Analyses of Rodent Grooming and its Behavioral Microstructure in Modern Neurobiological Studies

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Груминг (grooming) – эволюционно древнее естественное поведение животных различных таксонов, способствующее поддержанию гигиены, терморегуляции, социализации и ряду других функций [1, 2]. Являясь важнейшим и (после сна) наиболее выраженным поведением грызунов, оно разделяется на ауто- и гетерогруминг (рис. 1). У грызунов ауто-груминг имеет определенные повторяющиеся паттерны – так называемую микроструктуру (microsctructure, patterning, см. далее), что делает оценку данного поведения лабораторных мышей и крыс хорошей моделью для нарушений поведения, свойственных ряду психических заболеваний [3].

Поведение груминга самым тесным образом связано со стрессом. Например, острый стресс усиливает частоту и длительность груминга, по-видимому, являясь классической смещенной реакцией [4]. Это, а также его стереотипность и повторяемость делают ауто-груминг полезным фенотипом для моделирования стрессорных расстройств. В то же время при длительном хроническом стрессе грызуны уделяют грумингу меньшее время, не заботясь о шерсти и коже. Соответственно нарушения ауто-груминга также могут быть использованы при моделировании последствий хронического стресса и связанных с ним аффективных или тревожных заболеваний ЦНС человека [1–4].

Груминг лабораторных грызунов часто исследуют как в эксперименте, так и (по состоянию шерсти) в домашней клетке для оценки общего благополучия животных в виварии. В этом случае обычно применяют шкалу оценки общего состояния шерсти (0 – не ухожена, 1 – в хорошем состоянии), либо делят тело на несколько частей (например, голову, шею, спину, живот, лапы, генитальную область и хвост) и каждой присуждают балл (0 или 1), сумма которых дает интегральный индекс груминга [5]. Есть и другие, более сложные способы оценки груминга, например, по количеству затронутых областей, их порядку очистки и частоте или продолжительности груминга [6] (рис. 1). Как будет показано в настоящей статье, такая тонкая микроструктура груминга используется все чаще и чаще в качестве вспомогательного показателя поведенческого фенотипа, оцениваемого в эксперименте на животных.

В частности, для оценки поведенческой микроструктуры ауто-груминга нами ранее был разработан подход, позволяющий количественно оценить последовательность эпизодов различных типов груминга – так называемый Алгоритм анализа груминга (ААГ, Grooming Analysis Algorithm, GAA, рис. 1) для крыс и мышей [7, 8]. В рамках ААГ микроструктура груминга может быть проанализирована путем измерения продолжительности, частоты и переходов различных стадий, а также его регионального распределения и количества полных завершенных актов [6], обычно совершаемых грызунами в ростро-каудальном (цефало-каудальном) порядке от головы к хвосту [1–4] (табл. 1, рис. 1).

 

Таблица 1. Основные типы ауто-груминга у грызунов (также см. рис. 1)

Зона тела	Поведение
Лапы и нос	Эллиптические двусторонние движения лапой, совершаемые возле носа
Морда	Короткие односторонние движения от вибрисс до области под глазом
Голова	Двухсторонние гребки назад и наверх за ушами и над макушкой обеими лапами
Тело	Облизывание тела и переход к спине, генитальной области и хвосту

 

Рис. 1 (a). Груминг лабораторных грызунов (a) и методы оценки его микроструктуры (b) c использованием Алгоритма анализа груминга [6–9] (ААГ/GAA, см. табл. 1 и текст далее). Каждое отдельное событие ауто-груминга является актом (bout), состоящим из отдельных стадий (эпизодов, episodes/stages) груминга (табл. 2). Первые три стадии направлены на переднюю часть тела и относятся к ростральному грумингу, остальные относят к каудальному грумингу. Переходы от одной стадии к другой называются переходами и оцениваются как правильные (в ростро-каудальном направлении 0-I-…-VI-0) или неправильные, с нарушением направленности – например, реверсии, пропуски стадий. Акты груминга могут быть полными (вся последовательность) или неполными – например, абортивными (прерванными ранее, чем стадия VI) либо неправильно начавшимися с более поздних стадий. Прерывания менее 2 с считаются как остановки внутри акта груминга, и число таких остановок груминга, а также % актов с остановками учитывается при анализе поведения. Примеры методов визуализации микроструктуры груминга в нейробиологических исследованиях представлены на рис. 2.

 

Рис. 2. Примеры визуализации микроструктуры груминга в нейробиологических исследованиях, включая этограммы (верхние панели), матриксы (средние панели), а также циркулярные флоу-граммы и трехмерный плоттинг (нижние диаграммы соответственно). На этограммах и в виде матрикса переходов представлены примеры обычного, ненарушенного груминга (слева) и аномального груминга с нарушенной микроструктурой (справа). В рамке дополнительно показаны примеры визуализации регионального распределения груминга, с разделением точками различного цвета на правильные (зеленые) и неправильные (красные) стадии, продемонстрированные за время тестирования в рамках или в нарушении ростро-каудального вектора соответственно. Диаметр точек отражает их продолжительность. Стоит отметить преобладание длительных правильных стадий в случае нормального груминга (слева) и наличие большого числа коротких неправильных и преимущественно ростральных стадий при патологическом груминге (справа).

 

Данные последних лет показывают, что груминг является важным поведением в нейробиологических исследованиях, а оценка микроструктуры ауто-груминга – ценным инструментом при моделировании заболеваний ЦНС на грызунах (см. далее), который может выявить тонкие различия в поведении животных, далеко не всегда легко обнаруживаемые измерением количества актов или длительности груминга [1]. Цель настоящей работы – подчеркнуть особую важность анализа ауто-груминга грызунов в эксперименте и провести анализ накопленной практики оценки уровня микроструктуры груминга грызунов и опыта применения ААГ (табл. 2) различными лабораториями мира в нейробиологических исследованиях на грызунах.

