Energy dependent non-photoshemical quenching: PsbS, LhcSR and other players

Texto integral

Принятые сокращения: Вио – виолаксантин; Зеа – зеаксантин; Кар – каротиноиды; Кс – ксантофиллы; НФТ – нефотохимическое тушение; ПБК – пигмент-белковый комплекс; РЦ – реакционный центр; ФС1 и ФС2 – фотосистемы 1 и 2; ФСА – фотосинтетический аппарат; Хл – хлорофилл; Хл* – возбуждённое состояние Хл антенны; DGDG – дигалактозил-диацилглицерол; LHCI (LHCII) – главный светособирающий комплекс фотосистемы 1 (2); LhcSR – фотопротекторный белок водорослей; OCP – оранжевый каротиноидный белок; PsbS – фотопротекторная субъединица S фотосистемы 2; qE – энергозависимый компонент нефотохимического тушения.

ВВЕДЕНИЕ

Нефотохимическое тушение (НФТ) возбуждённых состояний хлорофилла (Хл), рассматриваемое в этом обзоре, – это непременный и на первый взгляд неожиданный спутник оксигенного фотосинтеза. С точки зрения первичных процессов фотосинтеза НФТ является конкурентом фотосинтеза за энергию света. Однако наличие такого конкурента необходимо для безопасной организации всей молекулярной системы фотосинтетического аппарата (ФСА), что связано с тремя обстоятельствами: (а) высокая фотохимическая активность Хл в кислородной атмосфере; (б) существенные и быстрые перепады интенсивности света на поверхности земли даже на открытом пространстве, а в ещё большей степени – под пологом растительного сообщества; (в) необходимость осуществлять фотосинтез даже при низкой интенсивности света, доходящего в этих условиях до растения. А именно, зная коэффициент молярной экстинкции (ε) Хл (порядка 10⁵ литр·моль⁻¹·см⁻¹ [1] в зависимости от растворителя, типа Хл и выбора синего или красного пика), нетрудно показать, что при умеренной интенсивности света (100 мкмоль фотонов·м⁻²·с⁻¹) средняя частота поглощения квантов света одной молекулой Хл будет составлять порядка 1 с⁻¹, что на 2 порядка ниже скорости переноса электрона по электрон-транспортной цепи. Учитывая, что такая интенсивность примерно соответствует естественной освещённости на открытом пространстве в пасмурный день, а под пологом леса или в толще воды на глубине всего нескольких метров может быть ещё в 10–100 раз ниже [2, 3], можно оценить, что как минимум 99,0–99,9% времени ФСА будет простаивать в ожидании очередного кванта света, если поглощение света и фотохимическую реакцию обеспечивает одна и та же молекула Хл. Таким образом, фотосинтез в этих условиях лимитируется доступностью света, и естественный способ повышения его интенсивности – увеличение светосбора за счёт создания большой (содержащей как минимум 10² молекул Хл и/или других эффективных пигментов) светособирающей антенны вокруг каждого реакционного центра (РЦ). И действительно, практически все фотосинтезирующие организмы (если не считать архебактерии, использующие бактериородопсин в качестве светозависимого генератора мембранного потенциала) имеют фотосинтетические антенны – пигмент-белковые комплексы приблизительно с таким количеством пигментных молекул.

Однако оборотной стороной наличия фотосинтетической антенны и высокой эффективности светосбора оказывается уязвимость ФСА перед воздействием интенсивного света. Как уже было сказано, для интенсивности света в природных условиях характерны существенные и быстрые флуктуации – более чем на порядок величины на открытых пространствах в силу изменения одной лишь облачности; под пологом леса смена условий затенения и солнечных бликов может давать 10²–10³-кратные флуктуации освещённости с характерными временами порядка минут [2, 4]. Если при некоторой интенсивности света его поглощение антенной и последующие реакции переноса электрона по цепи были сбалансированы, то при её многократном возрастании антенна насытит поток электронов, скорость которого теперь уже станет лимитирующей, и возрастёт время жизни возбуждённых состояний Хл антенны (Хл*), которые окажутся более невостребованными для обеспечения энергией фотохимической реакции разделения зарядов в РЦ (рис. 1). В результате возрастёт и вероятность синглет-триплетного перехода ¹Хл* → ³Хл* [5], а вместе с ним и вероятность образования синглетного кислорода в реакции (1) с триплетным Хл антенны [6–12]:

${}^3Хл*{+}^3{O}_2 {\to }^1Хл{+}^1{O}_2$ (1)

 

Рис. 1. Схема, иллюстрирующая пути дезактивации возбуждённого состояния Хл антенны. Показаны пути дезактивации и их эффективные константы для всего пула молекул Хл антенны: через фотохимическую реакцию (k_P, дугообразная зелёная стрелка), безызлучательную тепловую диссипацию (k_D, чёрная волнистая стрелка) и флуоресценцию (k_F, вертикальная красная стрелка). Синей вертикальной стрелкой, направленной вверх, показан переход Хл в возбуждённое состояние при поглощении кванта света

 

В подобных условиях избыточной энергии света необходим механизм, который позволит снизить время жизни Хл* и тем самым генерацию синглетного кислорода. Иными словами – необходим иной «потребитель» запасённой в антенне энергии. Такой потребитель всегда доступен и готов поглотить любое количество энергии – это тепловой резервуар. И необходимо только открыть канал для тепловой диссипации энергии возбуждённых состояний молекул Хл. Механизм, открывающий такой канал, получил название «нефотохимическое тушение». Слово «тушение» здесь происходит из оптического способа его наблюдения: с сокращением времени жизни Хл* снижается (тушится) и интенсивность его флуоресценции. Эпитет «нефотохимическое» означает несвязанность этого канала с фотохимической реакцией, запускающей цепь реакций переноса электронов. Этот канал дезактивации Хл*, как было отмечено в начале статьи, конкурирует с энергозапасающими фотосинтетическими процессами, однако он необходим для защиты ФСА от синглетного кислорода в условиях избытка света. Ключевым требованием к нему в таком случае оказывается его регулируемость – возможность (частичного) открытия/закрытия при изменении условий освещения и/или других условий, которые приводят к нарушению баланса между поглощённой и использованной в реакциях фотосинтеза энергией света. В самом тушении и его регуляции участвуют каротиноидные пигменты ксантофиллы (Кс) и белки, среди которых, по крайней мере у высших растений, центральную роль играет субъединица S фотосистемы 2 (ФС2), обозначаемая PsbS, а у большинства групп водорослей – очень близкий к антенным комплексам белок LhcSR (у мохообразных в НФТ участвуют оба белка).

