Иммуно-РКК для высокочувствительной детекции комплекса «антиген-антитело» на модели антигенов группы крови

Проблему детекции малых количеств аналитов иммунохимическими методами пытаются решить давно. Одним из подходов является использование методов амплификации нуклеиновых кислот для усиления сигнала от единичного акта взаимодействия антиген-антитело. Методом амплификации, подходящим для использования на микрочипах, является реакция амплификации катящимся кольцом.

Принцип метода заключается в использовании конъюгата детектирующего антитела с праймером и последующей изотермической амплификации. После добавления к иммобилизованному праймеру кольцевых олигонуклеотидов, которые служат матрицей для амплификации (либо олигонуклеотидов, которые могут гибридизоваться с праймером и быть лигированы в кольцевую матрицу) и полимеразы фага phi29 с необходимыми для начала амплификации компонентами, начинается образование протяженного (до сотен тысяч нуклеотидов) одноцепочечного продукта реакции. Продукт представляет собой повторы нуклеотидной последовательности, комплементарной кольцевой матрице. Флуоресцентный ДНК-зонд может гибридизоваться с каждым повтором на молекуле продукта, таким образом уровень флуоресценции становится значительно выше, чем при использовании систем проявки с применением флуоресцентно-меченных антител или стрептавидина. Кроме того, продукт реакции остается иммобилизованным на поверхности, что позволяет использовать данный подход при детекции взаимодействий антиген-антитело в других твердофазных системах анализа, таких как микрочипы. Общей проблемой таких подходов является неспецифическая сорбция компонентов иммунохимической реакции либо реакции амплификации, приводящая к высокому фону. Очевидно, что каким бы высокочувствительным анализ ни был в теории, высокий фон сведет весь потенциал метода на нет.

В настоящей работе мы разработали метод, позволяющий детектировать малые количества антител к гликанам в сыворотке крови и в смывах с опухолевых клеток в формате микрочипа на модели антигенов группы крови. Удалось получить 30-70 кратный прирост флуоресценции от специфического взаимодействия по сравнению с использованием флуоресцентно-меченного стрептавидина. Разрабатываемый нами метод является перспективным, так как позволяет значительно увеличить сигнал от специфического взаимодействия антиген-антитело в формате гликочипа, что позволит детектировать антитела к гликанам в образцах с очень небольшой концентрацией антител, например, в смывах с опухолевых клеток.