 

Таблица 2. Классификация паттернов ауто-груминга грызунов согласно Алгоритму анализа груминга (ААГ, GAA) [6–9] (см. рис. 1)

Номер стадии	Действие
0	Отсутствие груминга
1	Вылизывание передних лап
2	Вылизывание морды и носа
3	Мытье головы
4	Вычесывание тела (включая вычесывание тела задними лапами)
5	Вылизывание хвоста
6	Вылизывание гениталий

 

Тестирование животных для изучения груминга проводится в небольшом прозрачном цилиндре и длится обычно 5–10 мин, в ходе которого поведение грызунов записывается одной (или несколькими) камерами с фронтальной, угловой или вертикальной позиций, для дальнейшего анализа либо вручную (хорошо обученными исследователями), либо с использованием программного обеспечения (которые в настоящее время широко доступны на рынке, см. далее). В ААГ с помощью матрицы переходов [9] определяется частота каждого этапа, количество правильных и неправильных переходов между двумя этапами груминга, а также количество прерванных актов (рис. 1). Правильные переходы от одного этапа груминга к другому определяются как переходы между двумя последующими этапами груминга (например, 1–2 или 4–5). Неправильные переходы определяются как переходы между двумя несмежными стадиями груминга или в обратной последовательности (например, 0–6, 1–4 или 6–5). Наконец, прерванные акты определяются как пауза > 2 c во время груминга, если данное поведение не закончилось на стадии 6. В эксперименте рассчитывается общая частота переходов (сумма правильных и неправильных переходов), чтобы оценить общую активность груминга [6–9]. Как правило, стресс и различные дисфункции ЦНС нарушают микроструктуру груминга в ААГ, приводя к росту неправильных переходов, прерванных актов и нарушения регионального распределения груминга [1, 4, 6–9].

НАРУШЕНИЯ ГРУМИНГА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ

Как уже отмечалось, микроструктура груминга – это совокупность его паттернов и последовательностей (рис. 1), на которую влияют различные экспериментальные факторы и воздействия, такие как стресс, лекарственные препараты, а также гормональные и генетические манипуляции. Одним из мощных видов стресса является депривация сна, недостаток которого у грызунов влияет на уровень тревожности, материнское поведение и груминг. С помощью ААГ показано, что крысы-самцы с недостатком сна чаще совершают «неправильные» (вопреки ростро-каудальному вектору) переходы между стадиями груминга, что может говорить о росте тревожности [10]. При депривации сна беременных самок, наоборот, у животных уменьшается количество актов груминга и не изменяется материнское поведение [11]. Похожее поведение имеют также самки в послеродовой период [12] – у них хоть и снижается ауто-груминг внутри гнезда с потомством, однако отмечается больше неправильных переходов и прерванных актов. Поведение, связанное с грумингом, проявляется в зависимости от контекста, что указывает на анксиолиз (когда кормящая самка находится в контакте со своим пометом) и тревожность (когда она находится отдельно от детенышей). Поскольку такие данные невозможно получить в приподнятом крестообразном лабиринте или открытом поле (тестах, являющихся золотым стандартом измерения тревожного поведения), анализ микроструктуры груминга с использованием ААГ является удобным дополнительным инструментом для нейробиологических исследований.

Оценка микроструктуры важна при анализе фармакологических соединений и лекарственных препаратов, так как такой метод представляет более полную картину для определения эффектов психотропных веществ (табл. 3). Например, груминг и его микроструктура являются чувствительными к острому воздействию многих нейротропных препаратов, в т. ч. флуоксетина, амитриптилина [13], прегабалина, стрептозотоцина [14], вальпроевой кислоты [15], фенциклидина, скополамина [16], бупренорфина [17], клоназепама [18], аллопрегнанолона [19] и диэтиламида d-лизергиновой кислоты (ЛСД) [20]. Анализ груминга и его микроструктуры также обнаруживает чувствительность к хроническому воздействию ряда нейротропных препаратов [21–23]. Например, при действии кокаина с метилликаконитином – антагонистом α7 никотинового ацетилхолинового рецептора, происходит частый ауто-груминг у мышей вплоть до потери шерсти, с частыми прерываниями [22]. Кортикостерон увеличивает количество актов и время груминга, а также уменьшает латентность начала груминга, что свидетельствует о тревожно-подобном поведении [23] (но см. [21]). Эти данные очередной раз подчеркивают важность детального анализа как уровня груминга, так и изменений его микроструктуры в нейробиологических и нейрофармакологических исследованиях.

Интересным подходом к изучению влияния физиологически активных соединений на ЦНС является взаимосвязь груминга и других форм поведения грызунов по отношению к хищнику. Так, при влиянии гербицида галоксифоп-П-метилового эфира в прогнозируемых экологически значимых концентрациях возникает нарушение реакции на хищников [24]: животные под влиянием препарата хуже избегали змею и демонстрировали повышенный груминг, а не замирание.

 

