Effect of some metabiotics from strains of the genus Enterococcus on the growth of pathogenic bacteria that cause pneumonia

Full Text

В последние годы резистентность патогенных бактерий желудочно-кишечного тракта к антибиотикам рассматривается как серьезная проблема в связи с широким использованием традиционных антибиотиков при лечении заболеваний человека и животных.

Исследования последних лет по поиску новых антибиотиков привели к одной из самых многообещающих новых концепций – использованию метабиотиков (пептидов, полисахаридов) в качестве антимикробных агентов. Противомикробные препараты, которые представляют собой встречающиеся в природе пептиды (белковоподобные вещества), обладают бактерицидным (убийцы клеток) или бактериостатическим (ингибиторы роста бактерий) действием. Различные исследователи показали, что молочнокислые бактерии (МКБ) обладают большим потенциалом для синтеза экзополисахаридов (ЭПС). ЭПС, производимые МКБ, привлекают все больше внимания, главным образом из-за их преимуществ для здоровья, таких как иммунная стимуляция, антимутагенность, повышенное содержание антиоксидантов и противоопухолевая активность. Некоторые из них способствуют селективному росту молочнокислых бактерий и бифидобактерий, тем самым играя роль в микробиоте и иммунной системе хозяина (Dertli et al., 2016; Jurášková. et al., 2022).

Показано, что штаммы молочнокислых бактерий, выделенные из молока различных домашних животных Республики Армения и Республики Арцах, имеют разную видовую и родовую принадлежность, а также разные физиологические, антибактериальные и пробиотические свойства (Bokulich et al., 2015; Israyelyan et al., 2016). Проведенные исследования показали, что выделенные и изученные МКБ из южных районов Кавказа в основном представлены бактериями рода Enterococcus (Bokulich et al., 2015).

Белоксодержащие фракции с антимикробной активностью (АМП) были получены методом гель-фильтрации супернатанта культуральной жидкости (КЖ) штаммов рода Enterococcus, выделенных из ферментированного молока. Исследования отдельных МКБ из ферментированного молока различных домашних животных (коров, овец, буйволиц, ослиц и коз) показали, что пробиотические бактерии, выделенные из молока ослиц, обладают высокой устойчивостью к антибиотикам (Israyelyan, 2018). Показано, что антимикробная активность штаммов рода Enterococcus обусловлена синтезом белковоподобных веществ и зависит от времени, температуры и состава питательной среды. Наибольшая антимикробная активность исследуемых штаммов проявляется при температуре выращивания 42℃ (Israyelyan et al., 2015).

Целью данной работы явилось изучение выделенных штаммов МКБ рода Enterococcus с пробиотическими свойствами, синтезирующих разные метаболиты, на способность подавлять рост некоторых патогенных бактерий, вызывающих пневмонию.

Материалы и методы

Микробные штаммы и питательные среды

В лаборатории технологии получения пробиотиков научно-производственного центра «Армбиотехнология» НАН РА из образцов молока ослиц, отобранных в стерильных условиях из домашних хозяйств различных высокогорных районов Республики Армения и Арцаха, были выделены штаммы молочнокислых бактерий. Все штаммы депонированы в Центре микробного депозитария (МDC) НПЦ “Армбиотехнология” НАН. Штаммы МКБ выращивали на агаре и бульоне MRS Merck (Германия), ISO (Италия), HiMedia (Индия). Штаммы МКБ хранятся в замороженном виде при –20℃ в бульоне MRS, содержащем 40% глицерина. Штаммы идентифицированы с помощью API-теста, секвенирования 16S РНК и RAPD PCR.

Приготовление инокулята и получение супернатанта культуральной жидкости

Единичные колонии выращивали в 5 мл бульона MRS (37℃, 48 ч), после чего переносили в колбу Эрленмейера на 100 мл, содержащую 50 мл бульона MRS, и инкубировали при 37℃ в течение 48 ч в термостате. По окончании роста культуры бульон центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин и полученный супернатант концентрировали в 5 раз. Антимикробные препараты получали из супернатанта культуральной жидкости после культивирования исследуемых штаммов методом ионообменной хроматографии (Aghajanyan et al., 2015).

Определение антимикробной активности

Антимикробную активность полученных препаратов определяли согласно описанному методу (Parente et al., 1995). Антибиотикорезистентность патогенных штаммов, выделенных от больных пациентов, определяли в Институте эпидемиологии, микробиологии и паразитологии МЗ РА и в Степанакертском центре гигиены и эпидемиологии. Для определения резистентности выделенных возбудителей к антибиотикам применяли метод со стандартными дисками антибиотиков (Oxoid, Великобритания) (Bauer et al., 1966).

Выделение белковоподобных фракций с антимикробными свойствами супернатанта КЖ осуществляли методом гель-фильтрации. Для выделения полисахаридов был использован метод, описанный (Dertli et al., 2016).

