Генетическая модификация первичных В-клеток человека для моделирования процессов в зародышевых центрах

Основные этапы созревания антиген-специфических В-клеток протекают в герминативных центрах лимфоузлов. Здесь наивные В-клетки проходят процесс соматического гипермутагенеза, а также переключение классов синтезируемых антител. В процессе дифференцировки принимается решение, по какому пути В-клетки будут развиваться далее. Они либо превратятся в короткоживущие плазмабласты, либо в В-клетки памяти или плазматические клетки. Взаимоотношение этих процессов очень важно для развития продуктивного гуморального иммунного ответа. Имеется насущная необходимость в более детальном изучении отмеченных процессов. Целью работы являлось создание системы, которая ex vivo способна моделировать процессы, протекающие в герминативных центрах. В качестве исходного материала мы использовали первичные В-клетки из периферической крови человека. После иммуномагнитной сепарации В-лимфоциты стимулировали in vitro с помощью фидерных клеток, несущих молекулы CD40L. Другим стимулирующим фактором являлся рекомбинантный растворимый IL-21. При IL-21/CD40L стимуляции В-лимфоциты изменяли свою морфологию, поверхностный фенотип, а также функциональную активность. После активной экспансии в течении 10 дней дальнейший рост клеток останавливался, и через некоторое время они погибали. Для получения стабильно пролиферирующих В-клеток мы использовали лентивирусную трансдукцию IL-21/CD40L стимулированных IgM⁺ В-лимфоцитов. Для этого были получены препараты лентивируса, которые несли кассету, состоявшую из генов BCL6 и BCL2L1, разделенных последовательностью кодирующей саморазрезаемый пептид P2A, а также репортерный ген GFP, отделенный от целевых генов элементом IRES. Использованная кассета обеспечивала в клетках-мишенях синтез транскрипционного фактора Bcl-6 и белка Bcl-XL. Репрессор Bcl-6 не позволял В-клеткам уходить в терминальную дифференцировку и превращаться в плазматические клетки, а белок Bcl-XL оказывал анти-апоптотическое действие. Трансдуцированные В-клетки пролиферировали более месяца и сохраняли фенотип плазмабластов. При этом через 42 дня после начала стимуляции трансдуцированные В-клетки оставались GFP-позитивными, коэкспрессировали антигены CD27 и CD38, несли поверхностный CD20 и IgM, внутриклеточный Bcl-6, Bcl-XL и IgM, сохраняли секрецию IgM, но оставались негативными по поверхностному и внутриклеточному IgG. Таким образом, длительное культивирование В-клеток не приводило к переключение класса синтезируемого Ig. Отработанная система стимуляции позволит имитировать ключевые аспекты развития В-клеток в зародышевых центрах для изучения формирования В-клеточной памяти, что в конечном счете будет способствовать разработке эффективных вакцин.