РАЗРАБОТКА СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ПОБЕГАХ CRATAEGUS PINNATIFIDA BUNGE С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОЛОГИИ ЦЕНТРАЛЬНОГО КОМПОЗИЦИОННОГО ПЛАНА

Полный текст

Введение Боярышник перистонадрезанный (Crataegus pinnatifida Bunge) - кустарник или небольшое дерево, вид рода боярышник (Crataegus) из семейства розоцветных (Rosaceae). В России естественно произрастает на Дальнем Востоке в Приморье и Приамурье (бассейн среднего и нижнего Амура и Уссури), а за ее пределами в Корее и Китае (северные районы, включая Маньчжурию) [4]. Современные фармакологические эксперименты in vitro и in vivo, а также клинические исследования показали, что боярышник перистонадрезанный обладает разнообразными биологическими эффектами и препараты на его основе могут быть использованы для лечения сердечно-сосудистых, нейродегенеративных, эндокринных, бактериальных и др. заболеваний [5-11]. Широкий спектр фармакотерапевтической активности вида обеспечивается различными классами природными соединения, среди которых наиболее распространенными и важными активными компонентами рассматриваются флавоноиды и их производные [8]. Боярышник перистонадрезанный имеет долгую историю использования в качестве лекарственного растения в Китае и включен в Китайскую фармакопею. К сожалению, боярышник перистонадрезанный не входит в перечень официнальных видов, разрешенных к применению в России. Между тем, с точки зрения ресурсного потенциала и высокой биологической активности этот дальневосточный вид представляет научно-практический интерес и заслуживает внимания отечественной официальной медицины. На кафедре фармации и фармакологии Дальневосточного государственного медицинского университета проводятся многопрофильные фармакологические и фармакогностические исследования боярышника перистонадрезанного с целью включения его в медицинскую практику. Среди прочего решаются вопросы и стандартизации сырья этого вида. В этой связи актуальным являются исследования по разработке методик количественного определения биологически активных веществ в сырье боярышника перистонадрезанного. Цель исследования - разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в побегах боярышника перистонадрезанного с использованием дифференциальной спектрофотометрии. Методика В качестве объекта исследования служили побеги боярышника перистонадрезанного, собранные в фазу начала цветения. Сбор сырья проводили в естественных природных популяциях Хабаровского края (с. Бычиха, Хабаровский район) в 2023 г. С точки зрения морфологии исследуемое сырье представляет собой верхушки ветвей с зелеными стеблями, листьями, цветками и бутонами. Поэтому с целью достижения однородности аналитической навески сырья для проведения экстракции априори использовали сырье, измельченное до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. Выбор указанной степени измельчения подтверждается и данными литературы [2]. Для количественного определения флавоноидов использовали метод дифференциальной спектрофотометрии. Метод основан на реакции комплексообразования флавоноидных соединений с алюминия хлоридом. Данный метод предполагает использование в качестве контроля испытуемый раствор без реактива (алюминия хлорида), что приводит к уменьшению влияния сопутствующих веществ. Содержание суммы флавоноидов рассчитывали в эквиваленте на гиперозид, так как этот флавоноид является одним из основных в биологически активном комплексе боярышника перистонадрезанного [5, 8]. В расчетах использовали удельный показатель поглощения гиперозида [3]. Исследования проводили в соответствии со следующей методикой. Точные навески измельченного сырья (0,25; 0,50; 1,00; 2,00) помещали в колбы со шлифом, прибавляли по 50 мл спирта этилового (50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%) и взвешивали с погрешностью ±0,01 г. Колбы присоединяли к обратным холодильникам и экстрагировали на кипящей водяной бане в течение 15, 30, 45 и 60 мин. Затем колбы с извлечениями охлаждали, взвешивали и