В то время как роль LhcSR в НФТ как центра тушения в достаточной мере ясна, несмотря на почти четверть века изучения PsbS-зависимого НФТ, механизм этого процесса остаётся не вполне ясным. Появляющиеся новые данные об индукции НФТ в некоторых мутантах или модельных системах претендуют на опровержение сложившихся представлений о центрах тушения в ФСА. В последние годы появился большой объём новой информации как о макромолекулярных структурах суперкомплексов реакционных центров и светособирающих антенн, так и о взаимодействиях отдельных аминокислотных остатков, лежащих в основе процессов индукции НФТ. Данный обзор посвящён в первую очередь роли PsbS в НФТ. Тем не менее для цельности изложения мы также приводим здесь данные и о функциях ксантофиллов в этом процессе.

Изложение существующих на сегодня представлений о механизмах НФТ мы предварим описанием тех пигмент-белковых комплексов (ПБК) тилакоидной мембраны, в которых реализуется тушение – антенных комплексов ФС2 и фотосистемы 1 (ФС1). Поскольку их строение различается у разных фотосинтетических организмов, мы сделаем акцент в первую очередь на организации ПБК в «зелёной ветви» эукариотических фотосинтетиков (Viridiplantae).

ХЛОРОФИЛЛ-СОДЕРЖАЩИЕ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ПИГМЕНТ-БЕЛКОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ

В тилакоидной мембране хлоропласта Хл и каротиноиды (Кар) локализованы как в самих фотосинтетических реакционных центрах ФС1 и ФС2, так и в антенных комплексах. В ФС2 молекулы Хл содержатся в белках D1 и D2 (продукты генов psbA и psbD), образующих реакционный центр (по 6 молекул Хл а), и в белках CP47 и CP43 (продукты генов psbB и psbC; содержат 16 и 13 Хл а, а также 5 и 3–4 молекулы Кар соответственно [13, 14]), образующих внутреннюю антенну ФС2. Внешние антенные комплексы, ассоциированные преимущественно с ФС2, образованы продуктами большого семейства генов lhcb. Главный антенный комплекс LHCII представляет собой гомо- или гетеротример, состоящий из трёх очень похожих друг на друга белков Lhcb1, -2 и -3 (гомотример Lhcb1 или гетеротример Lhcb1 с Lhcb2 и Lhcb3), каждый из которых содержит 8 Хл а, 6 Хл б и 4 Кс: 2 лютеина, неоксантин и виолаксантин (Вио), который может заменяться на зеаксантин (Зеа) [15]. (У зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii несколько больший набор гомологичных белков: LhcbM1–LhcbM9 [16].) Непосредственно на периферии реакционных центров ФС2, между ними и комплексами главных антенн, располагаются малые мономерные антенны CP29, CP26 и CP24 (CP24 отсутствует у зелёных водорослей) – продукты генов lhcb4, lhcb5 и lhcb6, содержащие по 14 (11 Хл а + 3 Хл б), 13 (10 + 3) и 11 (7 + 4) молекул Хл и по 3 Кар соответственно [15]. В наземных растениях перечисленные ПБК существуют в виде суперкомплексов: двух комплексов ФС2 (обозначаемых C), двух прочно связанных (S) и двух умеренно связанных (M) главных антенных комплексов; такие суперкомплексы обозначают C₂S₂M₂. При высокой освещённости часть антенн может диссоциировать, оставляя «редуцированные» суперкомплексы C₂S₂ и C₂S [17]. В хлоропластах шпината [18], а также водорослей C. reinhardtii [19] и Chlorella sorokiniana [20] были обнаружены более крупные комплексы C₂S₂M₂L₂, включающие дополнительно два слабо связанных антенных комплекса (L). Таким образом, на один суперкомплекс ФС2 приходится до 200 молекул Хл (рис. 2).

 

Рис. 2. Схематичное изображение суперкомплекса ФС2, C₂S₂M₂L₂, включающего димер комплексов ФС2 (обозначаемых C) и по паре прочно (S), умеренно (M) и слабо связанных (L) главных антенных комплексов LHCII. Суперкомплекс стабилизируется малыми антеннами CP29, CP26, CP24 (последняя имеется у высших растений, но отсутствует у зелёных водорослей); вид в плоскости мембраны (со стороны стромы). Приблизительные контуры белковых субъединиц показаны сплошной линией, расположение молекул Хл (без фитольных «хвостов») – зелёным (Хл а) или бирюзовым цветом (Хл б). Бирюзовой и розовыми точками показано расположение атомов железа и марганца в ФС2 соответственно. Пересекающиеся в проекции на плоскость мембраны фрагменты белков (в частности, длинное плечо белка CP29, контактирующее с ФС2 со стороны стромы) не показаны. За основу схемы взяты данные криоэлектронной микроскопии о структуре суперкомплекса из C. reinhardtii (код pdb: 6KAD [16]). Предполагаемое место расположения субъединицы PsbS соответствует гипотезе Su et al. [17] для высших растений

 

Где-то на границе ФС2 располагается субъединица S (PsbS), ответственная за индукцию НФТ, имеющаяся у всех групп «зелёной ветви» фотосинтезирующих организмов (Viridiplantae). Её точная локализация представляет пока неразрешённую проблему: её не удаётся увидеть с помощью криоэлектронной микроскопии, что говорит о том, что она либо очень слабо связана с ФС2, либо может связываться с ней в различных позициях [21]. Эта ситуация сохраняется вплоть до самого последнего времени [22]. У всех групп водорослей и у мхов в тилакоидной мембране присутствует также другой белок, вызывающий НФТ, LhcSR (Light-Harvesting Complex Stress-Related protein). Показано, что у мха Physcomitrella patens LhcSR связан с комплексами LHCII и локализуется преимущественно в тилакоидах стромы и немного – на краях гран [23].

