Lipid-correcting and antioxidant effects of the lipid complex from the red marine algae Ahnfeltia tobuchiensis under the conditions of a high-fat diet

Texto integral

Рацион современного человека характеризуется избыточным потреблением животного жира с высоким содержанием холестерина (ХС), что способствует развитию дислипидемии с последствиями в форме ожирения (Öngün Yılmaz, 2018). Обусловленные этим патологии, такие как ишемическая болезнь сердца, инсульт, гипертония, неалкогольный стеатогепатит и цирроз печени, стали серьезной социально-экономической проблемой.

Основными средствами, применяемыми для решения данной проблемы, являются синтетические липид-снижающие препараты – статины. Кроме этого, известны препараты, относящиеся к группе веществ, препятствующих реабсорбции желчных кислот, фактора регулирования гомеостаза плазменного ХС. Также для коррекции липидного обмена, и, в частности, для снижения уровня триацилглицеринов (ТАГ) и повышения концентрации липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), применяются фибраты. Основным недостатком перечисленных медикаментозных гиполипидемических средств является их высокая стоимость и наличие в ряде случаев противопоказаний. При их длительном применении, особенно в больших дозах, они способны вызывать ряд достаточно серьезных неблагоприятных побочных эффектов (Дядык и др., 2018). В связи с этим актуальным представляется поиск альтернативных средств природного происхождения, лишенных перечисленных недостатков. Перспективными в этом отношении являются биологически активные комплексы из морского сырья, которые стали предметом исследований в области борьбы с ожирением и сопутствующих дислипидемии заболеваний. К таковым относятся липидные комплексы из морских гидробионтов, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) семейства n-3.

Экспериментальные исследования показали, что добавление n-3 в диету играет значимую роль в предотвращении атеросклероза (Torres et al., 2015). При этом в отличие от статинов n-3 ПНЖК способны влиять на ряд ключевых клеточных процессов, связанных с развитием атеросклероза, включая снижение интенсивности миграции моноцитов и их адгезию на эндотелиальных клетках, ингибирование процесса поглощения макрофагами модифицированных липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и подавление миграции гладкомышечных клеток, изменяя соотношение n-6/n-3 жирных кислот в фосфолипидах мембран в сторону его снижения (Ramji, 2019). Указанные свойства позволяют использовать комплексы морских гидробионтов, богатых n-3 ПНЖК, для профилактики и лечения дислипидемий разного характера. Высокий интерес в этом плане представляют бентосные формы гидробионтов, а именно различные виды морских водорослей, которые являются первичными продуцентами n-3 ПНЖК в пищевой цепи морских организмов (Mišurcová et al., 2011). Липидные комплексы, выделенные из ряда водорослей, в значительных количествах содержат эссенциальные фосфолипиды (ФЛ) и гликолипиды (ГЛ), богатые ПНЖК (Susanto et al., 2019). При этом некоторые препараты, такие как комплекс липидов из микроводоросли вида Schizochytrium, оказывают ингибирующее действие на ГМГ-КоА-редуктазу, снижая уровень биосинтеза холестерина (Chen et al., 2011). Липидкоррегирующее действие липидного экстракта Schizochytrium по своей эффективности снижать уровень ТАГ и ХС было не менее эффективным, чем выделенного из рыб (Komprda et al., 2015).

Было показано, что на ранней стадии и для профилактики сердечно-сосудистых патологий эффективно применение докозагексаеновой (ДГК) кислоты для увеличения холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП) (Bernstein et al., 2012). Опубликованы экспериментальные исследования, в которых изучалось гиполипидемическое действие липидных экстрактов из бурой водоросли Sargassum pallidum, зеленой водоросли Ulva fenestrata и морской травы Zosterа marina в условиях экспериментальной гиперлипидемии, вызванной однократным введением Тритона-1339 (Кривошапко и др., 2012). Также липидкоррегирущим свойством обладает липидный экстракт, полученный методом спиртовой экстракции измельченной сухой бурой водоросли ламинарии японской (Laminaria japonica) (Кушнерова, 2018). К таким средствам следует отнести и липидный комплекс из таллома морской красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis (ЛКА). Известно, что морские красные водоросли характеризуются высоким содержанием эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) (Хотимченко, 2004), которая является ключевым компонентом комплексов морских n-3 ПНЖК. ЭПК выступает одним из основных носителей биологических эффектов n-3 кислот, обусловливающих их эффективность при коррекции нарушений липидного обмена. Это предполагает высокую фармакологическую активность липидов красных водорослей, и в частности их липидкоррегирующее действие.

