Состав жирных кислот, фитостеринов и суммарное содержание антиоксидантов семян Morus L.

Полный текст

В последние годы во многих странах мира ведется поиск дешевых и эффективных биологически активных веществ, источниками которых чаще всего становятся растительные объекты. Существует факт положительной связи между потреблением растительной пищи и снижением смертности от болезней (Cox et al., 2000; Prior, Cao, 2000; Wargovich, 2000; Huang et al., 2005; Prior et al., 2005; Del Rio et al., 2010; Rahal et al., 2012; Upadhayay et al., 2013; Hu et al., 2021) из-за наличия в них биологически активных веществ и антиоксидантов (Skrovankova et al., 2015). Антиоксиданты растительных объектов обладают способностью блокировать оксидантный стресс. Они защищают клеточные мембраны, ДНК от разрушения, предотвращают начало хронических заболеваний (Garcia-Closas et al., 1999; Dillard, German, 2000; Gurib-Fakim, 2006;).

Одним из привлекательных растительных объектов является плодово-ягодная культура шелковица Morus L. Шелковица – древесное растение, обладающее биологическим и химическим потенциалом, имеет также огромную экономическую ценность и важное хозяйственное значение. К роду Morus относятся 16 видов, более часто встречаются Morus alba, Morus nigra, Morus rubra. Стоит отметить, что вид M. alba обладает свойством полиморфизма (Bajpai et al., 2015).

Литературные данные показывают, что Morus обладает антиоксидантной, нейропротекторной, антиатеросклерозной, иммуномодулирующей, противоопухолевой активностью (Guil‐Guerrero, 2007; Kim, Chung, 2018; Zhang et al., 2018; Kim et al., 2019).

Активно исследуются все части растения (плоды, листья, кора, корни, древесина), однако литературные данные отсутствуют по антиоксидантным свойствам семян шелковицы. Семена шелковицы являются ценным вторичным сырьем, содержащим полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) (Yang et al., 2011; Van Hoed et al., 2011). Масла семян благодаря своему составу являются биологически ценными растительными жирами (Van Hoed et al., 2009; Pieszka et al., 2015). Они также содержат необходимые для организма фитостерины, способные снизить уровень холестерина в крови и предотвратить сердечно-сосудистые заболевания, что придает сырью диетическую, и терапевтическую ценность (Wang et al., 2002; Vivancos, Moreno, 2005).

Таким образом, литературные данные демонстрируют высокую степень изученности биологических свойств шелковицы. Однако практически отсутствует материал по изучению суммарного содержания антиоксидантов в семенах в зависимости от вида и формы Morus, что может иметь как фундаментальную биологическую, так и прикладную значимость.

Целью данной работы является изучение накопления жирных кислот, стеринов, а также определение суммарного содержания антиоксидантов семян плодов M. alba и M. nigra, произрастающих в идентичных экологических условиях.

Материалы и методы

Объектом исследования служили семена плодов и экстрагированные масла из семян полиморфного вида шелковицы M. alba (белоплодная, черноплодная, розовоплодная формы) и M. nigra (сорт Хартут), произрастающих в Республике Дагестан.

Сбор образцов проводили в период массового созревания плодов во второй декаде июня в частном питомнике (ООО “Низам”), расположенном в пригороде г. Махачкалы (пос. Ленинкент, Республика Дагестан). Деревья одного возраста (27 лет), отдельно стоящие. Почвы на участке каштановые, суглинистые, с содержанием гумуса 2–3%. Участок поливной.

Метод получения масла

Извлечение масла из семян исследуемых образцов проводили методом экстракции в аппарате Сокслета, используя в качестве растворителя гексан. Содержание масла определяли в массовых процентах (масс. %) от исходной массы семян.