Вторым основным местом локализации Хл в ФСА являются РЦ и антенны ФС1. Как и в случае ФС2, они образуют суперкомплексы, причём весьма различные у разных групп фотосинтетических организмов. Для цианобактерий характерны тримеры и в некоторых случаях тетрамеры ФС1, для которых роль светособирающих антенн выполняют водорастворимые фикобилины, но в некоторых условиях (при дефиците железа) это могут быть и хлорофилл-содержащие белки IsiA, обладающие некоторым сходством с белком внутренней антенны ФС2, CP43, и образующие кольцо вокруг тримера ФС1 [24]. Для эукариотических фотосинтетиков характерны хлорофилл-содержащие мембранные антенны Lhcr в линии красных водорослей или гомологичные им Lhca – в линии зелёных водорослей и высших растений. Количество таких антенн на один РЦ ФС1 у высших растений – 4, а у зелёных водорослей – 10 (возможно, что это количество может меняться при акклимации к изменению интенсивности света), причём антенны в пределах каждого суперкомплекса представляют собой различные, хотя и близкие белки (Lhcr1, Lhcr2 и Lhcr3 – у красных водорослей, Lhca1–Lhca9 – у зелёных, Lhca1–Lhca6 – у наземных растений). Кроме того, главный антенный комплекс ФС2, LHCII, также может пристыковываться к антенным комплексам ФС1 (рис. 3). По-видимому, именно эти антенны, окружающие РЦ ФС1, препятствуют их три- или тетрамеризации, в связи с чем у эукариотов суперкомплексы ФС1 с антенной содержат только один комплекс ФС1 [24]. Содержание Хл и Кар в одном антенном белке Lhca составляет, в зависимости от вида и белка, от 12 до 19 молекул Хл (9–19 Хл а и 1–5 Хл б) и от 2 до 5 молекул Кар (лютеин, бета-каротин, а также Вио или Зеа) [25–27]. В целом же можно оценить, что с учётом 96 молекул Хл а в РЦ ФС1 такие суперкомплексы содержат до 250 молекул Хл у зелёных водорослей и 150 Хл – у наземных растений (или приблизительно до 330 и 190 соответственно – при наличии в суперкомплексе LHCII).

 

Рис. 3. Схематичное изображение суперкомплекса ФС1 (в литературе обозначаемого как PSI–LHCI–LHCII), включающего комплекс ФС1, несколько антенных комплексов LHCI (продукты генов lhca1–lhca9) и два главных антенных комплекса ФС2, LHCII; вид в плоскости мембраны. В зависимости от вида и условий освещения суперкомплексы ФС1 могут содержать меньшее число антенн. За основу схемы взяты данные криоэлектронной микроскопии о структуре суперкомплекса из C. reinhardtii (код pdb: 7D0J [28])

 

Комплексы ФС1 располагаются в стромальных участках тилакоидов. Как упоминалось выше, у организмов, обладающих белком НФТ LhcSR (по крайней мере у P. patens), он также присутствует в тилакоидах стромы и, следовательно, может тушить возбуждённые состояния Хл в суперкомплексах ФС1 за счёт взаимодействия с антеннами LHCII, связанными с ФС1 [29]. Однако заметное снижение роли LHCII в светосборе для ФС1, произошедшее при переходе от водорослей к высшим растениям, вероятно, сделало LhcSR-зависимое НФТ ненужным и привело к исчезновению этого белка у сосудистых растений [30]. Кроме того, экспериментальные данные и результаты модельных расчётов показывают, что при наиболее обычных условиях (при умеренно высоких интенсивностях света, характерных для естественного освещения) интенсивность флуоресценции ФС1 относительно невелика – от ~5 до 14% (см. подробное обсуждение в статье Schreiber и Klughammer [31]; флуоресценция ФС1 может достигать 25–30%, по крайней мере у цианобактерий и эукариотических водорослей, однако это происходит лишь при интенсивностях порядка 5000–8000 мкмоль фотонов м⁻²·с⁻¹ [32], т.е. примерно в 2,5–4 раза выше, чем максимально возможная интенсивность света на поверхности Земли в субтропической зоне [33]). Это указывает на относительно низкую стационарную концентрацию возбуждённых состояний Хл в ФС1 в естественных условиях освещения, не требующую привлечения дополнительных эффективных механизмов тушения. Поэтому рассматриваемые ниже механизмы тушения в основном относятся к Хл антенн, связанных с ФС2.

ОСНОВНЫЕ ФОТОФИЗИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ НЕФОТОХИМИЧЕСКОГО ТУШЕНИЯ

Формально открытие канала тепловой дезактивации Хл* описывается возрастанием константы тепловой диссипации k_D (рис. 1) и связано с переносом возбуждения на пигмент (или группу пигментов) с короткоживущим возбуждённым состоянием. Оказавшись на этом пигменте-ловушке, энергия возбуждения быстро перераспределяется по тепловым (колебательным) степеням свободы молекулы и её окружения, не представляющим опасности с точки зрения химической активности. Такие пигменты или группы пигментов называют центрами тушения; фактически они действительно играют роль стоков для возбуждения, мигрирующего по антенне. Неоднократно было показано, что в безызлучательной тепловой диссипации избыточной энергии, поглощённой фотосинтетической антенной, активно участвуют каротиноиды [34, 35], что связано с коротким временем жизни их возбуждённого состояния (порядка 10 пс [36], что много меньше, чем у Хл – порядка 1 нс в зависимости от состояния ФСА [37]). Однако роль конкретного каротиноида в индукции НФТ может быть различной: он может сам становиться центром тушения (в этом случае говорят о прямом тушении (direct quenching)) либо способствовать формированию других центров тушения, т.е. косвенно активировать НФТ (indirect activation of quenching).