Химический состав ЛКА был нами описан ранее (Фоменко и др., 2019). Жирнокислотный состав ЛКА содержит высокий процент эйкозапентаеновой (20.20%) и арахидоновой (26.24%) кислот, что является характерной отличительной особенностью красных водорослей (Хотимченко, 2004). Необходимо отметить заметное содержание мононенасыщенных жирных кислот (МНЖК) семейства n-9 – олеиновой и пальмитолеиновой кислот (22.6%), которые играют важную роль в нормализации липидного обмена (Johnson, Bradford, 2014). Соотношение арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот, или n-6/n-3, в ЛКА составляло 1.3, что, как показывают данные литературы, является важным показателем, отражающим липидкоррегирующий потенциал липидного комплекса и при величине данного коэффициента меньше 4 можно говорить об эффективности применения их для нормализации показателей липидного обмена и предотвращения развития сердечно-сосудистых патологий (Liu et al., 2016). При этом данные о красных водорослях как об источнике липидов с липидкоррегирующими свойствами, в частности относящихся к роду Ahnfeltia, весьма ограничены. Таким образом, представляется актуальным расширение знаний о биологической активности липидной фракции промысловой морской красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis (Kanno et Matsubara) Makienko, распространенной в морях Дальнего Востока (Подкорытова и др., 2019), которая ранее не исследовалась в данном аспекте.

Целью настоящей работы явилось изучение липидкоррегирующих свойств комплекса липидов, выделенного из таллома морской красной водоросли A. tobuchiensis (Kanno et Matsubara) Makienko в условиях гиперхолестеринового рациона с жировой нагрузкой.

Материалы и методы

Образцы водоросли A. tobuchiensis собирали в августе – сентябре 2021 г. в заливе Петра Великого Японского моря (пролив Старка, о. Попова). Выборка водорослей составляла 100 талломов. Слоевища после сбора на базе лаборатории станции МЭС «о. Попова» очищали от эпифитов и донного бентоса, промывали сначала морской, затем дистиллированной водой. После этого сырье отжимали и транспортировали в лабораторию. Далее водоросли погружали в кипящую воду на 2 мин для инактивации ферментов. Затем водоросли сушили до остаточной влажности ~40% и помещали в морозильную камеру (–80°C) на 2 часа для повышения хрупкости, после чего измельчали с помощью лабораторной мельницы до размеров частиц ~1 мм. Липиды экстрагировали методом Блайя и Даера (Bligh, Dyer, 1959). Один килограмм измельченной водоросли экстрагировали 1.5 л смеси хлороформ: этанол (1:2), тщательно перемешивали и оставляли на 2 часа, далее добавляли 0.5 л хлороформа и после тщательного перемешивания добавляли 0.5 л воды. Далее экстракт отделяли и отстаивали для разделения фаз. Нижнюю фазу, содержащую липиды, упаривали на роторном испарителе (Type 349/2, Unipan, Poland) (Т < 37°C) до отсутствия запаха хлороформа. Полученный липидный экстракт представлял собой маслообразную массу зелено-коричневого цвета. Выход липидов составил 2.2% от массы водоросли в пересчете на суховоздушное сырье. Содержание общих липидов определяли весовым методом.

Стандартизацию липидного комплекса A. tobuchiensis проводили по сумме метаболически активных фракций (сумма ГЛ и ФЛ), являющихся основным источником ПНЖК, которая составила 55% (8.6 мг/г сухой ткани). Острую токсичность ЛКА определяли по методу Кербера (Фисенко, 2000), которая составила более 2000 мг/кг, что позволяет отнести полученную субстанцию к 4 классу токсичности (малоопасные).

Эксперимент проводили на беспородных белых крысах-самцах массой тела 146 ± 3 г, полученных из питомника филиала “Столбовая” ФГБУН “Научный центр биомедицинских технологий” ФМБА России. Исследования на животных выполнены в соответствии с приказом Минздравсоцразвития России от 01.04.2016 № 199н “Об утверждении Правил лабораторной практики” и требованиями ГОСТ Р 53434–2009 “Принципы надлежащей лабораторной практики”. Животные были адаптированы в виварии в течение 7 суток до начала эксперимента. Во время этого периода осуществляли ежедневный осмотр внешнего состояния крыс. В эксперимент были взяты животные без признаков отклонений в состоянии здоровья. Животных содержали по 1 особи в индивидуальных пластиковых клетках на подстилке из опилок при 20–22°C и режиме освещения 12/12 ч. Животные получали питьевую воду без ограничений и корм ежедневно в одно и то же время в режиме свободного доступа. После адаптации крыс произвольно распределяли на интактных (контроль), потреблявших на протяжении всего эксперимента стандартный общевиварный рацион, и крыс, у которых моделировали алиментарную дислипидемию. Развитие алиментарной дислипидемии осуществляли кормлением животных высокожировой диетой (ВЖД) в течение 30 суток, состоящей из базового стандартного рациона с добавлением 2% ХС и 20% говяжьего сала от общего состава рациона (Рыженков и др., 2012). Опытной группе крыс в ВЖД добавляли ЛКА в дозе 1 г/кг массы животного в пересчете на общие липиды (Новгородцева и др., 2010), что соответствовало 0.6 г/кг метаболически активной фракции.