доводили до первоначальной массы соответствующим экстрагентом. Извлечения фильтровали через обеззоленные фильтры (красная лента), отбрасывали первые 10 мл фильтрата (испытуемые растворы А). Далее определенный объем испытуемых растворов А помещали в мерные колбы вместимостью 25 мл, прибавляли раствор алюминия хлорида 3% в спирте этиловом 70% - 1, 2, 3 и 4 мл, доводили до метки спиртом этиловым 70% и перемешивали (испытуемые растворы Б). Оптическую плотность испытуемых растворов Б измеряли через 15, 30, 45 и 60 мин на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из испытуемого раствора А, доведенного спиртом этиловым 70% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид в абсолютно сухом сырье боярышника перистонадрезанного в процентах (Х) вычисляли по формуле: , где А - оптическая плотность испытуемого раствора Б; - удельный показатель поглощения комплекса гиперозида с алюминия хлоридом при длине волны 410 нм, равный 330; V - объём аликвоты экстракта, мл; а - навеска сырья, г; W - влажность сырья, %. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре UV-1700, Shimadzu (Япония). Каждый опыт в эксперименте проводили в трех повторностях. Статистическую обработку результатов исследований и построение графической зависимости осуществляли с помощью пакетов прикладных компьютерных программ Microsoft Office Excel 2010 и Statistica 10.0. Результаты исследования и их обсуждение На первом этапе исследований было изучено влияния факторов реакции образования комплексов флавоноидов с алюминия хлоридом - оптимальное количество реагента, время реакции и стабильность комплекса. Требуемое количество реагента было определено экспериментально по максимальному выходу продукта реакции, то есть по максимальному светопоглощению на серии растворов. Установлено, что количество 3% спиртового раствора алюминия хлорида, обеспечивающее полноту образования комплекса, при самом максимальном содержании флавоноидов в конечном разведении (оптическая плотность около 0,9-1,0) составляет 2 мл. Реакция комплексообразования развивается в течение 20 мин, как минимум 60 мин комплекс остается стабильным. На следующем этапе разработки методики были исследованы параметры экстракции флавоноидов. Тестируемые переменные включали: концентрацию этилового спирта (50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%), соотношение сырья к экстрагенту (0,25; 0,50; 1,00; 2,00), время экстракции в минутах (15, 30, 45 и 60 мин.). Дизайн эксперимента предполагал изменение одного параметра при постоянном уровне двух других. Результаты исследований представлены на рис. 1. Как видно (рис. 1А), время экстракции не влияет на выход флавоноидов из сырья. Между тем, однофакторный анализ (рис. 1А и 1Б) показал, что соотношение сырья к экстрагенту и концентрация спирта этилового влияют на экстракцию флавоноидов (рис. 1Б). Выход флавоноидов из сырья (рис. 1Б) достоверно увеличивается при повышении концентрации спирта этилового (интервал от 50% до 80%), последующее увеличение концентрации экстрагента показало снижение содержания флавоноидов в экстракте. Установлено, что объем этилового спирта по отношению к количеству экстрагируемого растительного материала характеризуется положительным прямо пропорциональным соотношением в ряду 1:25-1:50-1:100 (рис. 1А). При соотношении сырья к экстрагенту 1:100 зафиксирован максимальный выход флавоноидов в экстракт, при дальнейшем увеличении объема спирта этилового (1:200) достоверных различий в содержании исследуемой группы веществ в экстракте не обнаружено. Для оптимизации экстракции флавоноидов из побегов боярышника перистонадрезанного далее была использована 3-х уровневая 2-х факторная методология центрального композиционного ортогонального плана (ЦКОП) второго порядка типа 22. Значение «звездного» плеча α=1. Центральный композиционный план относится к группе методов планирования, позволяющий проводить исследования по оптимизации условий с наименьшим количеством экспериментов и с меньшими затратами времени и ресурсов [1]. В соответствии