Не останавливаясь здесь подробно на механизмах прямого тушения, отметим только, что одной из ключевых гипотез здесь была модель молекулярного переключения передач (molecular gear shift model), рассматривающая каротиноид Зеа как основной тушитель [38]. Оценки энергий «тёмного» (спектрально запрещённого, но активно участвующего в переносе энергии) возбуждённого состояния S1 Зеа и Вио, сделанные Frank et al. [38], говорили о том, что для Зеа (с энергией S1 более низкой, чем энергия первого электронно-возбуждённого состояния Хл) предпочтителен перенос энергии с Хл на Зеа с последующим тушением; в то же время для Вио (с более высокой энергией S1) предпочтителен перенос в направлении Вио → Хл, что делало его более эффективным светосборщиком (рис. 4). Эта фотофизическая модель прекрасно увязывалась с представлениями о фотозащитной роли Кар виолаксантинового цикла, которая незадолго до того была показана Demmig-Adams [39] после трёх десятилетий неясности этой функции со времён открытия виолаксантинового цикла Сапожниковым и др. [40]. Позже эта модель подвергалась критике: появлялись данные о том, что энергии S1 Зеа и Вио in situ (в LHCII) значительно меньше различаются, чем in vitro (в растворителях) [41]; что перенос энергии, скорее всего, происходит не на Зеа, а на лютеин, по крайней мере в LHCII [42]; наконец, что величина (и даже знак) разности энергий Кар и Хл практически не влияют на возникновение Кар-зависимого тушения [43]. В качестве альтернативы модели молекулярного переключения передач с переносом энергии возбуждения на Зеа в литературе также фигурировала модель НФТ по механизму с переносом заряда (charge transfer, CT) [44]. Фактически это тоже Зеа-зависимое тушение, но за счёт переноса не энергии нейтрального возбуждения, а электрона от Зеа на Хл, в результате которого образуется быстро рекомбинирующая пара Хл⁻–Зеа⁺. В этом механизме также предполагается особенная роль Зеа в НФТ за счёт его низкого потенциала ионизации (наиболее низкого из всех каротиноидов виолаксантинового цикла). В настоящее время, по-видимому, CT-механизм перестал рассматриваться как существенный механизм НФТ в LHCII [45], однако его участие в тушении в малых антеннах ФС2, CP24, CP26, CP29 [46], и в LhcSR [47] не вызывает сомнений.

 

Рис. 4. Схема взаимодействия пигментов виолаксантинового цикла с Хл антенны в соответствии с моделью молекулярного переключения передач Frank et al. [38]. Дугообразные стрелки показывают перенос нейтрального возбуждения между молекулами пигментов, при котором возбуждённая молекула-донор переходит в основное состояние, а невозбуждённая молекула-акцептор – в возбуждённое. В соответствии с моделью перенос энергии между рассматриваемыми пигментами (Хл, Вио и Зеа) происходит преимущественно в направлении Вио → Хл → Зеа. Волнистой стрелкой показан безызлучательный и не сопровождающийся переносом энергии переход Зеа* в основное состояние (тепловая диссипация энергии возбуждения)

 

Представление о возможности косвенной Зеа-зависимой активации НФТ в антенне возникло вскоре после первой модели прямого тушения в силу иных (не согласующихся с моделью молекулярного переключения передач) результатов расчёта энергий состояния S1 Вио и Зеа [41, 48]. Предполагалось, что Зеа может облегчать конформационный переход LHCII в потушенную форму [41] либо повышать чувствительность LHCII к закислению люмена, стимулирующему НФТ [49].

Выше мы упоминали, что в регуляции НФТ, наряду с Кс, центральную роль играет белок PsbS. С момента обнаружения этой роли [50] представления о механизме его участия в НФТ эволюционировали от прямого тушения до косвенного. В силу значения этого белка для НФТ мы посвятим ему (а также его древнему аналогу LhcSR) отдельный раздел.

ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О РОЛИ БЕЛКОВ PsbS И LhcSR В НЕФОТОХИМИЧЕСКОМ ТУШЕНИИ

Белок PsbS был впервые выделен из тилакоидов шпината в 1986 г. как субъединица ФС2 [51], выполняющая неизвестную функцию, и первоначально упоминался в литературе как 22-kDa polypeptide или PSII-S. Вскоре была установлена его аминокислотная последовательность, показавшая его сходство с антенными белками, но, в отличие от них, вероятное наличие в его составе четырёх трансмембранных спиралей [52, 53]. В 1995 г. появились сведения – как стало впоследствии ясно, ошибочные – что этот белок связывает 5 молекул Хл а и б и несколько типов каротиноидов; в связи с этим было высказано предположение, что его функция связана с дополнительным и/или альтернативным светосбором [54]. Эта ошибка в дальнейшем имела большое влияние на представления о механизме его работы. Спустя 5 лет в ходе исследований мутантов Arabidopsis thaliana, полученных путём ненаправленного мутагенеза (облучение быстрыми нейтронами), удалось установить, что этот белок является ключевым для НФТ [50]. Позже было показано, что, в дополнение к подавлению НФТ и повышенной чувствительности ФСА к фотоиндуцированным повреждениям при отсутствии PsbS, при его сверхэкспрессии НФТ и защита от повреждений ФСА избыточным светом выражены сильнее, чем в диком типе [55, 56]. Как было известно уже к концу 2000-х гг., многие организмы, принадлежащие к зелёной линии (Viridiplantae), имеют в своём геноме предполагаемые ортологи PsbS высших растений. Несмотря на это, первоначально белок PsbS не был обнаружен ни в классической модельной зелёной водоросли C. reinhardtii, ни в одном из других исследованных видов микроскопических зелёных водорослей (современные представления о распространении этого белка среди фотосинтезирующих организмов см. в разделе «Распространение механизмов нефотохимического тушения в различных систематических (эволюционных) группах» настоящего обзора). Как ни странно, при этом он был обнаружен в многоклеточной зелёной водоросли Ulva laetevirens, а в харовой водоросли Chara corallina его присутствие было чрезвычайно незначительным [57]. Тот факт, что тем не менее некоторые одноклеточные виды демонстрировали высокую активность НФТ, заставил предположить, что в них работает некий независимый от PsbS механизм. И действительно, вскоре у C. reinhardtii был обнаружен белок LhcSR (Light-Harvesting Complex Stress-Related protein, ранее описанный как LI818 [58]), ответственный за НФТ и распространённый (если говорить об ортологах его гена) у всех эукариотических водорослей, кроме красных водорослей (Rhodophyta), а также у мхов [59].