В качестве препарата сравнения использовали коммерческий комплекс “Супер Омега 3-6-9” (далее – Омега), содержащий смесь насыщенных (20%), мононенасыщенных (20%) и полиненасыщенных (60%) жиров, включающих комплекс ПНЖК семейств n-3 (6% ЭПК (n-3), 3% ДГК (n-3), 8% гамма-линоленовой (n-6) (ГЛК) кислот) и МНЖК семейства n-9 (3% олеиновой (n-9) кислоты). Животным в группе сравнения в диету вводили комплекс Омега в дозе 1 г/кг массы тела, что соответствует 0.6 г/кг этиловых эфиров ПНЖК и сопоставимо с дозой метаболически активной фракции ЛКА. Выбор в качестве препарата сравнения липидного комплекса “Супер Омега-3-6-9” связан со сходным набором семейств n-6 и n-3 ПНЖК и n-9 МНЖК, что и в исследуемом ЛКА, и, соответственно, предполагаемым механизмом действия.

Животные были разделены на следующие группы по 10 крыс в каждой: 1 группа – контроль (интактные, стандартный базовый рацион), 2 группа – ВЖД, 3 группа – ВЖД + ЛКА, 4 группа – ВЖД + + Омега. Животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом с соблюдением “Правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях” (Страсбург, 1986). Протокол эксперимента был одобрен Комиссией по вопросам этики Тихоокеанского океанологического института им. В. И. Ильичева ДВО РАН (протокол № 16 от 15.04.2021 г.).

Оценку эффективности исследованных препаратов проводили по их влиянию на весовые характеристики (массу тела, массу печени) и биохимические показатели печени и плазмы крови. В плазме крови определяли уровень ХС, ХС-ЛПНП, ХС-ЛПВП и ТАГ, используя биохимические наборы реактивов компании «Ольвекс Диагностикум» (Россия). Экстракты общих липидов из плазмы крови и ткани печени готовили по методу Фольча (Folch et al., 1957).

Анализ состава нейтральных липидов (НЛ) печени проводили методом микротонкослойной хроматографии (ТСХ) на стеклянных пластинках 6 × 6 см с силикагелем марки “КСК”. Суспензию силикагеля и пластинки готовили по методу (Svetashev, Vaskovsky, 1972). Фракционное разделение НЛ осуществляли методом Амента (Amenta, 1964). Использовали системы растворителей гексан: серный эфир: уксусная кислота в соотношении 90:10:1 об/об. Идентификацию пятен НЛ (холестерина, свободных жирных кислот, триацилглицеринов) на ТСХ проводили с помощью очищенных препаратов отечественного производства (Реахим, Россия). Содержание отдельных фракций выражали в процентах от общей суммы НЛ.

Состояние антиоксидантной системы оценивали по уровню антирадикальной активности (АРА) плазмы крови в отношении алкил-пероксильных радикалов (Bartosz et al., 1998), уровню малонового диальдегида (МДА) (Buege, Aust, 1978), ферментов глутатионового звена – глутатионредуктазы (ГР) (Goldberg, Spooner, 1983) и глутатионпероксидазы (ГП) (Burk et al., 1980) в плазме крови, а также по уровню восстановленного глутатиона (Г-SH) (Карпищенко, 2013) и активности супероксиддисмутазы (СОД) (Paoletti et al., 1986) в печени. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда (Bradford, 1976).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Instat 3.0 (Graph Pad Software Inc. USA, 2005), включающего функцию проверки соответствия выборки закону нормального распределения. Для определения статистической значимости различий для межгрупповых сравнений в зависимости от параметров распределения использовали параметрический t-тест множественных сравнений Даннета или непараметрический U-критерий Манна – Уитни, а также t-критерий Стьюдента.