Таблица 3. Влияние физиологически активных соединений на ауто-груминг грызунов

Препарат	Доза	Способ введения	Эффект на груминг (вид)	Ссылки
Общее изменение структуры груминга
Амитриптилин	5 и 10 мг/кг	Внутривенно (вв)	Уменьшение общей продолжительности груминга у крыс, уменьшение общего количество паттернов и переходов, а также средней продолжительности акта груминга (здесь и далее)	[13, 24]
Флуоксетин	5 и 10 мг/кг	Вв	Уменьшение общей продолжительности груминга у крыс, общего количество паттернов и переходов между ними, а также общего количеств актов
Прегабалин	200 мг/кг	Вв	Нет эффектов на частоту и длительность актов у крыс	[14]
Стрептозотоцин	200 мг/кг	Вв	Нет эффектов на частоту актов у крыс, более частые внезапные всплески быстрого и интенсивного груминга
Прегабалин и Стрептозотоцин	200 мг/кг	Вв	Снижение количества актов груминга у крыс
Фенциклидин	3 мг/кг	Внутрибрюшинно (вб)	Нет эффектов на частоту и длительность актов у мышей	[16]
Скополамин	1 мг/кг	Вб	Увеличение общей продолжительности груминга у мышей
Бупренорфин	0.25 мг/кг	Вб	Увеличение общей продолжительности груминга у мышей	[17]
Клоназепам	0.25 мг/кг	Вб	Уменьшение общей продолжительности и частоты актов, а также задержки в процессе акта у крыс	[18]
ЛСД	0.32 мг/кг	Вб	Увеличение общей продолжительности груминга у мышей	[20]
Вальпроевая кислота	400 мг/кг	Подкожно	Увеличение общей продолжительности груминга у крыс	[15]
Изменение микроструктуры груминга
Кокаин + метилликаконитин	15 мг/кг + 5 мг/кг	Вб	Нарушение последовательности груминга у мышей, частое повторение коротких эпизодов	[22]
Кортикостерон	20 мг/кг	Перорально	Увеличивает количество актов и время груминга, а также уменьшает латентность начала груминга, появляются неправильные переходы у мышей	[23]
Кортикостерон + кетамин	20 + 0.1 или 0.01 мг/кг	Перорально (по) + вб	Однократное введение кетамина и/или гуанозина нормализует ростральный груминг и прерванные и неправильные переходы, вызванные кортикостероном у мышей
Кортикостерон + гуанозин + кетамин	20 + 0.01 + 0.1 мг/кг	По + по + вб
Аллопрегнано-лон	1.25–5 мкг	Вб	Изменение процента правильных и неправильных переходов между стадиями у крыс	[19]

 

Табл. 3 иллюстрирует широкий спектр препаратов, которые демонстрируют активность при анализе груминга и его микроструктуры различными лабораториями мира. С помощью анализа микроструктуры груминга можно также сделать заключение о качестве лекарственного препарата. Например, при тестировании эффектов мелоксикама трех разных марок в тесте «открытое поле» на поведение мышей частота груминга снижается во всех трех группах, но особенно сильно выражена у одного препарата для ветеринарного применения. Эти побочные эффекты могут быть связаны с качеством лекарств, поскольку препараты мелоксикама могут содержать кристаллический полиморфизм, который влияет на эффективность и безопасность препаратов [25]. При введении липополисахарида (ЛПС) – эндотоксина, имитирующего инфекцию грамотрицательными бактериями, возникает аутистично-подобное поведение у потомства, в том числе повторяющийся груминг и другие моторные стереотипии [26]. Частота и длительность груминга головы увеличивается после пренатального воздействия ЛПС, также растут общая частота и время груминга на фоне снижения дофаминергической активности в гипоталамусе, что часто связывают с клиническими симптомами аутизма [26].

Помимо синтезированных веществ, активно изучаются растительные экстракты и эфирные масла с целью выявления их центрального (например, седативного или анксиолитического) профиля. Так, эфирное масло бергамота снижает тревожное поведение у крыс, подавляя общее количество актов груминга [27]. При этом флумазенил (антагонист бензодиазепинового сайта рецепторов гамма-аминомасляной кислоты ГАМК_А) не блокирует анксиолитический эффект эфирного масла бергамота [28]. Таким образом, седативное и анксиолитическое действие эфирного масла бергамота реализуется через механизмы, не связанные с рецепторами ГАМК_А, что расширяет возможность использования веществ растительного происхождения в качестве анксиолитиков для животных. О возможной анксиолитичности также говорит влияние экстрактов валерианы (Valeriana carnosa, V. macrorhiza и V. clarionifolia) на груминг [29], поскольку пероральное их введение снижает частоту ауто-груминга у мышей. Интересным эффектом обладает эфирное масло табака (Nicotiana tabacum) при разном способе введения [30]. Мыши в группе трансдермального введения тратят больше времени на груминг, чем группа ингаляционного введения, сохраняя при этом правильную микроструктуру. Полученные данные говорят об актуальности анализа груминга и его микроструктуры для поиска новых анксиолитических и других психотропных агентов среди растительных лекарственных средств и их сравнения с классическими анксиолитиками.

ГРУМИНГ В ОТДЕЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ НАРУШЕНИЙ ЦНС

Оценка микроструктуры груминга важна при исследовании заболеваний ЦНС, например, обсессивно-компульсивного расстройства (ОКР) и аутизма. Так, при хроническом применении кокаина появляются стереотипии и подобные ОКР эффекты [22], например, повторяются короткие последовательности груминга, что указывает на стрессорную природу наблюдаемого поведения и на вероятную роль α7-субъединицы никотинового рецептора ацетилхолина (нАХР) в модуляции ОКР-подобного эффекта кокаина. Повышенный груминг с чрезмерно повторяющимися паттернами часто встречается в животных моделях расстройств тревожного спектра и ОКР. Возможной причиной такого поведения является повышенная передача сигналов метаботропного глутаматного рецептора 5 (mGluR5), которая приводит к нарушению поведения и активности стриатума [31]. Нарушения могут возникнуть и в биохимических процессах. Например, дефицит Zfp462, белка цинковых пальцев, специфичного для позвоночных, вызывает у мышей тревожное поведение с чрезмерным грумингом [32] – повышением числа актов груминга и процента прерванных актов. Мыши с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом проявляют чрезмерный груминг с характерными паттернами, присущими ОКР – их груминг носит ригидный характер с повышенным количеством стереотипно повторяющихся действий [33].

В ряде моделей социальная среда улучшает поведение и нормализует груминг по сравнению с контрольными группами. Например, у самок мышей с гаплонедостаточностью тирозингидроксилазы снижается уровень катехоламинов и наблюдаются поведенческие аномалии – ухудшение сенсомоторных способностей, усиление тревожно-подобного поведения и нарушения микроструктуры груминга [34]. Однако если ссадить таких мышей с контрольными, то снижается частота и количество груминга, что свидетельствует о положительном влиянии совместного проживания (вероятно, за счет социального трансфера или обогащения среды).