Оба белка, LhcSR и PsbS, относятся к большому суперсемейству LHC – антенных белков, связывающих Хл и Кс [30]. Белок LhcSR имеет пространственную структуру, схожую со структурой малой антенны ФС2 (CP29) или мономеров комплекса LHCII (т.е. структуру, включающую три трансмембранных альфа-спиральных столба; рис. 5), и, подобно им, также связывает молекулы Хл и Кс: 8 молекул Хл (8 Хл a в изоформе LhcSR1, 7 Хл а и 1 Хл б в LhcSR3) и 3 или 4 молекулы Кс, включая лютеин и Вио [47, 60]. Существуют различные представления о том, каким образом LhcSR (и близкие к нему белки LHCX) вызывает тушение электронного возбуждения Хл в антенне: за счёт переноса возбуждения с Хл на Кс с последующей быстрой конверсией Кс* в Кс; за счёт переноса электрона с Кс на Хл или за счёт образования экситонного сопряжения между молекулами Хл и Кс (выше мы обсуждали различные предполагаемые механизмы прямого Кар-зависимого тушения), однако в любом из этих случаев предполагается, что именно LhcSR является центром тушения [47, 61].

 

Рис. 5. Структура субъединицы S ФС2, PsbS (а), по данным рентгеноструктурного анализа (код pdb: 4RI2 [62]), и мономера комплекса главной антенны LHCII, Lhcb1 (б), по данным криоэлектронной микроскопии (код pdb: 8IX0 [63]); последовательность белков, составляющих LHCII, близка к последовательности LhcSR, для которого на сегодняшний день пока не получена экспериментальная трёхмерная структура. Спиральные участки (α и 3₁₀) показаны цилиндрами и подписаны для обоих белков (TM1–TM4 – трансмембранные спирали, H1–H3 – амфифильные спирали PsbS; у Lhcb1 их общепринятые обозначения A–C и E–D соответственно). Молекулы Хл, связанные с Lhcb1, выделены зелёным (Хл а) или бирюзовым цветом (Хл б; фитольные «хвосты» показаны тонкой линией), каротиноиды – жёлтым (лютеин), оранжевым (неоксантин) и красным (виолаксантин)

 

Какое-то время аналогичный механизм прямого тушения предполагался и для PsbS [50, 64]. Однако появившиеся в 2000-х гг. данные о биохимических свойствах PsbS [65], а также данные по мутагенезу PsbS [57], а затем и данные о трёхмерной структуре этого белка [62] показали, что, вопреки первым сообщениям [50, 54], он не содержит молекул пигментов. В отличие от LhcSR и антенных белков, PsbS имеет дополнительную (четвёртую) трансмембранную спираль (рис. 5) и более компактную структуру, которая не оставляет достаточного пространства для связывания Хл и Кс [62]. Интересно отметить, что при достаточно высокой вариабельности аминокислотной последовательности PsbS (так, белки шпината и зелёной водоросли Lobosphaera incisa имеют лишь около трети общих остатков [66]), трёхмерная структура PsbS весьма консервативна.

В связи с этим высказывались различные гипотезы о возможном косвенном механизме участия PsbS в тушении возбуждения в антенне, реализующемся через его взаимодействие (непосредственное или с участием молекул Кс) с белками внешней и внутренней антенн и переключение самих этих антенн в «тушащее» состояние.

Отметим, однако, что независимо от молекулярных механизмов, которыми обеспечивается LhcSR- и PsbS-зависимое тушение, полагают, что каждый из этих белков служит детектором pH в тилакоидном люмене и, следовательно, обеспечивает энергозависимый компонент НФТ (qE; в настоящем обзоре мы используем это общепринятое обозначение не для физической величины – меры затушенной флуоресценции с помощью механизма энергозависимого тушения, а для самого этого механизма) [30]. Закисление люмена приводит к протонированию экспонированных в люмен аминокислотных остатков и образованию центра тушения в самом белке или в контактирующих с ним антенных комплексах.

ПРЕДПОЛАГАЕМЫЕ МЕХАНИЗМЫ И ЦЕНТР PsbS-ЗАВИСИМОГО НЕФОТОХИМИЧЕСКОГО ТУШЕНИЯ

Отсутствие пигментов в составе PsbS означает, что он не может служить центром тушения, а может лишь стимулировать формирование центров тушения в соседних ПБК. Имеются экспериментальные доказательства того, что по крайней мере у высших растений центр тушения формируется в пределах тримера главной антенны LHCII [67–69]. Хотя незатушенная (светособирающая) конформация LHCII является термодинамически несколько более выгодной при комнатной температуре, чем затушенная, свободная энергия перехода между ними очень невелика: всего лишь около 2,5 kT (k – постоянная Больмана; T – абсолютная температура), т.е. близка к характерной энергии теплового движения [70]. Видимо, поэтому переключение LHCII в затушенное состояние (т.е. формирование в нём центра тушения) может происходить под действием разнообразных относительно «слабых» стимулов [71]. Среди этих стимулов: изменение жёсткости тилакоидной мембраны [72, 73]; истончение тилакоидной мембраны [74]; возникновение трансмембранной асимметрии – накопление дигалактозил-диацилглицерола (DGDG) на стороне люмена [74]; агрегация LHCII [75, 76]; присутствие Зеа [77] или PsbS [78–81]. Однако не вполне ясно, какие из этих причин первичны. В физиологических условиях главной причиной развития тушения в антенне является тилакоидная трансмембранная ΔpH, как необходимое и достаточное условие для qE, тогда как Зеа и PsbS с аддитивными эффектами [80] могут регулировать чувствительность qE к ΔpH. При этом в LHCII можно получить полноценное qE за счёт увеличения ΔpH до нефизиологически высоких значений (более 3 единиц) даже при отсутствии Зеа или PsbS [68, 80] и при отсутствии малых антенн [68].

Считается, что непосредственный механизм индукции тушения связан со сближением связанных в LHCII пигментов, Хл а 612 и лютеина-620 (сайт его связывания в белке также обозначается Lut1; рис. 6), что усиливает их экситонное взаимодействие [82–84]. Действительно, по данным молекулярного моделирования, при закислении меняется экситонное сопряжение между Хл а 612 и лютеином-620 с 5–9 см⁻¹ (максимум распределения) до 12–15 см⁻¹ [71]. Их сближение, в свою очередь, может быть вызвано нейтрализацией (за счёт протонирования) амфифильной (amphipathic) спирали D, параллельной мембране, что позволяет ей расположиться ближе к гидрофобному ядру LHCII [85]. Другой предполагаемый вариант конформационных перестроек, ответственных за переход LHCII в затушенное состояние – изменение угла между трансмембранными спиралями A и B [83, 84]. Наконец, возможно также, что из-за закисления люмена и протонирования Glu-94 меняется его партнёр по водородной связи – с Lys-99 на Gln-103 (рис. 6) [84], что ведёт к уменьшению среднего расстояния в LHCII между спиралями E и D.