Результаты исследования

Длительное употребление пищи с высоким содержанием жиров (высокожировая диета) вызвало развитие у крыс алиментарной дислипидемии, которая характеризовалась высоким уровнем ТАГ, ХС, ХС-ЛПНП и низким уровнем ХС-ЛПВП. Для проведения исследований с целью оценки липидкоррегирующего действия различных препаратов широко используется модель ВЖД, которая вызывает устойчивую дислипидемию и развитие ожирения (Sirichaiwetchakoon et al., 2020). ВЖД в течение 30 дней сопровождалась увеличением массы животных на 29% (р < 0.001), что составляло 185 ± 4 г по сравнению с 143 ± 3 г в контроле при одновременном увеличении удельной массы печени на 72% (7.39 ± 0.32 г/100 г массы тела против 4.30 ± 0.12 г/100 г массы тела в контроле; р < 0.001). При визуальном контроле в печени отмечалась сплошная зернистость жировых включений, то есть сформировался выраженный жировой гепатоз.

Биохимические показатели липидного обмена в плазме крови у экспериментальных животных в условиях ВЖД свидетельствовали о развитии выраженной дислипидемии. Так, количество общих липидов в плазме крови увеличилось на 36% (р < 0.001), что составляло 6.21 ± 0.19 против 4,56 ± 0,21 г/л у контрольных животных. Отмечали повышение уровня ХС на 55% (p < 0.05), значение ТАГ возросло более чем в 2.5 раза (p < 0.05), изменилось также и количественное соотношение фракций липопротеинов (рис. 1). Уровень атерогенного ХС-ЛПНП увеличился на 16% (р < 0.05), тогда как величина ХС-ЛПВП снизилась на 14% (p < 0.05). В результате расчетный коэффициент атерогенности у животных 2-й группы был выше контрольного показателя в 2.4 раза (3.2 против 1.34 в контроле).

 

Рис. 1. Содержание фракций липидов (ммоль/л) в плазме крови крыс в условиях высокожировой диеты (ВЖД) при введении липидного комплекса из A. tobuchiensis и препарата Омега. Различия достоверны (p < 0.05) по сравнению с контролем – *, с группой ВЖД – ^#, с группой ВЖД + анфельция – ⁺

 

Исследование показателей липидного обмена в печени крыс в условиях применения ВЖД выявило значительные отклонения в содержании фракций НЛ (рис. 2). Уровень ТАГ достоверно повысился на 16% (р < 0.05), ХС – на 28% (р < 0.05), а свободных жирных кислот (СЖК) – на 19% (р < 0.05) по сравнению с контролем. Отмечалось снижение на 21% (p < 0.05) содержания эфиров холестерина (ЭХС), которые являются одним из составных комопонентов при сборке липопротеинов в печени.

 

Рис. 2. Содержание фракций нейтральных липидов (% от суммы фракций) в печени крыс в условиях высокожировой диеты (ВЖД) при введении липидного комплекса из A. tobuchiensis и препарата Омега. Различия достоверны (p < 0.05) по сравнению с контролем – *, с группой ВЖД – ^#, с группой ВЖД + Анфельция – ⁺

 

Анализ состояния антиоксидантной защиты организма (АОЗ) в условиях ВЖД выявил накопление в крови вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Уровень МДА повысился в 2 раза (p < 0.001) при одновременном снижении АРА плазмы крови на 16% (p < 0.05) (табл. 1).

 

Таблица 1. Показатели антиоксидантной системы в плазме крови и печени крыс при введении липидного комплекса из A. tobuchiensis и препарата Омега в условиях высокожировой диеты (ВЖД) (М ± m)

Показатели	1 группа контроль	2 группа ВЖД	3 группа ВЖД + анфельция	4 группа ВЖД + “Омега 3-6-9”
Малоновыйдиальдегид (нмоль/мл) плазмы	3.48 ± 0.03	6.91 ± 0.093	4.38 ± 0.033, в	4.65 ± 0.0733, в, ***
Антирадикальная активность (мкмоль/мл плазмы)	0.260 ± 0.015	0.219 ±0.0081	0.277 ±0.010в	0.245 ±0.007а, *
Супероксиддисмутаза (ед. активности/мг белка)	659 ± 25	312 ± 143	642 ±26в	619 ±16в
Восстановленный глутатион (мкмоль/г печени)	6.24 ±0.13	3.66 ±0.173	5.96 ±0.233, в	4.94 ±0.263, в
Глутаионредуктаза (нмоль/мин/мл плазмы)	20.23 ±0.48	17.28 ±0.433	20.21 ±0.39в	18.85 ±0.371, а, *
Глутатионпероксидаза (нмоль/мин/мл плазмы)	623 ±20	734 ±192	643 ±21а	573 ±16в,*

Примечание. Различия статистически достоверны при^{1, а, *} – р < 0.05;^{2, б, **} – р < 0.01;^{3, в, ***} – р < 0.001. Цифры – сравнение с контролем, буквы – сравнение с 2-й группой, * – сравнение с 3-й группой. ВЖД – высокожировая диета.

