выбора оптимального метода экстракции и количественного определения, опробована методика, описанная в статье [3]. Содержание хлорофиллов вычисляется по формуле [3]: , где: A оптическая плотность фотометрируемого раствора; b - тангенс угла наклона градуировочного графика; m - масса навески, г. Общее содержание хлорофиллов определялось фотометрическим методом градуировочного графика, построенного с использованием реактива Гетри. Для экстракции использовали 80% раствор ацетона. Методика анализа: Навеску листьев массой 0,1 г помещали в фарфоровую ступку, добавляли на кончике шпателя сухой карбонат кальция и растирали с 2-3 мл 80% ацетона, затем добавляли 10 мл раствор ацетона и продолжали растирать в течение 5 мин. Полученную вытяжку фильтровали в мерную колбу на 25 мл. Экстракцию проводили повторно с порцией чистого растворителя, добиваясь полного обесцвечивания тканей листа. Объём вытяжки доводили до метки. Фотометрирование вытяжки проводили при 670 нм, раствор сравнения -80% раствор ацетона, в кюветах длиной 1 см. Анализ проводили при комнатной температуре на рассеянном свету, не допуская попадания прямых солнечных лучей, так как фотоокисление хлорофилла приводит к искажению результатов анализа. [3] Электронные спектры (рис. 1) поглощения измеряли на спектрофотометре SHIMADZU UV-1800 в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм в диапазоне волн 550-750 нм. При изучении спектральных характеристик извлечений из крапивы двудомной листьев наблюдали максимум поглощения в области 663±5 нм, свойственный для хлорофилла А и пики в области 642±3 нм, свойственные для хлорофилла Б [4], что свидетельствует о количественном преимуществе хлорофилла А в крапиве двудомной листьях. Рис. 1. Спектр поглощения спиртового извлечения из крапивы двудомной листьев Результаты исследования и их обсуждение Специфичность методики оценивали по совпадению положения максимумов на спектрах поглощения индивидуальных хлорофиллов и исследуемого извлечения (рис. 1). Для хлорофиллов характерен максимум поглощения, расположенный при 663 нм [7, 11]. Линейность определяли на 5 уровнях концентраций: 91%, 96%, 100%, 107%, 109%, которые указаны в табл. 1. Таблица 1. Уровни концентраций для определения линейности Количественное содержание хлорофилла, % Оптическая плотность 0,2462 0,088 0,2611 0,140 0,2714 0,194 0,2896 0,259 0,2956 0,318 График, уравнение линейности и коэффициент аппроксимации представлены на рис. 2. Коэффициент корреляции (R2) при интервале навески 0,5 - 1,5 г = 0,9814. Аналитическая область валидируемой методики количественного определения находится в интервале от 0,5 до 1,5 г. За номинальное значение принята навеска сырья массой 1 г. Рис. 2. График линейности методики Результаты, полученные при статистической обработке, достоверны при доверительной вероятности 95% и свидетельствуют о прецизионности методики в условиях повторяемости (табл. 2) Таблица 2. Прецизионность методики определения хлорофиллов (Р=95%; n=6) Проба Оптическая плотность Содержание, % 1 0,224 0,2527 2 0,194 0,2714 3 0,197 0,2751 4 0,212 0,2913 5 0,189 0,2938 6 0,209 0,3249 Примечание: наименьшее значение, % = 0,2527; наибольшее значение, % = 0,3249; среднее значение, % = 0,2849; доверительный интервал (p=95%), % = 0,2849±0,0256; стандартное отклонение, % = 0,0245 Проведена метрологическая оценка валидированной методики согласно ОФС.1.1.0013 «Статистическая обработка результатов физических, физико-химических и химических испытаний» [2]. Относительная ошибка единичного определения составляет 10,53% (с доверительной вероятностью 95%) (табл. 3). В результате проведённых исследований в качестве критерия качества сырья по показателю «Количественное определение» можно предложить регламентировать содержание суммы хлорофиллов - не менее 0,2%. С целью выбора оптимального метода экстракции и количественного определения, опробована методика с использованием метода фотометрии по градуировочному графику с реактивом Гетри [3]. Таблица 3. Метрологическая характеристика методики определения хлорофиллов (Р=95%; n= 6) n f s2 RSDx 6 5 0,2849 0,0006 3,49 0,0256 0,2849±0,03 10,53 Для