Метод определения суммарного содержания антиоксидантов (ССА)

Определение суммарного содержания антиоксидантов в водно-спиртовых вытяжках (70%) из семян плодов M. alba и M. nigra, проводили амперометрическим методом на приборе «Цвет Яуза 01-АА», основанном на измерении электрического тока в электрохимической ячейке, возникающего при подаче на электрод определенного потенциала. При построении градуировочного графика, с целью исключения случайных результатов были приготовлены растворы галловой кислоты (фирма Sigma-Aldrich, чистота > 98.5%) с массовой концентрацией 0.2; 0.4; 2.0; 4.0 мг/л и проводились 3 последовательных измерения. В качестве элюента, использовали ортофосфорную кислоту (производитель “Компонент-реактив”, РФ) с молярной долей 0.0022 моль/дм³. С помощью градуировки сравнивали сигналы исследуемого экстракта с сигналами образца сравнения – галловой кислоты. Значения СКО (относительное среднеквадратичное отклонение) по методике должны составить не более 5%. В нашем случае они не превышали 1%. Анализ проводили трижды, за результат принимали средние значения. Полученные данные обработали статистически с использованием пакета электронных таблиц Microsoft Excel и лицензионного пакета программ Statistika 5.5. Суммарное содержание антиоксидантов в исследуемых образцах семян Morus выражали в мг/г (т. е. мг-ССА/г-семян) (Яшин, Яшин, 2004).

Метод исследования жирнокислотного состава

Исследование жирнокислотного состава масел семян Morus проводили методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием (ГХ-ПИД). Режим работы хроматографа Agilent 7890A: капиллярная колонка VF-23MS (длина 30 м, внутренний диаметр 0.32 мм, толщина фазы 0.25 мкм), газ-носитель – гелий, скорость газа-носителя – 1.5 мл/мин, температура инжектора – 280°C, начальная температура печи хроматографа – 50°C, затем изотерма в течение 2 мин, после чего нагрев со скоростью 10°C/мин до 180°C, выдержка 5 мин, затем до 240°C со скоростью 5°C/мин. Общее время анализа – 32 мин. Пробу инжектировали в режиме деления потока (1:10). Идентификацию жирных кислот проводили путем сравнения времен удерживания пиков на хроматограммах испытуемых образцов с временами удерживания пиков на хроматограмме стандартного образца смеси 37 метиловых эфиров жирных кислот (Supelco® 37 component FAME mix). Каждый образец анализировали трижды, за результат принимали средние значения.

Пробоподготовка: метиловые эфиры жирных кислот получали переэтерификацией глицеридов. Навеску образца массой около 10.0 мг помещали в 7.0-мл стеклянную виалу с завинчивающейся крышкой, затем добавляли 1.0 мл метанола и 100.0 мкл ацетилхлорида. Виалу закрывали и помещали в лабораторный нагреватель на 60 мин при 80°C. После охлаждения реакционной смеси в виалу добавляли 3.0 мл бидистиллированной воды, а затем 1.0 мл н-гексана и интенсивно встряхивали. 1.0 мкл верхнего слоя н-гексана инжектировали в газовый хроматограф.

Метод исследования неомыляемой фракции

Исследование состава неомыляемой фракции масел семян проводили методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ–МС). Режим работы хроматографа Agilent 6890N: капиллярная колонка VF-5MS (длина 30 м, внутренний диаметр 0.25 мм, толщина фазы 0.25 мкм), газ-носитель – гелий, скорость газа-носителя – 1.5 мл/мин, температура инжектора – 280°C, начальная температура печи хроматографа – 60°C, затем изотерма в течение 3 мин, после чего нагрев со скоростью 10°C/мин до 290°C, выдержка при 290°C в течение 20 мин. Общее время анализа – 46 мин. Пробу инжектировали в режиме деления потока (1:10). Режим регистрации масс-спектров на магнитно-секторном масс-спектрометре JMS GCmate II (JEOL, Япония): энергия ионизации – 70 эВ, температура источника – 270°C, сканирование в диапазоне 40–600 Да со скоростью 2 скан/с.

 

Рис. 1. Этапы извлечения масла

 

Для идентификации использовали стандартные образцы индивидуальных соединений и масс-спектральную базу данных NIST’14; в случае отсутствия в ней масс-спектров обнаруженных компонентов установление структуры проводилось на основе характеристичных процессов фрагментации и данных о хроматографических свойствах изучаемых соединений. Для расчета индексов удерживания проводили анализ смеси нормальных углеводородов (С6-С35) в выбранных хроматографических условиях. При определении количественного содержания стеринов и тритерпеновых спиртов в пересчете на внутренний стандарт (холестанол) их коэффициенты ионизации приравнивались.