В последнее время уделяется большое внимание исследованию генов и возможных генетических нарушений при оценке груминга и его микроструктуры. В частности, груминг грызунов чувствителен к различным генетическим манипуляциям, в т. ч. мутациям и трансгенезу. Подробный перечень генетически модифицированных мышей с нарушением груминга и его микроструктуры содержится в Базе данных геномной информатики мышей (Mouse Genomics Informatics Database, www.informatics.jax.org/), поддерживаемой Джексоновской лабораторией (США). На сегодняшний день в ней содержится наиболее полная информация о десятках линий геномодифицированных мышей с нарушениями груминга и его поведенческой микроструктуры.

Некоторые из данных линий будут рассмотрены ниже в качестве иллюстративных примеров. Так, ген Shank3B кодирует постсинаптические каркасные белки, которые имеют решающее значение для синаптической функции в мозге [35]. Мыши с нокаутом этого гена демонстрируют типичные для расстройства аутистического спектра (РАС) поведенческие отклонения, включая стереотипный груминг и повышенную тревожность [36]. Самцы мышей с делецией домена PDZ (экзоны 13–16) Shank3 демонстрируют фенотип поведения, подобный РАС, с часто прерывающимся повторяющимся грумингом и аберрантными социальными взаимодействиями [37]. При удалении экзонов 4–9 (Shank3^e4–9), специфичных для изоформы этого гена, мыши демонстрируют аномальное социальное поведение и стереотипно повторяющиеся стадии груминга [38]. Кроме того, мыши Shank3^{Δe4–22–/–} с делецией экзонов 4–22 демонстрируют чрезмерный длительный груминг на фоне снижения уровня стриарных постсинаптических каркасных белков mGluR5-Homer, измененной передачи сигналов mGluR5 в стриатуме и аномалий кортико-стриарного пути [39]. РАС-подобный фенотип описан и у мышей, нокаутных по гену α2-субъединицы натриевого канала (Scn2a), связанного с эпилепсией и аутизмом в клинике, демонстрируя повышение частоты груминга и появление других поведенческих стереотипий (например, в тесте закапывания мраморных шариков в подстилку) [40].

Похожие эффекты возникают у мышей с генетическим дефицитом дофамин-β-гидроксилазы (Dbh-/-), который необходим для превращения дофамина в норадреналин, что приводит к повышению уровня первого и отсутствию последнего [41]. В отличие от контрольной группы, которая демонстрирует энергичное зарывание в ответ на предъявление незнакомого им запаха розы, мыши Dbh-/- демонстрируют частые и длительные акты повторяющегося груминга. Таким образом, по-видимому, норадреналин управляет зарыванием, вызванным стрессом, а дофамин, очевидно, контролирует поведение и микроструктуру груминга.

Потенциальные мишени трансляции, которые связаны с поведенческими фенотипами, были описаны и валидированы in-silico на основании открытых баз данных [42]. Так, описано более 30 генов, гомологичных у мышей и человека, в т. ч. Ptpra, Tubgcp4, Ttl, Ptger3, Hoxb4, Pdgfb и Faah, коррелирующие с грумингом сразу в ряде поведенческих тестов [43]. Гены Hoxb4 и Hoxb8 участвуют в компульсивном груминге и ОКР-подобном поведении, а Ptpra связан с шизофренией. Интересен также ген Ccnd2, связанный с аномальной морфологией мозжечка и Gnb5, поскольку мыши с нокаутом Gnb5 имеют аномальное развитие мозжечка и нарушение координации движений [42]. Выявлены также гены молекул адгезии клеток нейронов (нейрексины, нейролигины, CNTNAP), белков постсинаптического каркаса (Shanks, SAPAP), рецепторов нейромедиаторов (глутамата, ГАМК) и молекул, участвующих в синтезе белка в мозге (Fmr1, TSC, MeCP2) [44]. Исследование генов значимо для понимания микроструктуры груминга, потому что оно раскрывает молекулярные механизмы в основе этого сложного и высокоорганизованного поведения. Это может помочь исследовать нейрофенотипы, связанные с грумингом, а также выявить новые мишени для лечения нейропсихических расстройств, таких как ОКР, синдром дефицита внимания и гиперактивности, шизофрения и аутизм.

РОЛЬ ОТДЕЛОВ ЦНС В РЕГУЛЯЦИИ ГРУМИНГА

Из основных зон мозга, ответственных за груминг, особо важную роль играют кора головного мозга, базальные ганглии, гипоталамус, миндалина, мозжечок, и продолговатый мозг [1] (рис. 3, табл. 4). Груминг грызунов и его организация зависят от базальных ганглиев, в частности, от связи дофаминовых нейронов [45]. Кора головного мозга, таламус и миндалевидное тело регулируют груминг, посылая и получая сигналы в стриатум. Мозжечок координирует и настраивает движения груминга, имея проекции в разные части головного и спинного мозга. Миндалевидное тело влияет на груминг в зависимости от контекста (например, при стрессе или в рамках социальной активности).

 

Рис. 3. Мозговые структуры, вовлеченные в регуляцию груминга и его микроструктуры у грызунов (см. также табл. 4) [1]. ACC – передняя поясная кора, PL – прелимбическая кора, IL- инфралимбическая кора, OFC – орбитофронтальная кора, CC – мозолистое тело, LV – боковой желудочек, NAc – прилежащее ядро, BST – ядро ложа терминальной полоски, Am – миндалина, PVN – паравентрикулярное ядро гипоталамуса. Стриатум регулирует последовательное движение грызунов при ауто-груминге, в то время как неокортекс участвует в общей модуляции двигательной программы. Мозжечок играет важную роль в контроле, координации и тонкой настройке движений при ауто-груминге, а ствол мозга – в инициации данных движений. Например, специфические нейроны спинального ядра тройничного нерва образуют нейронную цепь с шейным отделом спинного мозга для поддержания повторяющегося орофациального ауто-груминга. Миндалина участвует в специфической модуляции ауто-груминга во время стрессовых ситуаций, а гипоталамус обусловливает нейроэндокринную регуляцию груминга посредством гипоталамо-гипофизарной системы, либо через активацию других нейронных цепей. Например, стимуляция нейронов паравентрикулярного ядра и дорсального гипоталамуса вызывает активный ауто-груминг.

