Оптимизация и валидация количественного метода оценки реактивности Т-клеток памяти человека к антигенам вируса SARS-CoV-2 с использованием проточной цитометрии

Адекватный и репрезентативный мониторинг популяционного иммунитета к вирусу COVID-19, включая долгосрочное влияние на переболевших и вакцинированных людей, должен включать не только исследование гуморального, но также и Т-клеточного иммунного ответа. При этом важную информацию может дать не только способность клеток активироваться в ответ на специфический антиген, но и определение фенотипа реактивных клеток. Для этого нами разработан метод проточной цитометрии для оценки содержания антиген-реактивных Т-клеток, продуцирующих внутриклеточный IFNγ под воздействием на мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) человека антигенов вируса SARS-CoV-2, и проведена его валидация. Валидационные испытания методики проводили по следующим характеристикам: чувствительность, специфичность, прецизионность и робастность. Валидационные испытания методики по характеристикам «чувствительность» и «специфичность» проводили, исследуя положительные образцы доноров, переболевших COVID-19, с диагнозом, верифицированным лабораторными методами, и отрицательные образцы, отобранные от доноров с отрицательным анамнезом, не контактировавших с больными COVID-19, с отсутствием антител к антигенам SARS-CoV-2. Из крови доноров выделяли мононуклеарные клетки периферической крови методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла и стимулировали специфические Т-клетки пептидами, соответствующими основным белковым антигенам коронавируса SARS-CoV-2 — пептиды S-белка и пептиды белков N, M, ORF3a и ORF7a. Учитывали данные на проточном цитометре, выделяя Т-клетки, продуцирующие IFNγ, и проводили статистический анализ полученных результатов. Значения площади, ограниченной ROC-кривой и осью ложноположительных классификаций (AUC) для популяций CD4 и CD8, составило от 0,97 до 1,00. Методика показала приемлемую сходимость и внутрилабораторную прецизионность, поскольку коэффициенты вариации для всех образцов МКПК не превышали 20%. Была подтверждена робастность при использовании МКПК в свежеприготовленном виде и после цикла заморозки/разморозки. По итогам валидации установлены границы определения позитивного и негативного отклика: для CD4-позитивных Т-клеток — 0,029%, для CD8-позитивных Т-клеток — 0,064–0,068%, а также критерии приемлемости для показателей отклика положительного и отрицательного контрольных антигенов. Таким образом подтверждена пригодность методики «Оценка антиген-реактивных Т-клеток, продуцирующих внутриклеточный IFNγ под воздействием на мононуклеарные клетки периферической крови человека антигенов вируса SARS-CoV-2, методом проточной цитометрии» для получения достоверных результатов при определении содержания внутриклеточного IFNγ в МКПК. Методику использовали при характеризации стандартных контрольных образцов для внутреннего контроля качества наборов ТиграТест® SARS-CoV-2.