Пробоподготовка: для выделения неомыляемой фракции 100.0 мг образца помещали в стеклянную виалу объёмом 7.0 мл, добавляли 1.0 мл 2N метанольного раствора KOH и 10.0 мкл раствора внутреннего стандарта (холестанол, 10.0 мг/мл). Затем образцы выдерживали при температуре 80°С в течение часа и после охлаждения реакционной массы добавляли 3 мл воды бидистиллированной. Неомыляемую фракцию экстрагировали тремя порциями по 1.0 мл диэтилового эфира, экстракты объединяли, пропускали через патрон с натрия сульфатом прокаленным, отдували досуха растворитель под током азота и силилировали перед проведением анализа. Для этого к сухому остатку добавляли 300.0 мкл смеси BSTFA: ацетонитрил (1:2) и выдерживали в течение 30 минут при 80°С, затем 1.0 мкл раствора инжектировали в прибор ГХ–МС.

Результаты и обсуждение

Результаты экстракции показали, что исследуемые образцы содержат масло в пределах 15.61–31.27 mass%. (табл. 1), при этом белоплодный образец M. alba более чем в 2 раза превосходил по данному показателю M. nigra (сорт Хартут). Полученные данные сопоставимы с работами других авторов (Gecgel et al., 2011; Rahman et al., 2014).

 

Таблица 1. Суммарное содержание антиоксидантов и масла в образцах семян полиморфного вида Morus alba и Morus nigra (сорт Хартут)

Объект Morus		ССА, мг/г	Содержание масла, %
Morus alba	Белоплодная форма	5.56 ± 0.01	31.3 ± 0.5
	Черноплодная форма	3.03 ± 0.01	22.3 ± 0.4
	Розовоплодная форма	2.59 ± 0.00	27.4 ± 0.5
Morus nigra (сорт Хартут)		4.40 ± 0.01	15.6 ± 0.2

 

Изучение суммарного содержания антиоксидантов семян M. alba и M. nigra выявило накопление антиоксидантов во всех образцах (табл. 1). Особо отличились M. alba (белоплодная форма) – 5.56 мг/г и M. Nigra – 4.40 мг/г. Полученные данные демонстрируют изменчивость содержания антиоксидантов в зависимости от вида и жизненной формы объекта. Следует отметить, что по сравнению с семенами пряно-ароматических и эфиромасличных растений (Исламова и др., 2019) суммарное содержание антиоксидантов у семян Morus выше.

Учитывая идентичные экологические условия роста растений, можно предположить, что разное накопление масел и отличающиеся суммарные содержания антиоксидантов семян видов и разных форм Morus являются генетически закрепленной особенностью.

Жирно-кислотный состав семян полиморфного вида M. alba и M. nigra (сорт Хартут)

В результате изучения состава жирных кислот M. alba, и M. nigra идентифицировано 12 жирных кислот (табл. 2). В исследуемых образцах наибольшее количество приходилось на линолевую (C18:2), пальмитиновую (C16:0), олеиновую (C18:1) и стеариновую (C18:0) кислоты, которые вместе составляют приблизительно 90% от общего количества идентифицированных.

 

Таблица 2. Профили жирных кислот масла семян полиморфного вида Morus alba и Morus nigra (сорт Хартут), %

Жирная кислота	Формы Morus alba			Morus nigra (сорт Хартут)
	Белоплодная	Черноплодная	Розовоплодная
Содержание, %
Насыщенные жирные кислоты
С12:0 Лауриновая	2.91 ± 0.02	1.73 ± 0.10	1.07 ± 0.12	2.41 ± 0.17
С14:0 Миристиновая	0.17 ± 0.01	0.06 ± 0.01	0.05 ± 0.01	0.15 ± 0.03
С16:0 Пальмитиновая	9.67 ± 0.15	8.61 ± 0.11	8.14 ± 0.29	12.18 ± 0.18
С18:0 Стеариновая	4.13 ±0.04	3.44 ± 0.12	3.89 ± 0.10	4.65 ± 0.30
С20:0 Арахиновая	2.00 ± 0.03	0.46 ± 0.06	0.53 ± 0.06	1.13 ± 0.15
С22:0 Бегеновая	0.11 ± 0.01	0.07 ± 0.01	0.05 ± 0.01	0.13 ± 0.02
С24:0 Лигноцериновая	0.05 ±0.01	0.04 ± 0.01	0.07 ± 0.01	0.09 ± 0.01
Мононенасыщенные жирные кислоты
С16:1 Пальмитолеиновая	0.09 ± 0.01	0.08 ± 0.01	0.08 ± 0.01	0.38 ± 0.07
С18:1 Олеиновая	10.29 ± 0.24	5.63 ± 0.42	7.48 ± 0.37	9.17 ± 0.29
С18:1 Вакценовая	1.68 ± 0.06	0.75 ± 0.11	0.08 ± 0.01	0.91 ± 0.12
С20:1 Гондоиновая	1.42 ± 0.22	0.14 ± 0.04	0.13 ± 0.01	0.27 ± 0.07
Полиненасыщенные жирные кислоты
С18:2 Линолевая	67.45 ± 0.72	79.32 ± 0.74	78.46 ± 0.90	68.54 ± 0.41