 

Рис. 6. Структура Lhcb1, по данным криоэлектронной микроскопии (код pdb: 8IX0 [63]); показан только кластер хлорофиллов Хл а 610, -611, -612 и лютеин (в сайте связывания Lut1), предположительно, образующие центр тушения. Цветом показаны боковые цепи Glu-94, Lys-99 и Gln-103, предположительно, связанные с переходом LHCII в затушенное состояние. Остальные пояснения см. в подписи к рис. 5

 

В этих конформационных изменениях играют роль белок-липидные взаимодействия и локальный липидный состав мембраны вблизи LHCII. Так, было показано, что при нейтральном pH тример LHCII окружён большим количеством мембранного галактолипида моногалактозил-диацилглицерола (MGDG) [86], имеющего коническую форму и не характерного для плоских бислойных мембран. При низком значении pH люмена в тилакоидной мембране, в её люменальном листке вблизи LHCII, может накапливаться липид цилиндрической формы DGDG. Молекулярное моделирование показывает, что это связано с компактизацией LHCII на люменальной стороне и с тем, что DGDG имеет в этом случае лучшее стерическое соответствие и заполняет образовавшиеся полости [74]. Однако он снижает подвижность LHCII, тем самым препятствуя его комплексообразованию, необходимому для индукции НФТ [69]. Предполагается, что PsbS, связываясь с LHCII и вытесняя DGDG, восстанавливает подвижность LHCII в мембране. При этом и сам PsbS при закислении люмена изменяет свою конформацию для связывания с LHCII [87, 88]. Иными словами, PsbS может играть роль «мембранной смазки» [74, 89, 90]. Об этом говорят также экспериментальные данные: отсутствие PsbS (в мутанте npq4) способствует образованию упорядоченных (кристаллических) фаз, в которых белки иммобилизованы [81]. В этой функции PsbS возможно участие Зеа, который обеспечивает эффективное связывание между LHCII и PsbS в фотозащитном состоянии [87, 90, 91]. В то же время несвязанный Зеа может вызывать изменение жёсткости тилакоидной мембраны, что изменяет латеральное давление в мембране; в результате меняются белок-липидные взаимодействия и также индуцируются конформационные изменения в LHCII, переводящие его в диссипативное состояние [72, 73]. При отсутствии Зеа активация qE требует снижения значения pH в люмене до 4,7–5,0 [49].

Кроме влияния на агрегацию LHCII, предполагается, что PsbS также может регулировать значения pK_a остатков LHCII, экспонированных в люмен, а также и других антенных белков (например, минорной антенны CP29, взаимодействуя с которой, PsbS может увеличить значение pK_a остатка Glu-128 с 4,46 до 5,24 [92]). Не исключено, что подобную функцию может выполнять и Зеа, наиболее гидрофобный ксантофилл, располагаясь как внутри, так и на периферии LHCII; тем самым он может повышать pH-чувствительность LHCII, обеспечивая его протонирование и индукцию qE при умеренных ΔpH [49]. Наконец, высказываются предположения, что PsbS вызывает тушение, изменяя конформации каротиноидов в LHCII, поскольку было показано, что эти изменения могут быть ответственны за переключение между режимами светосбора и фотозащиты [93].

Однако каков бы ни был механизм PsbS-зависимой активации НФТ, он должен включаться при понижении pH в тилакоидном люмене. После того как было обнаружено, что PsbS может существовать в тилакоидной мембране как в форме мономера, так и димера (причём равновесие между мономерной и димерной формами обратимо изменяется светоиндуцированным образом, сдвигаясь в сторону мономерной формы при снижении рН), в качестве одной из основных рассматривается гипотеза, что рН-зависимая активация PsbS обусловлена его превращением из димера в мономер [94]. Предполагалось, что эта мономеризация сопровождается изменением расположения PsbS внутри суперкомплекса ФС2, а именно ассоциацией мономеров со светособирающими антеннами, в то время как димеры имеют тенденцию ассоциироваться с ядром ФС2. Недавно было высказано предположение, что переходы димер ↔ мономер, в свою очередь, связаны с изменениями в двух коротких амфифильных спиралях H2 и H3 на люменальной стороне белка. Так, данные ЯМР- и ИК-спектроскопии выявили перемещение спирали H2 в белке PsbS мха P. patens из водной фазы в мембранную и переход H3 из сегмента петли в спираль, вызванный протонированием ключевых остатков глутамата [95]. В то же время в ходе рентгеноструктурного исследования PsbS было показано, что активная форма PsbS также является димером [62].

Схема, обобщающая основные представления о PsbS- и LhcSR-зависимом тушении, приведена на рис. 7.

 

Рис. 7. Схематичное изображение основных представлений о механизме PsbS- (а) и LhcSR-зависимого тушения (б). Схематично показаны изображения суперкомплексов ФС2 и ФС1 (в проекции на плоскость мембраны), образуемые комплексами одного из реакционных центров (ФС2 или ФС1) и окружающими его антенными комплексами главных светособирающих антенн, LHCII и/или LHCI, и малых антенн (CP29, CP26, CP24). Изображения на разном цветовом фоне соответствуют разным характерным значениям pH. Подчёркивается, что в слабокислых условиях (pH < 6) PsbS активирует НФТ в антенных комплексах за счёт непосредственного взаимодействия с ними, либо стимулируя их отделение от суперкомплексов ФС2 и последующую агрегацию. В то же время значительное закисление среды (pH < 4) вызывает образование центров тушения в главных антенных комплексах LHCII даже при отсутствии PsbS. На панели (б) отражены представления о том, что LhcSR сам образует центр тушения (стока энергии) для возбуждения в главной антенне LHCII независимо от того, связана она с ФС2 или ФС1. Схема вверху панели (а) иллюстрирует предполагаемые механизмы косвенной PsbS-зависимой активации НФТ в LHCII и малых антеннах. В изображении суперкомплексов реакционных центров и антенн не отражено различие между их строением у водорослей и наземных растений, конкретное расположение PsbS и LhcSR показано условно, обозначение центра тушения не указывает на его локализацию внутри отдельного антенного ПБК или их агрегатов

 

НЕФОТОХИМИЧЕСКОЕ ТУШЕНИЕ КАК РЕГУЛЯЦИЯ УНИВЕРСАЛЬНОЙ ФЛУКТУАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Пока сложно сказать, все ли описанные механизмы НФТ и в какой мере реализуются in vivo, но многообразие и сложность молекулярных механизмов регуляции НФТ несомненны. На причины такого многообразия и происхождение НФТ, возможно, проливают свет исследования флуктуации флуоресценции (fluorescence intermittency или blinking). Это универсальное явление было открыто в середине 1990-х гг. для широкого класса флуоресцирующих систем: от органических пигментов до квантовых точек [96, 97].