Статистический анализ

Использовались приложения Microsoft Office Excel 2010. Уровень статистической значимости был установлен на уровне p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Исследовали антимикробную активность АМП различных штаммов рода Еnterococcus в отношении антибиотикорезистентных бактерий. На рис. 1 показана антимикробная активность белоксодержащих фракций после гель-фильтрации супернатанта КЖ штамма Ent. faecium КЕ-5 против St. pneumonia.

 

Рис. 1. Антимикробная активность белоксодержащих фракций, полученных после очистки супернатанта КЖ штамма Ent. faecium КЕ-5 методом гель-фильтрации против St. pneumonia

 

Как видно из приведенных данных (табл. 1), эффективность ингибирования роста патогенных бактерий с помощью АМП разных штаммов Enterococcus, выделенных из ферментированного молока разных домашних животных, различается в зависимости от источника выделения МКБ. Наибольшая антимикробная активность (100%) в отношении штаммов Klebsiella pneumonia возникает при использовании АМП, полученных из КЖ после выращивания штаммов Enterococcus, выделенных из ферментированного козьего молока и молока ослиц, а наименьшая активность АМП – из КЖ ферментированного коровьего молока (20–50%).

 

Таблица 1. Сравнительная антимикробная активность АМП из различных штаммов рода Еnterococcus против антибиотикорезистентных бактерий (%)

Устойчивые к антибиотикам штаммы	N	Источник выделения МКБ из молока разных домашних животных										антибиотики N = 13
		корова				коза		ослица	буйволица	овца
		Ent. faecium M22	Ent. durans M42	Ent. durans M44	Ent. durans P13	Ent. faecium KAP-1	Ent. faecium KA 3	Ent. faecium AE 225-9	Ent. durans AG 76	Ent. faecalis AV 222	Ent. faecium KV 15-1
Staph. aureus	28	0.0	0.0	0.0	25.0	50.0	50.0	0.0	50.0	50.0	0.0	75.0
Ps. aeruginosa	21	50.0	0.0	50.0	58.0	100.0	100.0	100.0	50.0	50.0	50.0	60.0
Pr. mirabilis	23	50.0	20.0	50.0	29.0	50.0	100.0	100.0	0.0	0.0	50.0	85.0
Kl. pneumonia	8	0.0	50.0	0.0	0.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	83.0
Pr. vulgaris	7	0.0	0.0	0.0	0.0	33.0	66.0	66.0	33.0	33.0	66.0	66.0
E. coli	15	50.0	40.0	50.0	15.0	100.0	100.0	33.0	33.0	33.0	33.0	55.0

Примечание. АМП – антимикробные препараты, полученные после гель-фильтрации КЖ.

 

При выращивании штаммов (N = 19), выделенных из ферментированного молока ослиц, в питательной среде МRS были отобраны штаммы с антимикробной активностью и выделены полисахариды. Используемый метод ВЭЖХ показал, что выделенные полисахариды штаммов Ent. faecium KE-5, Ent. durans KE-6, Ent. faecium KE-9 с антимикробной активностью состоят из молекул глюкозы и галактозы. Следует отметить, что не все полисахариды обладали способностью подавлять рост патогенных бактерий.

Полисахарид, выделенный из концентрата КЖ после выращивания штамма Ent. faecium КЕ-5, обладал высокой антимикробной активностью в отличие от других исследованных полисахаридов. Следует отметить, что снижение концентрации водного раствора полисахарида ниже 10% приводило к снижению антимикробной активности.

На рис. 2 представлены результаты подавления роста патогенных штаммов, выделенных из инфицированного глаза, полученным полисахаридом из КЖ штамма Ent. faecium КЕ-5, путем нанесения 20 мкл его 10–20%-го водного раствора на поверхность исследуемых патогенных бактерий на чашках Петри.

 

Рис. 2. Действие антимикробных препаратов в отношении штаммов, выделенных из инфицированных глаз, ∅ мм

 

Как видно из данных (рис. 2) 10%-й водный раствор полисахаридов штамма Ent. faecium КЕ-5 ингибировал рост только двух штаммов патогенных бактерий Kl. pneumonia f1 1231 и St. pneumonia f1 400. Антимикробный препарат (АМП) и супернатант КЖ, содержащий разные метаболиты (белковоподобные фракции, полисахариды и органические кислоты), с разной эффективностью подавляют рост двух патогенных штаммов.

Эффективность использования препаратов, содержащих полисахарид, можно сравнить с 12 антибиотиками, ингибирующими рост используемых патогенных бактерий (рис. 3). Как видно из приведенных данных, используемые антибиотики (метод дисков) также с разной эффективностью подавляли рост используемых штаммов патогенных бактерий, выделенных из инфицированного глаза.

 

Рис. 3. Действие антибиотиков на штаммы, выделенные из инфицированных глаз, ∅ мм

 

На рис. 4 представлены результаты ингибирования роста патогенных штаммов – возбудителей пневмонии, выделенных из мокроты зева больного при использовании полисахаридов и АМП. Ингибирование роста бактерий St. pneumonia было более эффективным, чем роста бактерий Kl. pneumonia. Используемые полисахариды ингибировали рост патогенных бактерий с той же эффективностью, что и некоторые антибиотики (рис. 5).

