Changes in the conductivity of bilayer lipid membranes under the action of pluronics L61 and F68: Similarities and differences

全文:

ВВЕДЕНИЕ¹

Плюроники представляют собой симметричные триблок-полимеры поли(этиленоксид) – поли(пропиленоксид) – поли(этиленоксид) PEO-PPO-PEO. Амфифильная природа плюроников позволяет использовать их в биомедицинских и фармацевтических целях как перспективные переносчики лекарств и поверхностные стабилизаторы. [1–3]. Плюроники с большим содержанием гидрофильных PEO-блоков используются для предотвращения адсорбции белков. Например, плюроники F68, F108 и F127 широко используются для формирования оболочек, обеспечивающих “скрытность” коллоидных носителей лекарственных средств [4]. Плюроники F68 и L61 с одинаковыми по длине гидрофобными участками РРО показывают способность к ингибированию P-гликопротеинов, приводящих к снижению поглощения лекарств клетками [5]. Плюроник L61 оказался самым эффективным для доставки доксорубицина в опухолевые ткани с лекарственной резистентностью [6, 7]. К свойствам плюроника F68 относят его нейропротективное действие и улучшение функционирования множества типов клеток, имеющих поврежденные или изначально негерметичные мембраны [8].

Исследования взаимодействия плюроников F68 и L61 с липидными монослоями [9–11] и бислоями липосом [12–14] показали, что гидрофобные блоки PPO внедряются в углеводородную область липидной мембраны, гидрофильные блоки PEO остаются в водной фазе. Гидрофобная центральная часть L61 встраивается в мембрану, гидрофильные края находятся на поверхности мембраны. В случае если плюроник F68 находится в окружающем мембрану растворе в виде капсулы, то он слабо взаимодействует с мембраной. Внешняя часть капсулы образована гидрофильными концами молекулы, внутренняя – гидрофобной центральной частью [15]. Это справедливо для подавляющего большинства молекул F68, однако часть молекул взаимодействует с мембраной аналогично L61.

Методы молекулярной динамики используются для изучения взаимодействия плюроников и липидных бислоев [16–19]. Они показывают, что полимеры могут локализоваться на границе раздела, частично или полностью включаться в структуру мембраны в зависимости от относительного размера, массовой доли и гидрофобности.

Также проводились исследования влияния плюроников на электрические свойства плоских бислойных липидных мембран (БЛМ). В работе [20] было показано увеличение проводимости мембраны из дифитаноилфосфатидилхолина (DPhPC) при симметричной добавке L61 с обеих сторон БЛМ. При этом наблюдалось редкое появление дискретных флуктуаций тока, что предполагало появление в мембране сквозных пор. В работе [21] изучали различия в изменении проводимости мембран при добавлении плюроников L61 и F68. Было показано, что при добавлении L61 интегральная проводимость мембран возрастала, при этом наблюдалось появление дополнительных пор. При добавлении в окружающий раствор плюроника F68 такой же концентрации, как и L61, проводимость мембран с F68 была ниже, чем с L61. С увеличением концентрации F68 проводимость также возрастала, но на фоне высокой фоновой проводимости наблюдалось блокирование уже существующих пор.

В данной статье мы сравниваем изменение проводимости азолектиновых БЛМ при добавлении плюроников F68 и L61, имеющих одинаковое число гидрофобных PPO блоков. Мы показываем, что, если эти гидрофобные структуры оказались в мембране, то вызванное плюрониками появление проводимости одинаково для обоих плюроников в первом приближении.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Липиды, плюроники и электролит

Азолектин (Avanti Polar Lipids, США) использовали для формирования плоских БЛМ. Окружающий мембрану раствор содержал 0.1 М KCl с добавлением плюроников заданной концентрации. Использовались плюроники L61 (PEO-PPO-PEO: 2–30–2) и F68 (75–30–75) с одинаковым числом гидрофобных и разным числом гидрофильных блоков. Плюроник L61 получен от Sigma-Aldrich, Германия, плюроник F68 поставлен Gibco by Thermo Fisher Scientific, США.