 

На фоне увеличения активности свободно-радикальных процессов отмечали рассогласование показателей системы АОЗ как на уровне ферментов, так и пула низкомолекулярных антиоксидантов. Активность СОД в печени была снижена на 53% (p < 0.001), а содержание Г-SH на 41% (p < 0.001) относительно контрольной группы (табл. 1). В то же время активность ГП, катализирующей восстановление перекиси водорода (H₂O₂) и органических перекисей до воды в присутствии Г-SH, повысилась на 18% (p < 0.001). Активность другого фермента глутатионового звена – ГР понизилась на 13% (p < 0,05), что, по-видимому, обусловлено его повышенным расходом в процессе восстановления окисленного глутатиона.

При введении в высокожировую диету липидного комплекса из A. tobuchiensis или препарта сравнения Омега (3-я и 4-я группа соответсвенно) отмечалась выраженная тенденция к нормализации как весовых характеристик, так и биохимических показателей печени и крови (табл. 1, рис. 1, 2). Однако по ряду показателей были выявлены достоверные различия. Масса тела крыс 3-й группы (ЛКА) (146 ± 3 г) соответствовала контрольному уровню, при этом по сравнению с 2-й группой (ВЖД) была ниже на 29% (р < 0.001). Удельная масса печени (4.42 ± 0.14 г/100 г массы) также была на уровне контроля, но по сравнению с 2-й группой ниже на 40% (р < 0.001). В группе животных, получавших препарат Омега (4-я группа), масса тела превышала контроль на 11% (158 ± 3 г, р < 0.01), а при сравнении с 2-й группой (ВЖД) была ниже на 15% (р < 0.001). Удельная масса печени превышала таковую в контрольной группе на 29% (5.56 ± 0.33 г/100 г массы, р < 0.01), а по сравнению с данным показателем во 2-й группе была ниже на 25% (р < 0.001).

При сравнении показателей липидного обмена в плазме крови крыс 3-й (ЛКА) и 4-й (Омега) групп с таковыми во 2-й группе (ВЖД) отмечалось снижение общих липидов на 22% (р < 0.05) и 14% (р < 0.05), что составляло 4.86 ± 0.21 и 5.19 ± 0.19 г/л соответственно. Уровень ХС был ниже на 35% (р < 0.05) и 24% (р < 0.05), а ТАГ – на 65% (р < 0.05) и 57% (р < 0.05) (рис. 1). Значение ХС-ЛПНП в плазме крови крыс 3-й группы было ниже на 13% (р < 0.05), а в 4-й группе – на 10% (р < 0.05). При этом уровень ХС-ЛПВП в плазме крови крыс 3-й группы был выше на 22% (р < 0.05), тогда как в 4-й группе он достоверно не отличался от такового во 2-й группе. При расчете индекса атерогенности было выявлено, что у крыс, получавших ЛКА, его значение не отличалось от контроля (1.26 против 1.34 в контроле), тогда как у животных 4-й группы (Омега) индекс атерогенности составлял 1.93. При сравнении этих значений с таковым во 2-й группе индекс атерогенности в 3-й группе (ЛКА) был ниже на 61%, в группе Омега – на 40%.

Введение ЛКА и Омега в высокожировую диету сопровождалось достоверными изменениями в количественном содержании фракций НЛ в печени крыс (рис. 2). В 3-й группе отмечалось снижение уровня ТАГ на 15% (р < 0.05), СЖК – на 11% (р < 0.05), ХС – на 22% (р < 0.05). В 4-й группе при введении препарата Омега снижение уровня ТАГ и ХС составило 9 и 14% (р < 0.05) соответственно, а содержание СЖК было выше, чем в контроле, на 11% (р < 0.05). Содержание ЭХС в 3-й и 4-й группах превышало таковое во 2-й группе на 24% (р < 0.05) и 14% (р < 0.05) соответственно. Следовательно, ЛКА более эффективно способствовал нормализации величин исследованных показателей НЛ в печени на фоне ВЖД.