с результатами однофакторного анализа (рис. 1) в качестве параметров для последующей оптимизации экстракции были выбраны: соотношение сырья к экстрагенту (Х1=1:25; 1:100; 1:175), концентрация этилового спирта (Х2=65%; 80; 95%). Схема эксперимента приведена в таблице 1 в кодированном и фактическом уровнях указанных двух переменных. Экспериментальный план состоял из 9 опытов, включая одну центральную точку. В качестве функции отклика (Y) процесса экстракции использовали соответственно сумму флавоноидов в пересчете на гиперозид в абсолютно сухом сырье. Рис. 1. Однофакторный анализ экстракции флавоноидов из побегов боярышника перистонадрезанного: А - время экстракции и соотношение сырья к экстрагенту; Б - концентрация спирта этилового Таблица 1. Конструкция ЦКОП и соответствующие значения отклика при экстракции флавоноидов из побегов боярышника перистонадрезанного № Матрица планирования Рабочая матрица Отклик, % Х1 Х2 Х12 (Х1)2 (Х2)2 Соотношение сырья к экстрагенту Содержание спирта, % Yср.эксп. Yрасч. 1 - - + 1/3 1/3 1:25 65 1,45 1,46 2 + - - 1/3 1/3 1:175 65 1,52 1,51 3 - + - 1/3 1/3 1:25 95 1,58 1,59 4 + + + 1/3 1/3 1:175 95 1,67 1,67 5 - 0 0 1/3 - 2/3 1:25 80 1,67 1,65 6 + 0 0 1/3 - 2/3 1:175 80 1,75 1,76 7 0 - 0 - 2/3 1/3 1:100 65 1,55 1,55 8 0 + 0 - 2/3 1/3 1:100 95 1,70 1,69 9 0 0 0 - 2/3 - 2/3 1:100 80 1,78 1,79 Примечание: время экстракции во всех опытах составляло 30 минут Регрессионный анализ экспериментальных данных (табл. 2) позволил получить математическую модель, которая отражает влияние факторов экстракции на функцию отклика в виде полинома второй степени: Y = 1,6300+0,0400Х1+0,0717Х2+0,0075Х12-0,0703(Х1)2-0,1553(Х2)2 Таблица 2. Расчет и анализ математической модели экстракции флавоноидов из побегов боярышника перистонадрезанного Этапы Статистические характеристики Результаты Проверка гипотезы об однородности дисперсий Критерий Кохрена Gэксп. 0,2264 G0,95(2;9) 0,4775 Расчет коэффициентов математической модели свободный коэффициент b0 1,6300 линейные коэффициенты b1 0,0400 b2 0,0717 коэффициент парного взаимодействия b12 0,0075 центрированные квадратичные коэффициенты b11 -0,0703 b22 -0,1553 Проверка значимости коэффициентов уравнения регрессии Дисперсия воспроизводимости 0,0006 Дисперсии коэффициентов регрессии 0,00019 0,00024 0,00029 0,00042 Значение t-соотношения t0,95(18)=2,10 t0 = 8150 t1 = 17 t2 = 299 t12 = 25 t11 = 168 t22 = 370 Проверка гипотезы об адекватности математической модели Дисперсия адекватности 0,001 Критерий Фишера Fэксп. 1,69 F0.95(3;18) 3,16 На рис. 2 продемонстрирована точность модели и ее возможность прогнозирования. На основании анализа данных (табл. 2, рис. 2), установлено, что полученная математическая модель адекватна (Fэксп. function displayCitations(citationsIndex) { var citationsIndexString = citationsIndex.toString(); if (citationsIndexString.search(/[–\-\—\–]/g) != -1) { var citationsArray = citationsIndexString.split(/[–\-\—\–]/); var citationContent = ""; for (var i = parseInt(citationsArray[0]); i < parseInt(citationsArray[1])+1; i++) { citationContent = citationContent + "

" + i + ".

" + citationData[i] + "

"; } $('#modalCitationsDataContent').html(citationContent); } else { $('#modalCitationsDataContent').html("

" + citationsIndex + ".

" + citationData[citationsIndex] + "

"); } $('#modalCitations').css('display', 'flex'); $('#modalCitations').show(); } function closeModal() { var modal = document.getElementById("modalCitations"); modal.style.display = "none"; }

×

Об авторах

Галина Ярославовна Мечикова

ФГБОУ ВО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: email@example.com
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармации и фармакологии Россия, 680000, Хабаровск, ул. Муравьева-Амурского, 35

Иван Владимирович Толстенок

ФГБОУ ВО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: email@example.com
кандидат биологических наук, доцент кафедры химии Россия, 680000, Хабаровск, ул. Муравьева-Амурского, 35

Список литературы

Дополнительные файлы