Измерение критической концентрации мицеллообразования (ККМ) плюроников

Для нахождения ККМ был выбран метод спектрофотометрии. Измерения оптической плотности растворов плюроников L61 и F68 различных концентраций проводились при помощи спектрофотометра СФ-26 (ЛОМО, Россия) в растворе 0.1 M KCl при комнатной температуре 21 ± 1°C на длине волны УФ-излучения 360 нм. В результате была получена ККМ для плюроника L61 ~100 мкМ, что в три раза больше максимальной концентрации (30 мкМ), используемой в электрических измерениях. Для F68 ККМ была выше концентрации начального раствора от производителя – 10% или 13.2 мМ, что более чем в 25 раз больше максимальной концентрации (480 мкМ), используемой в измерениях (см. дополнительные материалы).

Плоские липидные бислойные мембраны

БЛМ формировались по методу Мюллера [22], использовался раствор азолектина в декане с концентрацией 30 мг/мл. Края круглого отверстия площадью 0.5 мм² в стенке тефлоновой камеры предварительно покрывались тонким слоем раствора азолектина и высушивались для формирования стабильных мембран. Азолектиновые мембраны формировались после добавления раствора 0.1 М KCl с плюрониками в обе ячейки камеры. Измерения проводились при комнатной температуре 21 ± 1°C.

Электрические измерения

Электроды Ag /AgCl помещались в оба отсека камеры. Трансмембранный ток регистрировали усилителем VA-10X (NPI Electronics GmbH, Германия) с сопротивлением обратной связи 5 ГОм и постоянной времени 20 мс. Флуктуации тока регистрировали с частотой дискретизации 1 кГц на 16-разрядном АЦП (L–Card, Россия). Измерения проводились в режиме фиксации напряжения.

Радиусы пор

Встраивание плюроников в мембрану приводило к возрастанию ее проводимости, носившему скачкообразный характер. Мы полагали, что возрастание проводимости обусловлено возникновением проводящих пор. Если рассматривать эти поры как цилиндры и считать, что удельная проводимость в поре равна проводимости в окружающем растворе, то радиус пор R можно приближенно оценить известной формулой [23]:

$R=\sqrt{Gh/\pi g}$, (1)

где h = 5 нм – толщина мембраны, G – проводимость поры, g = 1.04 См/м – удельная проводимость 0.1 М раствора KCl при комнатной температуре. Отметим, что в литературе отсутствуют точные оценки удельной проводимости электролитов в узком канале, поэтому рассчитанные по формуле (1) оценки размера пор являются приблизительными.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

 

Рис. 1. Экспериментальные зависимости удельной проводимости азолектиновых мембран (а) от концентрации L61 и F68 в окружающем растворе, (б) от относительной концентрации плюроников, связанных с мембраной; аппроксимирующие зависимости удельной проводимости g от концентрации C плюроников в растворе: g_L₆₁ = 15.3 × C¹^.³ и g_F₆₈ = 12.9 × C ⁰^.⁷ пСм/мм²; проводимость контрольных мембран 42 ± 6 пСм/мм². Прикладываемое напряжение не превышало 50 мВ. Окружающий раствор: 0.1 М KCl. Приведены стандартные ошибки.

 

На рис. 1а представлена зависимость удельной проводимости азолектиновых мембран от концентрации плюроников L61 и F68 в окружающем растворе. Исследовано 14 контрольных мембран, 23 мембраны с L61 и 28 мембран с F68. Обнаружено, что с увеличением концентрации плюроников увеличивается проводимость мембраны. При линейной аппроксимации экспериментальных данных в логарифмическом масштабе были получены концентрационные зависимости удельной проводимости мембран: g_L61 = 15.3 × C ^1.3 и g_F68 = 12.9 × C ^0.7 пСм/мм² для обоих плюроников. Стандартные ошибки в определении показателей степени составляют 1.3 ± 0.1 и 0.7 ± 0.1 [lg(пСм/мм²)/lg(мкМ)]. Эти коэффициенты близки к единице, но различаются значимо согласно критерию Стьюдента (p < 0.01).