 

Гипоталамус и гипофиз отвечают за общий гормональный контроль груминга (рис. 3), активируя его при выделении стрессорных пептидов кортиколиберина и адренокортикотропина [46]. Ствол мозга инициирует и формирует базовые паттерны груминга (рис. 1), но для их полного выражения нужен стриатум. Также была доказана связь гиппокамп-септум-гипоталамус в лимбической системе мозга грызунов, которая регулирует ауто-, но не гетеро-груминг [47]. Активность мозга при груминге также демонстрирует интересные региональные особенности. Например, для нескольких областей мозга характер активации нейронов при груминге у самок в период диэструса различен в одних областях мозга, (околоводопроводное серое вещество, латеродорсальное тегментальное ядро, вентромедиальное дорсальное ядро шва), но не менялся в других (базальное ядро Мейнерта, оболочка прилежащего ядра) [48].

 

Таблица 4. Нейробиологический субстрат груминга при стрессе и моделях ОКР

Зона мозга	Экспрессия c-fos		Ссылки
	при стрессе	при ОКР
Кора головного мозга	↑	↑	[49]
Передняя поясная кора		↑	[50]
Прелимбическая кора		↑	[50]
Инфралимбическая кора		↑	[50]
Орбитофронтальная кора	↑	↑	[36, 50]
Ядро ложа терминальной полоски		↑	[50, 51]
Прилежащее ядро	↑	↑	[48, 50]
Базальное ядро Мейнерта	↑		[48]
Гипоталамус	↑	↑	[49, 50]
Миндалина	↑	↑	[36, 49, 50]
Околоводопроводное серое вещество	↑		[48]
Вентромедиальное дорсальное ядро шва	↑		[48]
Латеродорсальное тегментальное ядро	↑		[48]
Голубое пятно	↑		[48]
Околоводопроводное серое вещество	↑		[36, 48]
Медиальное ядро таламуса	↑		[36]

 

В табл. 4 отображены основные отделы мозга и их структуры, которые активируются при стрессе или ОКР. Заметно, что при обоих адаптационных расстройствах активируются одинаковые структуры. Неслучайно при ОКР, помимо повторяющихся действий, возникают также стрессовые состояния, которые отображаются в поведенческих тестах и стереотипном груминге. Такое поведение также связано с повышенной активностью нейронов в различных областях мозга, таких как орбитофронтальная кора, передняя поясная кора, прелимбическая кора, инфралимбическая кора, прилежащее ядро и гипоталамус. Эти области мозга участвуют в регуляции эмоций, мотивации и принятии решений и могут быть дисрегулированы при ОКР и стрессе [52, 53]. Таким образом, ОКР и стресс могут иметь общие механизмы, влияющие на поведение и работу мозга грызунов. В целом изучение груминга в контексте вовлеченных отделов мозга (рис. 3) имеет большое значение, помогая лучше понять неврологические расстройства, которые вызывают повторяющееся поведение. Кроме того, возможно, что зоны мозга, которые отвечают за груминг как инстинктивное поведение, могут быть связаны с другими видами поведения и мышления, которые развились у человека в процессе эволюции и культуры [1].

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МИКРОСТРУКТУРЫ ГРУМИНГА

Количественная оценка груминга и его микроструктуры открывает новые возможности в нейробиологии за счет создания и стандартизации компьютерных программ, существенно повышающих качество нейрофенотипирования поведения грызунов. В частности, созданы методы автоматического анализа микроструктуры груминга с помощью коммерческих программ HomeCageScan (CleverSys, Inc., США) и Ethovision XT7 (Noldus IT BV, Нидерланды), а также доступных в открытом доступе программ JAABA (Howard Hughes Medical Institute, США) [54–56], автоматический подсчет актов груминга в которых имеет одинаковую ошибку с ручным подсчетом, это говорит о том, что дальнейшие методические разработки в области технологий видеослежения позволят свести к минимуму количество ложных обнаружений, повысив эффективность данного метода. M-Track (CCTV Products, Пакистан), позволяющий в автоматическом режиме определять микрогруминг [57], представляет собой удобный графический интерфейс и надежный алгоритм для точного отслеживания движений отдельных передних лап во время спонтанного груминга. Создано также программное обеспечение DeepEthogram (Harvard Medical School, Boston, США), которое использует контролируемое машинное обучение для преобразования необработанных пикселей видео в этограмму для каждого видеокадра [58].

С использованием данных подходов в литературе описаны функции и представлен пространственно-временной подход глубокого обучения для классификации поведения мышей в домашней клетке [59]. Используя новую архитектурную модель нейронной сети, изучена генетика, лежащая в основе поведения, чтобы объяснить, почему мыши демонстрируют различное поведение при груминге [60]. Например, нейросетевой алгоритм проанализировал 2250 ч видео с участием более 60 разновидностей мышей и других животных, показав, что мыши, выращенные в лаборатории, занимаются грумингом меньше, чем мыши, недавно выловленные в природе. Похожим по функционалу, но чуть менее точной является трехмерная сверточная нейронная сеть (3D-CNN), в которой анализируются всего три параметра – отсутствие ауто-груминга (0), груминг морды (1) и груминг тела (2) [61]. Однако такой подход существенно выигрывает с точки зрения производительности и скорости обработки данных. Автоматизация позволяет проводить 24-часовую видеозапись ауто- и гетеро-груминга животных в более естественных условиях, исключая дополнительные стрессовые факторы, что предоставляет очевидные преимущества для нейроповеденческих исследований, так как упрощает работу исследователя и представляет более полную картину поведения животного. Таким образом, приведенные выше сведения еще раз указывают на значимость груминга и при действии различных экспериментальных факторов. При этом в ряде исследований [55, 56] анализ микроструктуры груминга являлся более чувствительным методом, чем общий подсчет его продолжительности (который либо не менялся, либо нет – см. далее).