 

Линолевая – полиненасыщенная незаменимая жирная кислота, содержание в образцах варьировало в пределах 67.45–79.00%. Она физиологически необходима организму человека, способна предотвратить ишемический инсульт, ожирение, атеросклероз, хронические воспалительные и онкологические заболевания и ряд других острых заболеваний (Iso et al., 2002; Evstatieva et al., 2010). Обладает огромным биологическим потенциалом и антиоксидантным действием.

Пальмитиновая кислота (C16:0) (9.70–12.18%) – важный компонент мембранных, секреторных и транспортных липидов (Carta et al., 2015). Олеиновая кислота (C18:1) (9.17–10.29%) устойчива к окислительному стрессу, играет активную роль во многих процессах организма (Carrillo et al., 2012). Стеариновая кислота (С18:0) (4.13–4.65%) обладает протромботическим действием, стабилизирует уровень холестерина липопротеинов низкой плотности (Kelly et al., 2001). В своих работах авторы (Guil-Guerrero, 2001; Sanchez-Salcedo et al., 2016) сообщают, что жирные кислоты – линолевая, пальмитиновая, олеиновая и стеариновая – являлись основными в масле семян двух видов M. alba и M. nigra, как и в нашем исследовании. В суммарном содержании от общего количества необходимых жирных кислот образец масла M. alba (белоплодная) составил около 75%. Но стоит отметить, что в количественном отношении наблюдались внутривидовые отличия у M. alba между генотипами (белоплодная, розовоплодная, черноплодная). Также наблюдались и видовые отличия между M. alba и M. nigra в суммарном содержании в пользу M. alba.

Состав фитостеринов масла семян полиморфного вида M. аlba и M. nigra (сорт Хартут)

В результате изучения фитостеринового состава неомыляемой части липидов семян M. аlba и M. nigra обнаружено 15 различных фитостеринов (табл. 3). В исследуемых образцах масла компоненты β-Ситостерина, (3β)-Lup-20(29)-ene-3,28-diol, кампестерина, стигмастерина, циклоартенола, ситостанола (в образце масла M. nigra отсутствует), 24-метиленциклоартанола, цитростадиенола, Δ7-Авенастерина, холестерина в сумме составляли около 95% от общего количества идентифицированных веществ. β-Ситостерин во всех образцах масла является преобладающим, что придает особую значимость маслу. Исследователи констатируют, что β-Ситостерин способен снижать уровень холестерина, обладает антиоксидантными свойствами, а также противораковым, антиатеросклерозным, противовоспалительным действием (Weng, Wang, 2000). Свойствам β-Ситостерина нейтрализовать свободные радикалы уделяется большое внимание в медицинских исследованиях, направленных на поиск методов профилактики различных болезней. Стоит отметить, что во всех образцах масла обнаружен холестерин. Известно, что холестерин рассматривается как нежелательный стерин для организма, особенно людям, страдающим сердечно-сосудистыми заболеваниями. Но его содержание в небольших количествах необходимо, так как является важным соединением в биосинтезе растительных стероидов и при метаболизме он производит сапонины (органические соединения растительного происхождения). Сапонины в свою очередь оказывают существенное влияние в устойчивости растений к болезням (Brown, Galea, 2010; Li et al., 2022).