Изменение показателей антиоксидантной системы и свободно-радикальных процессов у животных 3-й и 4-й групп характеризовалось выраженной тенденцией к восстановлению исследуемых показателей на фоне ВЖД (табл. 1). Это свидетельствует о снижении активности ПОЛ. Несмотря на то что уровень МДА в крови животных 3-й и 4-й групп превышал контрольные показатели на 26 и 34% (p < 0.001), в то же время по отношению ко 2-й группе он был достоверно ниже на 37 и 33% (p < 0.001) соответственно. На фоне снижения активности ПОЛ отмечалось повышение уровня АРА в плазме крови на 27% (p < 0.001) и 12% (p < 0.05) по сравнению с таковыми показателями во 2-й группе. Следует отметить, что у животных, получавших липидные комплексы, активность антиоксидантных ферментов СОД и ГП не имела достоверных отличий от контроля. Но по сравнению со 2-й группой активность СОД превышала таковую в 2 раза (p < 0.001), что также подтверждает снижение процессов ПОЛ под действием вводимых в рацион липидных комплексов. В пользу этого факта свидетельствует и более низкая, по сравнению с 2-й группой, активность ГП, которая была ниже на 12 и 21% (p < 0.05) соответственно. Активность ГР, фермента, ответственного за наработку пула Г-SH, в плазме крови 3-й группы находилась на уровне контрольных показателей, но по сравнению с 2-й группой превышала таковой на 20% (p < 0.001), тогда как активность ГР у животных 4-й группы – на 9% (p < 0.001). На фоне снижения уровня свободнорадикальных процессов и роста активности ГР отмечалось достоверное увеличение пула Г-SH в печени животных 3-й и 4-й групп на 63 и 35% (р < 0.001) соответственно по сравнению с 2-й группой. Следует отметить, что содержание Г-SH в печени животных, получавших препарат Омега, было достоверно ниже такового по отношению к контрольной группе (на 21%, p < 0.001), что, возможно, связано с более низкой активностью ГР у этих животных.

При анализе полученных экспериментальных данных была выявлена статистически достоверная разница между рядом соответствующих значений изученных биохимических показателей плазмы крови и печени крыс при сравнении показателей 3-й и 4-й групп (ЛКА и Омега) (рис. 1). Количество общих липидов в плазме крови при введении Омега было выше на 6.2% (р < 0.05), чем таковое при введении ЛКА, а также более высокий уровень ТАГ (на 23%, р < 0.05) и ХС (на 18%, p < 0.05). Данный факт, а также более низкое (на 10%) значение ХС-ЛПВП в крови животных 4-й группы обусловили более высокий индекс атерогенности (на 54%). Похожую картину наблюдали при оценке количественных показателей фракций НЛ в печени (рис. 2). Так, у животных 4-й группы уровень ХС на 10% (p < 0.05) превышал таковой у животных, получавших ЛКА, а содержание ЭХС было ниже на 9% (p < 0.05). При этом содержание ТАГ и СЖК у животных, получавших Омега, было выше, чем в 3-й группе, на 11 и 6,3% (p < 0.05) соответственно. В пользу более высокой эффективности ЛКА по сравнению с Омега свидетельствуют и величины показателей эндогенной системы АОЗ. Так, в печени животных, получавших ЛКА, значение Г-SH превышало таковое у животных из группы Омега на 17% (p < 0.01), а активность ГР – на 7% (p < 0.05). Это указывает на более низкий уровень свободнорадикального окисления, в пользу чего свидетельствуют и более низкий уровень МДА (на 6%, p < 0.05), и более высокое значение АРА (на 12%, p < 0.05) в плазме крови крыс 3-й группы по сравнению с аналогичными показателями у животных группы Омега. На основании вышеизложенного следует, что ЛКА был более эффективен как липидкоррегирующее и антиоксидантное средство, чем препарат Омега.

Обсуждение результатов

Высокожировая диета в течение 30 дней у крыс сопровождается увеличением массы тела и относительной массы печени, нарушением соотношения липидных классов в крови и печени, формированием дислипидемии. Согласно литературным данным (Новгородцева и др., 2011) при ВЖД уже через 30 дней развивается гепатостеатоз, характеризующийся жировой гипертрофией гепатоцитов за счет накопления в них избыточного количества жира. При этом в плазме крови отмечается значительный рост уровня ТАГ, ХС, ХС-ЛПНП при одновременном снижении значения ХС-ЛПВП. Следовательно, избыточное введение в рацион ХС и насыщенных жиров способствует повышенному образованию атерогенных ЛПНП, основного фактора риска развития атеросклероза. То есть повышенное потребление жира, богатого ТАГ, ХС и насыщенными жирными кислотами, приводит к формированию ожирения и развитию жирового гепатоза. В печени также отмечается увеличение содержания ХС, ТАГ и СЖК на фоне снижения уровня ЭХС, его основной транспортной формы в составе липопротеинов. Таким образом, гиперхолестериновый рацион с жировой нагрузкой приводит не только к жировому гепатозу, но и к накоплению в печени неэтерифицированной формы ХС. Полученные результаты указывают на нарушение липидного обмена в плазме крови под действием ВЖД, что является фактором риска развития метаболического синдрома и сердечно-сосудистых заболеваний.