Более того, использование анализа микроструктуры не ограничивается исследованием груминга грызунов и может быть применено для анализа поведения других видов животных, а также человека (в т. ч. в клинике). Например, инструменты видеонаблюдения в настоящее время позволяют отслеживать несколько животных на одной площадке [60], что открывает возможность изучения социального поведения, аллогруминга и, вероятно, может быть использовано для исследования аутизма. Также перспективным является использование искусственного интеллекта (ИИ), который будет способен к самостоятельному обучению и сможет точно отслеживать изменение поведения животного в естественной для него среде. Это позволит выделить даже тонкие изменения в поведении, которые могут быть связаны с психологическими нарушениями, а также выявить новые закономерности в физиологии животных. Кроме того, применение алгоритмов машинного обучения может помочь в выявлении скрытых паттернов в микроструктуре груминга, связанных с конкретными нарушениями ЦНС – ОКР, аутизмом и депрессией (табл. 4). Это приведет к углубленному пониманию механизмов и особенностей поведения у мышей, что может пролить свет на возможные связи между молекулярными, нейробиологическими и поведенческими аспектами этих нарушений. Поскольку поведение груминга характерно не только для грызунов и обнаруживается у самых различных видов животных, включая приматов и человека [62], трансляционная значимость груминга может быть также высокой в контексте диагностики различных (в том числе пресимтомальных и коморбидных) заболеваний ЦНС. Существует также целый ряд других открытых вопросов для изучения в данной области (табл. 5).

Таблица 5. Отдельные открытые вопросы в области анализа микроструктуры груминга грызунов

Вопросы
• Какие нейрофармакологические агенты могут модулировать груминг и как они влияют на активность и пластичность нейронов в стриатуме и других областях головного мозга?
• Какие этиологические факторы могут способствовать развитию повышенного груминга у животных и людей? Какие молекулярные и генетические маркеры могут быть ассоциированы с повышенным грумингом у животных и людей?
• Какие эволюционные преимущества или недостатки может иметь повышенный ауто-груминг у животных в естественных условиях?
• Как ауто-груминг грызунов коррелирует с гетеро-грумингом? Имеются ли общие нейрональные субстраты данных форм поведения?
• Как ауто-груминг грызунов коррелирует с ауто-барберингом? Имеются ли общие нейрональные субстраты данных форм поведения?
• Какие теоретические и практические применения может иметь анализ груминга для понимания нейробиологии, психологии и поведения животных и людей, в т. ч. аффективных расстройств, социального взаимодействия, формирования навыков и привычек, а также эволюционной адаптации?
• Какие функции выполняют разные зоны мозга, ответственные за груминг, и как они координируются между собой? [63]
• Почему груминг грызунов зависит от связи дофаминовых нейронов в базальных ганглиях и как это отражается на их поведении и когнитивных способностях? [64]
• Какие факторы могут вызывать или усиливать повторяющееся или стереотипное поведение, связанное с грумингом, такое как ОКР, аутизм или депрессия, и как они диагностируются и лечатся у животных и людей?
• Изменяется ли микроструктура груминга в зависимости от возраста и пола?
• Как поможет искусственный интеллект (ИИ) при распознавании микроструктуры груминга? Например, как применить ИИ и анализ больших данных (big data) для более точной диагностики, классификации и прогнозирования депрессии, аутизма, ОКР и других?
• Возможно ли в будущем провести параллель между микроструктурой груминга и сложным поведением человека?
• Самцы, при эрекции полового члена, больше уделяют внимание грумингу генитальной области [65]. Как не ошибиться при статистической обработке и не посчитать этот акт как количество неправильных переходов?
• Как молекулярные и генетические маркеры ауто-груминга могут быть использованы для скрининга или прогнозирования риска развития нарушений ЦНС человека?
• Лабораторные мыши занимаются грумингом меньше, чем дикие [60]. Как это связано с процессами доместикации? Связано ли это с возможной повышенной тревожностью лабораторных мышей?
• Какое место среди различных форм груминга занимает чесание тела задней лапой? В настоящее время оно рассматривается как отдельный вид поведения (т. е. вне паттернов остального груминга, в котором участвует вылизывание или облизывание, рис. 1).
• Как головной мозг координирует свои действия со спинным мозгом, генерируя двигательные действия, участвующие в груминге?
• Нейроны Cbln2+ Sp5C являются ключевым подтипом нейронов, отвечающим за повторяющийся груминг орофациальной поверхности [66]. Какие существуют еще нейроны и могут ли они отвечать за полную структуру груминга?
• Как влияет генетический профиль линии дикого типа на эффект мутаций, влияющих на груминг, с учетом известных линейных различий в отношении ауто-груминга и его микроструктуры?
• Существует ли эпигенетическая регуляция ауто-груминга? Какие эпигенетические механизмы могут вовлекаться в данный процесс?
• Каково участие нейроглии (микроглии и астроцитов) в регуляции ауто-груминга?
• Связаны ли между собой патологический ауто-груминг и апоптоз, нейровоспаление и нейродегенерация?
• Как ранний (неонатальный) стресс влияет на ауто-груминг и его микроструктуру?
• Какова возрастная траектория ауто-груминга и его микроструктуры?
• Влияет ли на микроструктуру ауто-груминга экспериментальная девибриссация и деольфактация (аносмия)?
• Участвуют ли феромоны (и какие) в регуляции ауто-груминга?
• Вокализируют ли грызуны до, во время и после ауто-груминга, и как?
• Каково соотношение генетических и средовых факторов в регуляции груминга и его микроструктуры? Например, изменятся ли последние при кросс-фостеринге, когда мышата линий с активным груминга выращиваются приемными матерями линий с низким уровнем, и наоборот?
• Как коррелируют генетические и эпигенетические детерминанты «количества» груминга с таковыми для его «качества» (микроструктуры)?
• Существует ли «социальный перенос» изменений в микроструктуре ауто-груминга у лабораторных грызунов?
• Как отличается микроструктура ауто-груминга у лабораторных мышей и крыс? Какие могут быть нейрональные механизмы данных различий, если они есть?
• Возможно ли ИИ научить определять все вариации поведения грызунов – разные виды груминга, барберинг, гнездование, рытье нор, исследование незнакомой местности и т. д.?
• Возможно ли адаптировать Алгоритм анализа груминга (ААГ) для оценки ауто-груминга человека в домашних, рабочих и клинических условиях?