Плюроники L61 и F68 имеют одинаковое количество (30) гидрофобных групп PPO и различаются по количеству гидрофильных групп PEO: 152 в F68 и 4 в L61. Мы предположили, что проводящие поры, образуемые обоими плюрониками, имеют одинаковую проводимость. Как видно из рис. 1а, для достижения удельной проводимости 100 пСм/мм², для F68 требуется примерно на порядок большая концентрация, чем для L61. Эти результаты согласуются с работой [24], в которой для L61 и F68 были получены безразмерные коэффициенты распределения, определяемые как отношение мольной доли полимера, связанного с мембраной, к мольной доле полимера в окружающем растворе. Для L61 K ≈1.58 × 10⁵ и для F68 K ≈1.1 × 10⁴. На рис. 1б представлена зависимость проводимости от относительной концентрации плюроников, связанных с мембраной. Для построения зависимости использовались экспериментальные данные удельной проводимости, представленные на рис. 1а. Относительная концентрация плюроников, связанных с мембраной, рассчитана из произведения концентрации плюроников и безразмерных коэффициентов распределения из статьи [24], выраженного в относительных единицах. Как видно из графика, при близких концентрациях связанных с мембраной плюроников удельные проводимости также близки. Это позволяет сделать вывод, что появление в мембране одинаковых гидрофобных частей обоих плюроников вызывает одинаковый рост проводимости в первом приближении.

 

Рис. 2. Ступенчатые треки и гистограммы проводимости азолектиновых мембран в 0.1 М KCl: (а) контроль,(б) с добавкой 12 мкМ L61, (в) 26 мкМ F68. Напряжение на мембране 25 мВ.

 

Измерения индуцированной плюроником проводимости плоских БЛМ ранее проводились для мембран с L61 [20]. В этой работе проводимость БЛМ из DPhPC измеряли для концентраций L61 в диапазоне от 5 до 50 мкМ, что близко к нашему диапазону от 2 до 30 мкМ. Проводимость DPhPC мембран увеличивалась с увеличением концентрации плюроника. С учетом поправки на разницу в концентрации электролита, проводимость DPhPC мембран была на порядок ниже проводимости азолектиновых мембран [25].

На фоне увеличения интегральной проводимости мембран в присутствии плюроников наблюдались дискретные флуктуации тока (см. рис. 2–5). Появление этих флуктуаций можно связать с образованием в мембране проводящих дефектов или пор. Токи регистрировались при напряжении на мембране 25 мВ.

Количество зарегистрированных в мембране пор было случайной величиной с большой дисперсией. При этом число пор не коррелировало с концентрацией плюроника. Разница между средними проводимостями пор для мембран с L61 и F68 не была статистически значимой. Как и в [20], такие колебания наблюдались достаточно редко, а именно примерно у 40% мембран как с L61, так и с F68.

 

Рис. 3. Треки проводимости и гистограммы азолектиновых мембран в 0.1 М KCl: (a) с добавкой 8 мкМ L61, (б) 26 мкМ F68. Напряжение на мембране 25 мВ.

 

Полученные треки можно разделить по тому, как они выглядят: ступенчатые, двух- или трехуровневые флуктуации проводимости (см. рис. 2). Присутствуют значительные (~100 пСм) скачки проводимости как вверх (рис. 3б), так и с последующим возвращением к исходному состоянию (рис. 3а); флуктуации проводимости непрямоугольной формы (рис. 4 и 5). Для последнего случая кроме гистограмм проводимости были построены автокорреляционные функции

$\psi \left(\tau \right) =\overline{g^{}\left(t\right)g{\left(t+\tau \right)}^{}}-\overline{g{\left(t\right)}^2}$, где $g\left(t\right)$ – зависимость проводимости от времени, τ – временной сдвиг, которые были аппроксимированы экспонентами.