Известно, что нарушение липидного обмена вследствие ВЖД (алиментарная дислипидемия, метаболический синдром) сопровождается развитием оксидативного стресса (Francisqueti et al., 2017), выражающегося в дисбалансе системы “перекисное окисление липидов – антиоксидантная защиты организма” (ПОЛ-АОЗ). Накопление липидов в печени активирует молекулярные пути, связанные с окислительным стрессом и воспалением, что является важным патогенетическим последствием жирового гепатоза (Ghezelbash et al., 2020). В печени увеличивается уровень МДА, одного из маркеров ПОЛ, указывающего на состояние оксидативного стресса в клетке на фоне снижения активности СОД, уровня Г-SH и активности ГР на фоне роста активности ГП. По мнению некоторых авторов, такое изменение активности ГП в условиях стресса на фоне ВЖД объясняется образованием избыточного количества продуктов пероксидации (Jimoh et al., 2018), что и наблюдается в плазме крови животных на 30-е сутки эксперимента. То есть формирующийся метаболический дисбаланс является как следствием значительного поступления жировых компонентов с диетой, так и стрессовой реакцией организма на жировую нагрузку (Noeman et al., 2011). Активирующийся в условиях стресса липолиз в жировой ткани приводит к увеличению потока жирных кислот в кровь и в печень, которые являются исходными компонентами при синтезе ТАГ и ХС. В результате это приводит к их накоплению в печени и подавлению активности рецепторов ЛПНП, что в свою очередь снижает поток поступления в печень атерогенных липопротеинов и вызывает рост их концентрации в крови (Connor, Connor, 1989). Полученные нами результаты по рассогласованию компонентов и направленности изменений активности отдельных ферментов системы АОЗ в условиях ВЖД согласуются с данными, полученными ранее другими авторами (Bodur et al., 2019). Все это указывает на истощение резерва адаптационных возможностей организма противостоять развивающейся патологии. Таким образом, экспериментальная модель сочетания гиперхолестеринового рациона с жировой нагрузкой в течение 30 сут сопровождалась развитием дислипидемии с характериными признаками оксидативного стресса.

Введение ЛКА и препарата сравнения Омега способствовало коррекции нарушений, вызванных применением ВЖД. Так как липидный экстракт из A. tobuchiensis представляет собой сложный природный комплекс, то его биологическое действие следует рассматривать как результат суммы всех его компонентов. При этом следует отметить, что активным началом липидных комплексов из морских гидробионтов считаются входящие в них ПНЖК семейства n-3, и в частности ЭПК, которая является доминирующей в исследованных нами препаратах. Ранее было показано, что добавка ЭПК в диету в условиях жировой нагрузки способствует нормализации содержания ТАГ и ХС как в плазме крови, так и в печени крыс (Hirotani et al., 2015), что согласуется с полученными нами данными. В ряде исследований было показано, что n-3 ПНЖК напрямую ингибируют такие ферменты, как ацетил-СоА-карбоксилаза, гормончувствительная липаза и диацилглицерол-ацетилтрансфераза, которые участвуют в биосинтезе жирных кислот, биосинтезе ТАГ и их мобилизации (Shibabaw, 2021). Также нормализацию показателей липидного профиля под действием ПНЖК связывают с повышенным бета-окислением жирных кислот в печени (Yanagita, Nagao, 2008). Снижение уровня атерогенных ЛПНП под действием исследованных липидных комплексов может быть следствием как снижения доступности ТАГ в печени для сбора липопротеинов очень низкой плотности, предшественников ЛПНП (Shibabaw, 2021), так и активации рецепторов ЛПНП в печени вследствие снижения уровней ТАГ и ХС по принципу обратной связи (Connor, Connor, 1989). Нормализация соотношения фракций ЛПНП и ЛПВП на фоне снижения уровня ХС в крови и соответствующее уменьшение индекса атерогенности, которое мы наблюдали при введении в ВЖД липидных комплексов, по нашему мнению, обусловлено входящими в их состав ПНЖК семейства n-3, в частности ЭПК. Так, известно, что снижение уровня ХС в крови может быть результатом, с одной стороны, снижения активности ГМГ-КоА-редуктазы в условиях модификации мембран гепатоцитов ЭПК (Murthy et al., 1988), а с другой – результатом непосредственного увеличения количества ЛПВП в крови (Balk et al., 2006). Также известно, что ПНЖК n-3, модифицируя ЛПВП, повышают их сродство к ХС, что приводит к росту обратного транспорта ХС в печень (Burillo et al., 2012).