 

ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИЗУЧЕНИЯ МИКРОСТРУКТУРЫ ГРУМИНГА

Более того, помимо ауто- и гетеро-груминга, в поведении грызунов важную роль занимает этологически близкое ему поведение барберинга [67–75]. Барберинг представляет собой поведенчески обусловленную алопецию (выкусывание шерсти и вибрисс), часто наблюдаемую у лабораторных грызунов. Как и для груминга, описаны ауто- и гетеро-барберинг [67–73]. В литературе активно обсуждается биологическая роль и взаимосвязь барберинга со стрессом, агрессией, грумингом и аберрантным стереотипным поведением. И хотя накапливающиеся сведения указывают на то, что ауто-барберинг представляет собой отдельный фенотип [69–73], можно допустить его частичное перекрывание на поведенческом, физиологическом и нейроcубстратном уровнях с патологически повышенным ауто-грумингом (например, overgrooming). Поэтому понимание природы барберинга и груминга и их влияния на состояние лабораторных животных является важным фактором, который необходимо учитывать в экспериментальной работе (табл. 5).

Патологически повышенный ростральный ауто-груминг может также привести к полной или частичной девибриссации (например, как в случае с мышами-мутантами по гену Hoxb8 [76]). Поскольку девибриссация влияет на поведение мышей в ряде тестов, это может исказить интерпретацию результатов эксперимента [67]. Например, девибриссация является экспериментальной моделью анксиогенеза у грызунов и приводит к нарушению их исследовательского поведения [77]. Таким образом, девибриссация при патологическом ауто-груминге, как и при ауто-барберинге, может усилить тревогу грызунов в поведенческих тестах, неспецифически влияя на результаты исследований, что особенно важно учитывать в контексте озабоченности научного сообщества проблемой воспроизводимости поведенческих данных в лабораториях [78, 79]. Соответственно становятся важными также систематические исследования распространенности нормального и патологического груминга в лабораторных колониях, как это уже делается для барберинга [68, 74, 80], а также поиск путей его нормализации, например, путем обогащения среды содержания животных в условиях вивария.

Необходимо также исследование ряда других аспектов ауто-груминга в лабораторных условиях. Например, уровень груминга зависит от условия содержания животных, в том числе таких факторов, как транспортировка в виварий, смена комнат вивария, время суток, время года [60]. Однако влияние данных и ряда других феномных факторов (уровень освещения, шума и вибрации в виварии, его размер, цвет стен, размер и тип клеток, плотность содержания животных, система вентиляции клеток, тип подстилки, режим ее смены, положение клетки на полке, источник/поставщик лабораторных животных, наличие сублиний, тестирование в различных лабораториях [74, 81]) на микроструктуру груминга пока не изучено. Влияние экспериментатора (его присутствие или отсутствие при тестировании, пол, метод хэндлинга животных) на поведение лабораторных грызунов также описано в литературе [82–84], но пока не изучено в контексте количественных или микроструктурных показателей груминга. Анализ различных поведенческих показателей ауто-груминга [60] может включать также ковариацию количественных и качественных (микроструктурных) параметров ауто-груминга различных линий и генетически модифицированных моделей. Это позволит понять, насколько увеличение или снижение частоты и длительности актов груминга может коррелировать с нарушением микроструктуры или предсказывать его, а также позволит оценить, насколько перекрываются генетические детерминанты двух данных характеристик ауто-грумига. Роль индивидуальной вариации микроструктуры ауто-груминга как отдельном фенотипе также заслуживает внимания в будущих нейробиологических исследованиях, особенно в контексте корреляции и ковариации с другими (не-груминговыми) нормальными и аберрантными фенотипами, изучаемыми в эксперименте.

Еще один важный практический вопрос касается влияния генетического профиля линии дикого типа на эффект мутаций, влияющих на груминг (табл. 5). Например, известны выраженные линейные различия в отношении количества [60] и микроструктуры ауто-груминга у мышей [8, 9], которые могут накладываться на изменения груминга, вызываемые генетическими модификациями. Поэтому исследователи должны оценивать вероятность возникновения эффектов «потолка» и «пола», например, если активирующая груминг мутация вызывается у линии дикого типа с высоким уровнем данного поведения, а ингибирующая мутация – у линии с крайне низким его уровнем соответственно.

Следует также отметить, что в большинстве работ (табл. 3, 6) оценка поведения животных проводилась не в комфортных условиях домашней клетки, а в различных поведенческих тестах (чаще всего основанных на стрессе новизной), и поэтому полная программа груминга могла не проявиться за счет преобладания незавершенных актов «стрессорного» груминга. С другой стороны, экспериментальные животные сравниваются с контрольной группой, которая содержится и тестируется в тех же условиях. В эксперименте также может быть целесообразно регистрировать разные формы поведения (обычно анализируемые раздельно, в специальных тестах) в ходе одного опыта, для сокращения времени тестирования и снижения риска ложных позитивов и негативов. Например, для анализа груминга могут использоваться видеозаписи, полученные не специально в отдельном тесте на груминг, а записанные в тестах открытого поля или приподнятого крестообразного лабиринта. Это логичное решение позволяет за один эксперимент получить несколько наборов данных (включая груминг) для их последующего анализа, что (за счет оптимизации дизайна эксперимента) также соответствует принципам биоэтичного экспериментирования на животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В целом ауто-груминг лабораторных грызунов является чувствительным и широко распространенным поведенческим фенотипом в биомедицинских и нейробиологических исследованиях. Для анализа ауто-груминга важна не только оценка его количества, но и анализ тонкой поведенческой микроструктуры, которая, как показывают данные последних лет, также оказывается чувствительна к широкому спектру экспериментальных воздействий (рис. 1–2, табл. 3). В ряде случаев чувствительность к различным экспериментальным воздействиям у микроструктуры груминга оказывается не ниже, а иногда – выше и с большим числом эффектов (табл. 6), чем у традиционных методов количественной оценки данного поведения. Поэтому необходимо более полно изучать груминг в контексте его микроструктуры и активно включать методы его комплексной оценки в существующие протоколы доклинических испытаний на грызунах.

