Разработка нового метода получения белка-антигена NS5A вируса гепатита C

Задача создания универсальной платформы для получения доступных рекомбинантных продуцентов вирусных белков, обладающих иммуногенными свойствами, до настоящего времени не решена и по-прежнему актуальна. Высокая токсичность вирусных белков для клеток-хозяев, низкий уровень продукции, аномальный фолдинг целевых продуктов часто создают непреодолимые препятствия для конструирования продуцентов вирусных белков. В данной работе разработан новый метод конструирования и скрининга банков делеционных производных генов вирусных антигенов, обеспечивающий возможность создания их искусственных производных, адаптированных для экспрессии в клетках микробных продуцентов. В основе лежит метод ПЦР-амплификации фрагментов целевого гена с использованием системы вырожденных и адаптерных праймеров, позволяющий предотвратить самопроизвольное образование дуплексов (димеров) в отсутствие матричной ДНК. Для отбора делеционных производных, пригодных для экспрессии in vivo, полученные in vitro фрагменты клонированы в вектор прямой селекции pQL30, содержащий ген в-галактозидазы E. coli со встроенным полилинкером с мутацией смещения трансляционной рамки считывания. С использованием скринингового подхода на основе этого метода сконструирован искусственный вариант гена белка NS5A вируса гепатита С (ВГС), обладающий оптимальными биотехнологическими характеристиками. В работе использованы 27 образцов NS5A ВГС длиной 1670 п. н. Получен банк фрагментов исходного гена в форме смеси продуктов ПЦР. Отобрано 40 клонов с размером вставки от 50 до 700 п. н. путем клонирования фрагментов в вектор прямой селекции pQL30. Клоны протестированы на уровень β-галактозидазной активности и иммуногенные свойства. В результате отобран клон, продуцирующий растворимый белок массой около 114 кДа, накапливающийся с выходом до 0,3% от общего содержания белка в клетке и показавший положительную реакцию с антителами сыворотки крови больных, инфицированных ВГС генотипа 1b, но не с сыворотками здоровых доноров.

вирус гепатита С, скрининг, банк, полимеразная цепная реакция, рэндом-праймер, антиген, продуцент