Липидный комплекс анфельции и препарат Омега проявляли выраженное антиоксидантное действие на фоне развития оксидативного стресса в условиях ВЖД. Известно, что ПНЖК семейства n-3, и, в частности ЭПК, являются эффективными антиоксидантами прямого действия, способными поглощать пероксил-радикалы (Richard et al., 2008), что подтверждалось выявленным нами ростом АРА плазмы крови и снижением вторичных продуктов ПОЛ. При этом показано, что n-3 кислоты активируют индукцию СОД (Garrel et al., 2012), восстанавливают активность ГР (Refaat et al., 2022) и пул низкомолекулярных антиоксидантов, таких как Г-SH (Patten et al., 2013), что мы и наблюдали при анализе полученных результатов.

Заключение

Из полученных результатов следует, что комплекс липидов из морской красной водоросли A. tobuchiensis, содержащий метаболически активную фракцию морских фосфо- и гликолипидов с высоким содержанием ПНЖК семейства n-3, и в частности эйкозапентаеновой кислоты, обладает выраженным липидкоррегирующим и антиоксидантным эффектом в условиях высокожировой диеты. Метаболические изменения при использовании липидного комплекса A. tobuchiensis и препарата Омега способствуют увеличению ХС-ЛПВП и снижению уровня атерогенности в плазме крови, а также нормализации количественного содержания фракций НЛ в печени. Способность экзогенных «морских» липидов включаться в метаболизм предполагает их активное влияние на большинство жизненно важных процессов. Минимизируются последствия оксидативного стресса, что выражается в восстановлении параметров системы АОЗ, включая нормализацию активности СОД, ГП, ГР и сохранение пула Г-SH, а также в снижении уровня перекисного окисления липидов и восстановлении АРА плазмы крови.

Исследуемый комплекс липидов из анфельции не только не уступает по своей эффективности эталонному ПНЖК комплексу “Омега 3-6-9”, но и превосходит его по способности нормализовать метаболические показатели липидного обмена в крови и основных фракций НЛ в печени и способности организма противостоять факторам оксидативного стресса в условиях высокожировой нагрузки и формирования дислипидемии. По мнению авторов, более высокая биологическая активность у липидного комплекса A. tobuchiensis по сравнению с “Омега-3-6-9” объясняется как более широким спектром ПНЖК семейства n-3, так и формой их содержания в виде “морских” фосфо- и гликолипидов, которая является более эффективной по сравнению с этиловыми эфирами жирных кислот в составе “Омега 3-6-9”.

Финансирование

Работа выполнена в рамках государственного задания по теме № 0211-2021-0014 “Эколого-биохимические процессы в морских экосистемах: роль природных и антропогенных факторов” (№ государственной регистрации 121-21500052-9).

Этическое одобрение и согласие на участие

Исследования на животных выполнены в соответствии с приказом Минздравсоцразвития России от 01.04.2016 № 199н “Об утверждении Правил лабораторной практики” и требованиями ГОСТ Р 53434-2009 “Принципы надлежащей лабораторной практики”. Исследование одобрено этической комиссией Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН (протокол № 16 от 15.04.2021 г.). Эксперименты проводились в соответствии с требованиями Федерации европейских ассоциаций лабораторных животных (FELASA) согласно “Правилам и международным рекомендациям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или других научных целей” (Strasbourg, 1986).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов

Sobre autores

V. Sprygin

V.I. Il’ichev Pacific Oceanological Institute FEB RAS

Email: vgs2006@mail.ru
Rússia, Vladivostok, 690041

Н. Kushnerova

V.I. Il’ichev Pacific Oceanological Institute FEB RAS

Email: vgs2006@mail.ru
Rússia, Vladivostok, 690041

S. Fomenko

V.I. Il’ichev Pacific Oceanological Institute FEB RAS

Email: vgs2006@mail.ru
Rússia, Vladivostok, 690041

E. Drugova

V.I. Il’ichev Pacific Oceanological Institute FEB RAS

Email: vgs2006@mail.ru
Rússia, Vladivostok, 690041

L. Lesnikova

V.I. Il’ichev Pacific Oceanological Institute FEB RAS

Email: vgs2006@mail.ru
Rússia, Vladivostok, 690041

V. Merzlyakov

V.I. Il’ichev Pacific Oceanological Institute FEB RAS

Autor responsável pela correspondência
Email: vgs2006@mail.ru
Rússia, Vladivostok, 690041

Bibliografia

Arquivos suplementares