 

Таблица 3. Стериновый состав масла семян полиморфного вида Morus alba и Morus nigra (сорт Хартут)

Фитостерины	Формы Morus alba			Morus nigra (сорт Хартут)
	Белоплодная	Черноплодная	Розовоплодная
	Содержание, мг/100 г
Холестерин	29.1 ± 0.6	11.4 ± 1.1	6.3 ± 0.4	13.2 ± 1.0
Кампестерин	27.2 ± 0.3	32.7 ± 1.8	36.2 ± 0.8	15.3 ± 1.0
Стигмастерин	32.6 ± 1.9	27.1 ± 1.5	10.5 ± 0.6	11.6 ± 1.0
Клеростерин	3.1 ± 0.1	4.0 ± 0.2	4.7 ± 0.5	3.2 ± 0.4
β-Ситостерин	243.3 ± 7.8	382.1 ± 6.3	333.4 ± 2.7	243.9 ± 4.9
Ланостерин	12.9 ± 0.9	18.2 ± 0.9	15.1 ± 0.3	9.3 ± 0.7
Ситостанол	50.3 ± 2.0	63.9 ± 1.7	45.9 ± 1.0	0.0
Δ7-Авенастерин	7.1 ± 0.3	21.7 ± 0.8	9.9 ± 0.2	13.0 ± 0.9
Циклоартенол	35.5 ± 3.2	39.9 ± 2.3	33.3 ± 1.6	42.6 ± 1.4
(3β)-stigmasta-7,24(28)-dien-3-ol	8.4 ± 0.6	4.3 ± 0.4	1.9 ± 0.4	5.9 ± 0.7
γ-Ситостенон	6.3 ± 0.7	0.0	0.0	0.0
24-Метиленциклоартанол	30.6 ± 2.3	37.6 ± 1.4	37.2 ± 1.7	36.6 ± 1.0
Цитростадиенол	20.4 ± 1.8	51.3 ± 1.1	41.8 ± 2.0	39.1 ± 0.9
Unidentified compound (MM = 426 Da)	1.8 ± 0.2	2.7 ± 0.3	0.8 ± 0.1	2.4 ± 0.4
(3β)-Lup-20(29)-ene-3,28-diol	99.2 ± 3.3	20.9 ± 1.9	18.2 ± 1.1	11.6 ± 0.8
Всего	607.8 ± 26.3	717.8 ± 21.3	595.2 ± 13.5	476.2 ± 15.3

 

***

Исследования показали, что качественный состав жирных кислот масла Morus был идентичен для всех образцов, но наблюдались незначительные отличия в количественном составе. Однако была выявлена межвидовая и внутривидовая изменчивость семян Morus по суммарному содержанию антиоксидантов, где высокие показатели продемонстрировал M. alba (белоплодная форма). Кроме того, все формы Morus albа (белоплодная, черноплодная и розовоплодная) отличались как высоким содержанием масла, так и суммарным содержанием фитостеринов. На основании полученных данных следует, что семена шелковицы – вторичное сырье, образующееся при переработке плодов шелковицы, – представляют собой дополнительный природный источник антиоксидантов.

Благодарности

Публикация выполнена при поддержке Программы стратегического академического лидерства РУДН (This paper has been supported by the RUDN University Strategic Academic Leadership Program).

Конфликт интересов

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

Ф. И. Исламова

Горный ботанический сад, ДФИЦ РАН

Email: chemfarm@mail.ru
Россия, ул. М. Ярагского, 75, г. Махачкала, Республика Дагестан, 367000

Г. К. Раджабов

Горный ботанический сад, ДФИЦ РАН

Email: chemfarm@mail.ru
Россия, ул. М. Ярагского, 75, г. Махачкала, Республика Дагестан, 367000

С. В. Горяинов

ФГАОУ ВО “Российский университет дружбы народов”

Email: chemfarm@mail.ru
Россия, ул. Миклухо-Маклая, 6, Москва, 117198

Ф. Хажжар

ФГАОУ ВО “Российский университет дружбы народов”

Email: chemfarm@mail.ru
Россия, ул. Миклухо-Маклая, 6, Москва, 117198

А. М. Алиев

Горный ботанический сад, ДФИЦ РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: chemfarm@mail.ru
Россия, ул. М. Ярагского, 75, г. Махачкала, Республика Дагестан, 367000

Список литературы

Дополнительные файлы