При построении автокорреляционных функций из проводимостей вычитали фоновую проводимость, которой соответствует максимум на гистограмме (см. рис. 4б и 5б). Для 16 мкМ L61 аппроксимирующая экспонента имела вид $\psi \left(\tau \right) = 9exp\left(-\tau \left[c\right]/0.4c\right)$ [пCм²] (рис. 4г), для 26 мкМ F68 $\psi \left(\tau \right) = 46exp\left(-\tau \left[c\right]/0.65c\right)$ [пCм²] (рис. 5г). Согласно [26], экспонента описывает автокорреляционную функцию стохастического импульсного процесса. При этом параметр в знаменателе под знаком экспоненты Θ определяет среднюю длительность импульса, а предэкспоненциальный множитель равен произведению среднего квадрата амплитуды импульса $\overline{a^2}$ на среднее число импульсов, возникающих в единицу времени n₁, и на уже упомянутую среднюю длительность импульса Θ: $\psi \left(\tau \right) = \overline{a^2}{n}_1\mathrm{\Theta exp}\left(-\frac{\mathrm{\tau }}{\mathrm{\Theta }}\right)$. Отметим, что произведение n₁Θ определяет среднее число одновременно существующих импульсов, а также, что указанное выражение получено для прямоугольных импульсов, возникающих согласно распределению Пуассона. Для импульсов другой формы в предэкспоненциальный множитель добавляется численный коэффициент порядка единицы.

 

Рис. 4. Флуктуации проводимости азолектиновых мембран в 0.1 М KCl с добавкой 16 мкМ L61: (a) трек, (б) гистограмма, (в) участок трека в увеличенном масштабе, (г) автокорреляционная функция проводимости, рассчитанная по экспериментальным данным и приближенная экспонентой. Напряжение на мембране 25 мВ.

 

Как видно из треков в увеличенном масштабе (рис. 4в и 5в), полученные значения Θ = 0.4 с (L61) и 0.65 с (F68) больше среднего времени импульсов, взятого на половине высоты от максимума. Временные характеристики импульсов, представленных на рис. 4в и 5в, получены следующим образом: учитывались только импульсы, превышавшие 60 пСм (для L61) и 50 пСм (для F68). Было рассмотрено 9 (для L61) и 13 (для F68) импульсов. Средняя длительность импульсов составляла 0.18 ± 0.09 с (для обоих плюроников), межимпульсный интервал – 0.9 ± 0.8 с (для L61) и 1.1 ± 1.5 с (для F68). После знака “±” указаны стандартные отклонения. Полученные одинаковые значения средней длительности импульсов в 2–3 раза меньше характерного времени спада автокорреляционных функций. По-видимому, это указывает на то, что автокорреляционная функция описывает более медленный процесс – процесс появления пачек импульсов. Это хорошо видно на рис. 4а: за 60 с появилось 4–6 пачек импульсов. Характерный интервал между пачками составляет 10–15 с, в самой пачке импульсы возникают приблизительно раз в секунду.

Амплитуду импульсов можно оценить с помощью гистограмм (рис. 4б и 5б). Разницу между глобальным максимумом гистограммы (фоновой проводимостью) и локальным максимумом, составляющую 13 (для L61) и 32 (для F68) пСм, будем считать средней амплитудой импульса $\overline{a}$. Предположим, что $\overline{a^2} \approx {\overline{a}}^2$, что справедливо только для случая, когда все импульсы имеют одинаковую амплитуду. В результате можно оценить средние частоты импульсов $n_1\approx \raisebox{1ex}{$\mathrm{\psi }\left(0\right)$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{${\overline{\mathrm{a}}}^2\mathrm{\Theta }$}\right. =1.13$ (для L61) и 0.07 (для F68) 1/с. Эти оценки на порядок ниже полученных при анализе импульсов. Это говорит о том, что автокорреляционная функция описывает медленный процесс возникновения пачек импульсов.

 

Рис. 5. Флуктуации проводимости азолектиновых мембран в 0.1 М KCl с добавкой 26 мкМ F68: (a) трек, (б) гистограмма (показан локальный максимум в районе 60 пСм, максимум гистограммы приходится на 28 пСм), (в) участок трека в увеличенном масштабе, (г) автокорреляционная функция проводимости, рассчитанная по экспериментальным данным и приближенная экспонентой. Напряжение на мембране 25 мВ.