построения градуировочного графика (рис. 3) использовали стандартный раствор реактива Гетри в 7 разведениях, которые соответствуют определённому содержанию хлорофилла. Зависимость оптической плотности от концентрации хлорофилла в реактиве Гетри представлена в табл. 4. Рис. 3. Градуировочный график для определения содержания хлорофилла Таблица 4. Зависимость оптической плотности от концентрации хлорофилла Объём реактива Гетри, мл Концентрация хлорофилла, мг/25 мл Оптическая плотность 2,5 0,21 0,066 5,0 0,42 0,128 10,0 0,85 0,242 12,5 1,06 0,291 15,0 1,27 0,338 17,5 1,48 0,363 20,0 1,70 0,398 По полученным результатам, представленным в табл. 5, можно сделать вывод, что методика неповторяема, с заниженными результатами количественного содержания хлорофиллов. Таблица 5. Содержание хлорофилла с реактивом Гетри Масса навески, г Оптическая плотность Содержание хлорофиллов, % 0,1001 0,345 0,1803 0,1001 0,291 0,1521 0,1022 0,091 0,0466 0,1018 0,124 0,0637 0,1025 0,121 0,0618 0,1006 0,080 0,0416 Сравнительным анализом двух опробованных методик определения содержания хлорофиллов, выделенных из крапивы двудомной листьев, установлено, что более точной является методика с использованием удельного показателя поглощения хлорофилла [9]. Для оценки перспективности крапивы двудомной листьев в качестве источника хлорофиллов, представлялось интересным сравнить полученные данные по их содержанию в образцах с литературными данными [1, 6-8] других представителей растительного сырья (табл. 6). При этом установлено, что содержание хлорофиллов в различных видах растительного сырья находится в диапазоне от 0,1 до 0,75%. Результаты исследования показывают необходимость оптимизации метода экстракции и количественного определения хлорофиллов из крапивы двудомной листьев с целью увеличения выхода хлорофиллов. Таблица 6. Литературные данные по содержанию хлорофиллов в образцах других представителей растительного сырья № Название вида растительного сырья Содержание хлорофиллов, % 1 Tanacetum achilefolium (M. Bieb.) Sch. Bip 0,652 2 Potentila glaucescens Schltdl. 0,581 3 Salvia stepposa Des.-Shost 0,469 4 Artemisia austrioca Jacq. 0,512 5 Fragaria viridis (Duchesne) Weston 0,450 6 Urtica dioica 0,60-0,75 7 Medicago sativa L. 0,2-0,4 8 Morus bombycis 0,2-0,4 9 Eucalyptus viminalis Labill. (препарат «Хлорофиллипт») 0,1-0,5 Заключение Разработана методика количественного определения хлорофиллов методом фотометрии в крапивы двудомной листьях, которая может быть использована для стандартизации данного лекарственного растительного сырья. Из двух опробованных методик количественного определения хлорофиллов, выделенных из крапивы двудомной листьев, выбрана более точная методика с использованием удельного показателя поглощения хлорофиллов. Результаты, полученные при статистической обработке, достоверны при доверительной вероятности 95% и свидетельствуют о прецизионности методики в условиях повторяемости. На основании полученных результатов сделан вывод, что методика линейна и специфична. Проведена метрологическая оценка разработанной методики. Относительная ошибка единичного определения составляет 10,53%. Аналитическая область валидируемой методики количественного определения находится в интервале от 0,5 до 1,5 г. Аналитическая методика валидна и пригодна для фотометрического определения хлорофиллов, выделенных из крапивы двудомной листьев.

Об авторах

Наталья Сергеевна Русаева

ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России

Email: email@example.com
аспирант кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии Россия, 614990, Пермь, ул. Полевая, 2

Елена Игоревна Молохова

ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России

Email: email@example.com
доктор фармацевтических наук, профессор кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии Россия, 614990, Пермь, ул. Полевая, 2

Елена Станиславовна Березина

ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России

Email: email@example.com
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической химии Россия, 614990, Пермь, ул. Полевая, 2

Список литературы

Дополнительные файлы