 

Таблица 6. Примеры эффективности микроструктурного анализа груминга грызунов в нейробиологических исследованиях

Воздействие (вид)	Эффект на микроструктуру	Традиционные количественные подходы к оценке груминга	Ссылки
Клоназепам (крысы)	Уменьшение количества общих переходов между стадиями, что приводит к уменьшению количества неправильных и правильных переходов и росту процента правильных переходов. Уменьшение количества стадий, но увеличение продолжительности каждого эпизода и количеств стадий в эпизоде	Увеличение латенции, снижение частоты и общей продолжительности груминга	[18]
Нокаут гена Shank3B (мыши)	Увеличение груминга морды и тела, хаотичные переходы между данными стадиями	Увеличение общей продолжительности, но не частоты актов груминга	[36]
Введение липополисаха-рида (крысы)	Появление стереотипий, увеличение «рострального» груминга головы	Увеличение общей продолжительности и частоты актов груминга	[26]
Хронический аутоиммунный энцефаломиелит (мыши)	Увеличение груминга морды и головы, уменьшение количества неправильных переходов между стадиями (более ригидный груминг)	Увеличение общей продолжительности груминга	[33]
Введение Th-17-лимфоцитов (мыши)	Увеличение груминга морды и головы, уменьшение количества неправильных переходов между стадиями (более ригидный груминг)	Увеличение общей продолжительности груминга	[33]
Инбредная линия BTBR (мыши)	Появление поведенческих стереотипий, увеличение продолжительности груминга головы, тела, лап, хвоста и гениталий. Увеличение процента прерванных эпизодов и снижение процента неправильных переходов между стадиями	Увеличение общей продолжительности, но не частоты актов груминга	[85]
Аллопрегнанолон (крысы)	Уменьшение процента правильных переходов (возможное стрессорное поведение)	Частота и продолжительность груминга не изменяется	[19]
Нокаут рецептора 1, связанного со следовыми аминами (TAAR1, мыши)	Снижение каудального и рострального груминга, уменьшение количества неправильных переходов между стадиями, снижение груминга головы, тела и хвоста	Снижение частоты груминга	[86]
Депривация сна (крысы)	Увеличение частоты неправильных переходов между стадиями	Нет различий с контролем	[10]
Депривация парадоксального сна (крысы)	Увеличение частоты неправильных переходов и полных переходов. Увеличение частоты всех стадий, кроме груминга тела	Увеличение частоты и общей продолжительности груминга	[10]
Депривация сна у кормящих самок (крысы)	Увеличение числа неправильных переходов между стадиями	Увеличение частоты груминга у самок вне гнезда с потомством*	[12]
Нокаут гена триптофан-гидроксилазы (крысы)	Снижение доли правильных переходов между стадиями при интактном общем региональном распределении груминга	Нет различий в частоте и продолжительности груминга*	[87]

*На фоне отсутствия изменений поведенческих показателей тревожности в тесте приподнятого крестообразного лабиринта

 

Изучение микроструктуры ауто-груминга позволяет также оценивать многие другие аспекты поведения животных – двигательную активность, когниции, эмоции, стресс и социальность. Эти аспекты имеют большое значение для понимания механизмов ЦНС, а также для выявления потенциальных ее нарушений и заболеваний. Микроструктура груминга может служить индикатором нормального или аномального поведения, а также показателем эффективности терапевтических вмешательств. С этой точки зрения изучение микроструктуры груминга и ее нейрофизиологических и молекулярных коррелятов является важным подходом в современных нейробиологических исследованиях ЦНС (табл. 5).

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея статьи (А. В. К.), подготовка черновика статьи (К. В. А., А. Д. Ш., А. Д. В.), иллюстрации (В. Д. Р., С. В. А.), обсуждение и подготовка итоговой версии рукописи (А. В. К., К. В. А., А. Д. Ш., М. К. М., В. Д. Р., С. В. А., А. Д. В.).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств Научно-технического университета «Сириус». Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

作者简介

K. Apukhtin

Sirius University of Science and Technology

编辑信件的主要联系方式.
Email: avkalueff@gmail.com

Neurobiology Program, Scientific Center for Genetics and Life Sciences

俄罗斯联邦, Federal Territory Sirius

A. Shevlyakov

Sirius University of Science and Technology

Email: avkalueff@gmail.com

Neurobiology Program, Scientific Center for Genetics and Life Sciences

俄罗斯联邦, Federal Territory Sirius

M. Kotova

Sirius University of Science and Technology

Email: avkalueff@gmail.com

Neurobiology Program, Scientific Center for Genetics and Life Sciences

俄罗斯联邦, Federal Territory Sirius

S. Amikishiev

Sirius University of Science and Technology

Email: avkalueff@gmail.com

Neurobiology Program, Scientific Center for Genetics and Life Sciences

俄罗斯联邦, Federal Territory Sirius

V. Riga

Sirius University of Science and Technology

Email: avkalueff@gmail.com

Neurobiology Program, Scientific Center for Genetics and Life Sciences

俄罗斯联邦, Federal Territory Sirius

A. Volgin

Sirius University of Science and Technology

Email: avkalueff@gmail.com

Neurobiology Program, Scientific Center for Genetics and Life Sciences

俄罗斯联邦, Federal Territory Sirius

A. Kalueff

Sirius University of Science and Technology; Almazov National Medical Research Center, Ministry of Healthcare of Russian Federation; St. Petersburg State University

Email: avkalueff@gmail.com

Neurobiology Program, Scientific Center for Genetics and Life Sciences, Institute of Experimental Medicine, Institute of Translational Biomedicine, World-class Scientific Center “Center for Personalized Medicine”

俄罗斯联邦, Federal Territory Sirius; St. Petersburg; St. Petersburg

参考

补充文件