 

Если приближенно оценить по формуле (1) радиусы возможных цилиндрических пор, соответствующих наблюдаемым скачкам проводимости, то получаются поры с радиусами от 0.13 до 0.7 нм. Структуру радиусом 0.13 нм сложно назвать порой. Скорее, это возникший проводящий дефект в бислое. Наши результаты (см. рис. 2б, 2в) показывают, что такие дефекты стабильны (время существования – от 0.5 до 20 с), возникают скачкообразно. Они имеют, по крайней мере, три уровня (рис. 2б), изменения проводимости которых соответствует отношению 1 : 2 : 3. Указанные свойства характерны для проводящих пор. Отметим, что поры радиусом менее 0.5 нм считаются гидрофобными. В классических работах [27–29] гидрофобные поры считались нестабильными и непроводящими, но, согласно нашему исследованию, эти проводящие поры метастабильны. В работах [30–33] заполненные водой гидрофобные поры рассматривались как промежуточные структуры, обеспечивающее образование крупных гидрофильных пор. Возможность существования проводящих гидрофобных пор обсуждалась в [34]. В [35] увеличение дисперсии тока, связанное с появлением гидрофобных дефектов при фазовом переходе, наблюдалось еще до появления первых крупных пор. В последнее время появились модели, учитывающие возможность образования метастабильных, частично гидрофобных пор без необходимости значительных перестроек головных групп липидов [36–39]. Из наших измерений нельзя однозначно определить, какие именно проводящие структуры, образующиеся в мембране (гидрофильные и гидрофобные поры, короткоживущие дефекты), определяют рост интегральной проводимости.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявлены общие черты во взаимодействии гидрофобного L61 и гидрофильного плюроников F68 с бислойными липидными мембранами, вызывающих повышение проводимости мембран. Несмотря на то, что при одной и той же концентрации плюроников L61 и F68 в растворе проводимости азолектиновых мембран разные, при одинаковой концентрации связанных с мембраной плюроников проводимости не различаются. Этот результат получен на основе наших экспериментальных данных и литературных данных [24], которые позволяют оценить концентрацию плюроников, связанных с мембраной. Сходство проводимостей мембран при добавке разных плюроников связано с одинаковым числом гидрофобных блоков в центральных частях обоих полимеров. При появлении гидрофобных структур в мембране происходит одинаковый рост проводимости мембраны в первом приближении. Различие в действии плюроников – суб- и суперлинейная зависимости проводимости от концентрации – является эффектом второго порядка, оказывающим меньшее влияние на проводимость мембран.

Для обоих плюроников с ростом интегральной проводимости наблюдаются редкие флуктуации проводимости с амплитудой от 10 до 300 пСм и выше. Такие эффекты связывают с возникновением в мембране проводящих пор или дефектов. Зарегистрированные флуктуации имеют различную форму, но характерны при добавлении обоих плюроников.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена за счет гранта Российского научного фонда No 23-12-00125, https://rscf.ru/project/23-12-00125/.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

В дополнительных материалах авторами представлен график зависимости оптической плотности раствора 0.1 М KCl от концентрации плюроника L61.

 

¹ Дополнительные материалы размещены в электронном виде по DOI статьи “Изменение проводимости бислойных липидных мембран под действием плюроников L61 и F68: сходство и различие”

作者简介

A. Anosov

I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); Kotelnikov Institute of Radioengineering and Electronics of Russian Academy of Sciences

Email: ryleeva_e_d@staff.sechenov.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991; Moscow, 125009

E. Borisova

aI. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

编辑信件的主要联系方式.
Email: ryleeva_e_d@staff.sechenov.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

O. Konstantinov

aI. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: ryleeva_e_d@staff.sechenov.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

E. Smirnova

aI. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: ryleeva_e_d@staff.sechenov.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

E. Korepanova

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: ryleeva_e_d@staff.sechenov.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 117997

V. Kazamanov

MIREA – Russian Technological University

Email: ryleeva_e_d@staff.sechenov.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 119991

A. Derunets

National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: ryleeva_e_d@staff.sechenov.ru
俄罗斯联邦, Moscow, 123182

参考

补充文件