Внедрение в спектральные исследования метода спектроскопии одиночных молекул позволило обнаружить явление, маскируемое усреднением по ансамблю: стохастическое переключение молекулярной флуоресцирующей системы между «яркими» и «тусклыми» состояниями (bright and dim states), т.е. состояниями с различным квантовым выходом флуоресценции. Предполагается, что переходы между этими состояниями связаны с флуктуирующим микроокружением флуорофора. Это мерцание было обнаружено и в фотосинтетических белковых комплексах – в главных фотосинтетических антеннах ФС2 растений LHCII [98], в антеннах пурпурных бактерий LH-2 [99], в аллофикоцианинах цианобактерий [100], в B-фикоэритрине красных водорослей [101]. Исследования главного антенного комплекса высших растений LHCII показали, что, в отличие от простых систем, в подобных комплексах с плотной упаковкой большого числа пигментов (8 Хл а, 6 Хл б и 4 Кар) возникает целый ряд состояний с различными уровнями «светимости» [98]. Переходы между этими состояниями происходят спонтанно, и время жизни LHCII в каждом из них составляет от десятков миллисекунд до десятков секунд (хотя бо́льшая часть времён лежит в секундном и субсекундном диапазонах). При этом как частота переходов, так и время жизни в каждом из состояний зависят от условий среды: величины pH и интенсивности возбуждающего света [98]. Таким образом, как светособирающее, так и «затушенное» состояние антенны изначально присущи этому и многим другим ПБК и не требуют каких-либо специальных модификаций белка (за счёт связывания дополнительных пигментов или протонирования аминокислотных остатков); последние необходимы лишь для стабилизации одного из этих состояний. Иными словами, можно сказать, что растение не «конструирует» новый канал тушения возбуждения в антенне, а использует внутренне присущие ей состояния с разными уровнями тушения и лишь создаёт условия для сдвига динамического равновесия в сторону того из них, которое необходимо в данных физиологических условиях. Универсальность явления флуктуаций флуоресценции, далеко не ограничивающегося фотосинтетическими антеннами, но лежащего в основе регуляции процессов сбора света в фотосинтезе, создаёт основы для понимания эволюции этих адаптивных процессов.

РАСПРОСТРАНЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ НЕФОТОХИМИЧЕСКОГО ТУШЕНИЯ В РАЗЛИЧНЫХ СИСТЕМАТИЧЕСКИХ (ЭВОЛЮЦИОННЫХ) ГРУППАХ

Наличие множественных регуляторных и, в частности, фотозащитных механизмов характерно для всех оксигенных фототрофных организмов, причём многие из них универсальны (т.е. характерны для всех или почти всех фототрофов). В то же время при сравнении между собой крупных эволюционных групп можно видеть, что есть и определённая специфичность в выборе механизмов представителями разных групп организмов. Выше мы говорили об антенно-подобных белках LhcSR и PsbS, ответственных за тушение: прямое НФТ в случае LhcSR и косвенное – в случае PsbS. Однако распространение этих белков и, следовательно, LhcSR- и PsbS-зависимого тушения существенно различно. LhcSR распространён среди водорослей (у большинства организмов, принадлежащих к линии красных водорослей, гомологичные LhcSR белки обозначают LHCX), а также встречается у мхов, но утерян у высших растений. Наоборот, PsbS является характерным белком наземных (высших) растений и наиболее близких к ним харовых водорослей, но отсутствует у большинства других групп водорослей [30, 102, 103]. Ещё недавно считалось, что хотя ген этого белка и присутствует в модельной зелёной водоросли (Chlorophyta) C. reinhardtii, но сам белок в ней не экспрессируется или, по крайней мере, не накапливается [102]. Лишь в 2016 г. одновременно две группы обнаружили у C. reinhardtii и стресс-индуцированную дифференциальную экспрессию PsbS-кодирующих генов psbs1 и psbs2 [104], и сам белок [104, 105]. Позже временное образование этого белка и индукцию его экспрессии обнаружили в ходе суточных изменений интенсивности освещения культуры C. reinhardtii [106]. Однако во всех случаях, в отличие от LhcSR, появление PsbS и его транскриптов было относительно кратковременным (часы), что заставило исследователей сделать вывод лишь о вспомогательной функции и не слишком существенной роли PsbS в тушении у этого организма [104, 105]. Незначительные суточные колебания экспрессии LhcSR- и PsbS-кодирующих генов, соответствующие суточным колебаниям температуры и освещённости, также были обнаружены у Ulva prolifera [107].

Наконец, недавно нами была обнаружена долговременная (сохраняющаяся в течение нескольких суток) стресс-индуцированная дифференциальная экспрессия PsbS-кодирующего гена у зелёной микроводоросли L. incisa [108]. Столь длительное и значительное по величине (на 3–4 порядка) возрастание количества транскриптов этого белка может свидетельствовать о его существенной и самостоятельной роли в индукции НФТ по крайней мере у некоторых представителей Chlorophyta. Все эти последние данные существенно расширяют распространение PsbS среди оксигенных фототрофов и удревняют историю его фотозащитной функции в растительном мире.

Необходимо также отметить, что недавно было сообщение об обнаружении дифференциальной экспрессии PsbS у красной водоросли Kappaphycus alvarezii [109]. Кодирующая последовательность гена, любезно предоставленная нам авторами, обнаруживает заметное сходство с последовательностями psbs зелёных водорослей. Однако в других красных водорослях обнаружить гомологичный ген нам пока не удалось. В соответствии с существующими сегодня представлениями, PsbS присутствует только в «зелёной линии» растений (Viridiplantae) [103], в то время как у красных водорослей, антенны которых содержат фикобилин, а не Хл [110], функция PsbS как индуктора НФТ лишена смысла. Если в будущем присутствие гомологов psbs в различных представителях красных водорослей (Rhodophyta) подтвердится, то это будет поворотным моментом в развитии наших представлений об эволюции функции этого белка.