 

Рис. 4. Влияние противомикробных препаратов на рост бактерий, выделенных из зева, ∅ мм

 

Рис. 5. Влияние антибиотиков на рост выделенных бактерий из зева, ∅ мм

 

Сравнительная характеристика ингибирования роста изученных патогенных штаммов Kl. pneumonia и St. Pneumonia приведена в табл. 2.

 

Таблица 2. Сравнительная характеристика ингибирования роста штаммов Kl. pneumonia и St. pneumonia

Патогенные бактерии	N	Штамм	Полисахариды, %	%
				У	П	Ч
Kl. pneumonia	9	Ent. faecium KE5	10	92.3	7.7	0
St. pneumonia	7	Ent. faecium KE5	20	68.4	10.5	21.1
St. pneumonia	5	Ent. sp. KE13	20	0	0	100
		Ent. sp. KE14	20	33.33	66.67	0

Примечание. У – устойчивый, П – промежуточный, Ч – чувствительный

 

Как видно из приведенных данных, полисахариды (10%-й водный раствор), выделенные из КЖ разных штаммов, полученные из ферментированного молока ослиц, обладают разной антимикробной активностью против резистентных вариантов патогенных бактерий.

Таким образом, некоторые штаммы рода Enterococcus с пробиотическими свойствами, выделенные из молока ослиц, синтезируют белковоподобные вещества и полисахариды, состоящие из глюкозы и галактозы, и обладают разной антимикробной активностью в отношении исследуемых возбудителей пневмонии. Можно предположить, что высокая антимикробная активность штаммов может быть результатом суммарного действия продуктов метаболизма (полисахариды и белковоподобные вещества), образующихся при культивировании штамма Ent. faecium КЕ-5.

Ранее нами было показано, что очищенные пептиды из пробиотического штамма Lactobacillus rhamnosus BTK 2012 (BCN 1–1470 Dа и BCN 2–670 Dа) и Lactobacillus acidophilus 1991 (BCN-1100 Dа) проявляют антимикробную активность в отношении грамотрицательных и грамположительных возбудителей, таких как Salmonella sp., Escherichi coli, Proteus mirabilis, Pasteurella sp., Clostridium sp., Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Shigella sp., а также ряда устойчивых к антибиотикам возбудителей. Эффективность различалась в зависимости от вида возбудителя, а также источника выделения (кровь, фекалии, моча и др.) (Tkhruni et al., 2013, 2015). Влияние белка-бактериоцина (BCN 2–670 Да) КЖ L. rhamnosus BTK 2012 на рост полирезистентных патогенных бактерий, выделенных от инфицированных пациентов (различные источники, такие как кровь, фекалии, слюна и моча), представлено на рис. 6.

 

Рис. 6. Антимикробная активность BCN 2 (бактериоцин) в отношении некоторых патогенных бактерий человека

 

Сравнивая результаты действия полученных полисахаридов на рост бактерий Klebsiella sp., видно, что разница в эффективности зависит от источника выделения возбудителей. Полученные данные согласуются с опубликованными данными ряда авторов(Yermolenko et al., 2006; Karapetyan et al., 2017). Различная эффективность ингибирования роста патогенных бактерий также может быть связана с различными механизмами действия веществ на клеточные мембраны разных патогенных бактерий.

Выводы

Таким образом, очевидна перспективность использования некоторых метабиотиков (белковоподобных веществ, полисахаридов), полученных из пробиотического штамма рода Enterococcus против некоторых патогенных штаммов-возбудителей пневмонии. Эти метабиотики могут использоваться для длительного применения против устойчивых к антибиотикам патогенов различной этиологии для профилактики или лечения инфекционных заболеваний. Работы в данном направлении продолжаются.

Финансирование

Работа выполнена при поддержке исследовательского гранта Государственного комитета науки РА по проекту “23T/AA-002”.

Соблюдение этических норм

Эта работа не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

А. Israyelyan

Artsakh Scientific Center State Non-Commercial Organization

Author for correspondence.
Email: arevik_israelyan@mail.ru
Azerbaijan, Tigran Mets 26, Stepanakert, 2600

Ts. Balabekyan

Scientific and Production Center Armbiotechnology NSPO, National Academy of Science

Email: arevik_israelyan@mail.ru
Armenia, Gyurjyan 14, Yerevan, 0056

Z. Sargsyan

Center for Epidemiology and Hygiene

Email: arevik_israelyan@mail.ru
Azerbaijan, Ar. Arakelyan 14, Stepanakert, 2600

F. Tkhruni

Scientific and Production Center Armbiotechnology NSPO, National Academy of Science

Email: arevik_israelyan@mail.ru
Armenia, Gyurjyan 14, Yerevan, 0056

References

Supplementary files