Несмотря на различные механизмы, которыми LhcSR и PsbS индуцируют тушение флуоресценции, в обоих случаях сигналом для индукции НФТ служит продукт световых реакций – закисление тилакоидного люмена. В цианобактериях (в значительной их части, хотя не во всех), для которых характерна другая система светосбора с использованием развёрнутых тетрапиррольных пигментов, локализованных в крупных растворимых белковых комплексах – фикобилисомах – используется и иная молекулярная система НФТ. Сигналом для её запуска служит непосредственно высокая освещённость, а главным участником – оранжевый каротиноидный белок (OCP) и связанный с ним кетокаротиноид (эхиненон, гидроксиэхиненон или кантаксантин) [111]. При этом уровень чувствительности триггерного механизма к интенсивности света определяется в этом случае очень низким квантовым выходом фотоконверсии OCP в фотоактивную форму; в результате фотоконверсия происходит только при высокой интенсивности излучения [112]. OCP-зависимый механизм НФТ характерен даже для наиболее примитивной из ныне существующих группы цианобактерий, Gloeobacteria, сохранившей многие предковые характеристики [111]. Удивительно, что у красных водорослей, также обладающих фикобилисомами, этот механизм не сохранился (ocp-подобных генов в них не обнаружено) [113], и действуют pH-зависимые механизмы НФТ [114, 115].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

НФТ – один из основных механизмов защиты ФСА от опасной избыточной световой энергии. Мы рассмотрели здесь только одну из его составляющих – так называемое энергозависимое тушение (qE), и только один из его аспектов – роль фотозащитной субъединицы ФС2, белка PsbS. Несмотря на интенсивные исследования в этой области в течение всех 25 лет с момента открытия НФТ-индуцирующего эффекта PsbS [50] и обилие новых данных, кажется, пока ещё трудно интегрировать их в общую непротиворечивую картину. Так, механизм непрямой PsbS-зависимой активации НФТ – через влияние на pK_a люменальных протонируемых остатков в LHCII и/или малых антеннах [92], через изменение конформации связанных с ними пигментов [93] или через изменение подвижности LHCII [74] – остаётся гипотетическим и требующим способа согласовать его с недавно сформулированной моделью тушения, регулируемого изменениями полярности окружения [45]. Несмотря на, казалось бы, давно и надёжно показанную роль мономерных малых антенн в НФТ как центров тушения [46, 116], взаимодействующих с PsbS [117], недавние данные о НФТ в штаммах A. thaliana, дефицитных по этим антеннам, оказываются основанием делать вывод о том, что они не играют никакой роли в qE [68]. Возможно, что наличие подобных взаимоисключающих данных о механизмах НФТ говорит о том, что все они в той или иной мере могут реализовываться in vivo; система же в целом обладает достаточно высокой «буферной ёмкостью» своих защитных механизмов, чтобы отключение одного из них в модельной системе не влияло бы существенно на общий уровень НФТ.

Наконец, требует осмысления тот парадоксальный факт, что основным участником НФТ оказался PsbS – именно тот представитель суперсемейства антенных (т.е. хлорофилл-связывающих) белков, который лишён каких бы то ни было пигментов, а вместе с ними – и возможности непосредственно осуществлять тушение. Можно предположить, что это ещё один кандидат в копилку примеров несовершенства эволюционных решений, которые основываются на использовании «подручного» материала и связаны со сменой функций.

За пределами подробного рассмотрения остались фотофизические механизмы тушения, связанные с взаимодействием пигментов (Хл и Кар) в пикосекундных масштабах времени. Несмотря на длительную историю исследования этих механизмов, консенсус в их понимании тоже ещё не достигнут. Мы оставили в стороне и другие фотозащитные механизмы, также сокращающие время жизни возбуждённого состояния Хл в фотосинтетической антенне и потому полноправно относимые к НФТ. Это в первую очередь механизм, модулирующий интенсивность qE за счёт синтеза дополнительного количества Зеа и обозначаемый qZ [118]. Ключевыми для этого механизма являются ферменты виолаксантин-деэпоксидаза и зеаксантин-эпоксидаза, осуществляющие виолаксантиновый цикл и отвечающие за квазистационарную концентрацию Зеа [119]. Это также механизм, до сих пор не получивший удовлетворительного названия в русскоязычной литературе и известный как «переход состояний» (state transition, qT). Триггером для этого механизма служит не трансмембранная ΔpH, а перевосстановление пула пластохинонов на акцепторной стороне ФС2 [120], которое активирует киназу, фосфорилирующую комплексы LHCII. В результате они теряют сродство к ФС2 и мигрируют в менее гидрофобную область, богатую комплексами ФС1 [121], в контакте с которой находят эффективный сток поглощённой энергии света. Можно предположить, что многообразие этих защитных механизмов, так же как и разнообразие возможных путей реализации одного только энергозависимого тушения, говорит о важности этой функции и стремлении фотосинтетического организма использовать любой механизм защиты ФСА, оказавшийся достаточно эффективным.

Вклад авторов. Анализ литературы – А.Р. и В.П.; концепция обзора, написание текста – В.П.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 24-24-00195).

Благодарности. Мы благодарны профессору Jianguo Liu и доктору Qianqian Li за предоставленную кодирующую последовательность гена красной водоросли Kappaphycus alvarezii, гомологичного psbs зелёных водорослей. Авторы признательны ЦКП «Фенотипирование фототрофных организмов» МГУ имени М.В. Ломоносова, на оборудовании которого были получены собственные экспериментальные результаты авторов, обсуждаемые в данном обзоре.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в финансовой или какой-либо иной сфере.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

Sobre autores

V. Ptushenko

Lomonosov Moscow State University; N. M. Emanuel Institute of Biochemical Physics of the Russian Academy of Sciences

Autor responsável pela correspondência
Email: ptush@belozersky.msu.ru

A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology

Rússia, 119992 Moscow; 119334 Moscow

A. Razjivin

Lomonosov Moscow State University

Email: ptush@belozersky.msu.ru

A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology

Rússia, 119992 Moscow

Bibliografia

Arquivos suplementares