Role of mod(mdg4)-67.2 protein in interactions between su(hw)-dependent complexes and their recruitment to chromatin

Capa

Citar

Texto integral

Resumo

Su(Hw) belongs to a class of proteins that organize chromosome architecture, determine promoter activity, and participate in the formation of boundaries/insulators between regulatory domains. This protein contains a cluster of 12 zinc fingers of the C2H2 type, some of which are responsible for binding to the consensus site. The Su(Hw) protein forms a complex with the Mod(mdg4)-67.2 and the CP190 proteins, where the last one binds to all known Drosophila insulators. To further study the functioning of Su(Hw)-dependent complexes, we used the previously described su(Hw)E8 mutation, with inactive seventh zinc finger, which produced the mutant protein losing the ability to bind to the consensus site. The present work shows that the Su(Hw)E8 protein continues to directly interact with the CP190 and Mod(mdg4)-67.2 proteins. Through interaction with Mod(mdg4)-67.2, the Su(Hw)E8 protein can be recruited into Su(Hw)-dependent complexes formed on chromatin and enhance their insulator activity. Our results demonstrate that DNA-unbound Su(Hw)-dependent complexes can be recruited to Su(Hw)-binding sites through specific protein-protein interactions that are stabilized by Mod(mdg4)-67.2.

Texto integral

ВВЕДЕНИЕ

У высших эукариот регуляция экспрессии генов усложняется вследствие дифференцировки клеток в процессе эмбрионального развития. Специализация клеток определяется экспрессией различных комбинаций транскрипционных факторов, которые кодируются обширной группой генов развития, контролирующих дифференцировку [1]. Другая большая группа генов кодирует белки «домашнего хозяйства», которые необходимы для функционирования всех клеток. У Drosophila гены домашнего хозяйства группируются в кластерах, и все их регуляторные элементы обычно находятся в непосредственной близости от регулируемых ими промоторов. В отличие от генов домашнего хозяйства гены развития обычно имеют сложные протяжённые регуляторные системы, состоящие из большого количества энхансеров, каждый из которых определяет экспрессию гена в конкретной группе клеток и на протяжении определённого временного промежутка [2–4]. Энхансеры могут стимулировать работу промотора, находясь от него на дистанциях, достигающих в некоторых случаях сотен тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Регуляция взаимодействий между энхансерами и промоторами осуществляется особой группой регуляторных элементов, названных инсуляторами [5–7]. Определённые комбинации инсуляторов могут взаимодействовать между собой, формируя хроматиновые домены, которые усиливают/блокируют дистанционные взаимодействия между энхансерами и промоторами [5, 8, 9].

У Drosophila с промоторами генов и инсуляторами связываются архитектурные белки, характерной особенностью которых являются кластеры, состоящие из пяти и более цинковых пальцев (zinc fingers, ZF) типа С2Н2 [10, 11]. Показано, что с помощью 4–5 С2Н2-доменов архитектурные белки специфично связываются с протяжёнными мотивами 12–15 п.н. У дрозофилы наиболее хорошо описан архитектурный белок Su(Hw) (Suppressor of Hairy-wing), который имеет около 2000 геномных сайтов связывания [12–15]. Исходно Su(Hw) был открыт как инсуляторный белок, который блокирует взаимодействия между энхансерами и промоторами генов, связываясь с 12 сайтами в составе ретротранспозона gypsy [12–14]. В дальнейшем было показано, что Su(Hw) участвует в формировании промоторов и способен репрессировать транскрипцию с некоторых из них [15, 16]. В центре белка Su(Hw) локализован кластер, состоящий из 12 ZF С2Н2, которые связываются с консенсусной последовательностью [17]. На N-конце белка Su(Hw) находятся два консервативных участка, взаимодействующих с ВТВ-доменом (ВТВ – bric-a-brac, tramtrack, and broad complex) белка СР190, который участвует в формировании активных инсуляторов и промоторов генов домашнего хозяйства [18, 19]. На С-конце белка картирован домен, взаимодействующий с одной из 30 изоформ белка Mod(mdg4) (Modifier of mdg4) [20–22]. Все изоформы Mod(mdg4) имеют на N-конце ВТВ-домен типа TTK (Tramtrack group), способный формировать гексамеры [23, 24]. Изоформа Mod(mdg4)-67.2 имеет уникальный С-конец, взаимодействующий исключительно с С-концевым доменом белка Su(Hw). Кроме того, обнаружено, что в состав Su(Hw)-зависимых комплексов могут входить и другие белки: HIPP1 (HP1 and insulator partner protein 1), который взаимодействует с тем же С-концевым районом Su(Hw), что и Mod(mdg4)-67.2 [25–27], ENY2 (Enhancer of yellow 2), взаимодействующий с 11-м и 12-м ZF белка Su(Hw) [28], и РНК-связывающие белки [29, 30]. Все изоформы белка Mod(mdg4), как и белок СР190, сумолируются и в результате множественных белок-белковых взаимодействий формируют в ядре спеклы [31–33]. Предполагается, что мультимеризация ВТВ-доменов и взаимодействие между белками SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) формируют ядро спеклов, к которым присоединяются белки-«пассажиры», такие как Su(Hw) и другие архитектурные белки. Согласно предложенной модели, спеклы функционируют как резервуары архитектурных белков, которые связываются с новой ДНК в процессе её репликации [32, 33].

В представленной работе мы исследовали способность мутантного белка Su(Hw)E8, который самостоятельно не связывается с ДНК, рекрутироваться на Su(Hw)-зависимые сайты хроматина. Точечная замена гистидина в положении 459 на тирозин в мутанте Su(Hw)E8 [34] приводит к разрушению седьмого домена С2Н2, необходимого для связывания белка с хроматином [17]. В результате Su(Hw)E8 не может связаться с Su(Hw)-связывающими сайтами in vitro и не обнаруживается на политенных хромосомах [17]. Однако мы продемонстрировали, что в присутствии связывающегося с хроматином мутантного варианта Su(Hw) c делетированным N-концом (Su(Hw)ΔN) белок Su(Hw)E8 рекрутируется на Su(Hw)-зависимые инсуляторные сайты. Эффективное связывание Su(Hw)E8 опосредовано белком Mod(mdg4)-67.2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Создание рекомбинантных генетических конструкций.

Все конструкции для работы в дрожжевой двугибридной системе (ДДС) были созданы на основе вектора pGBT9, содержащего ДНК-связывающий домен дрожжевого белка GAL4 («Clontech», Пало-Альто, Калифорния, США).

Для создания конструкции pGBTSu(Hw)E8 про-дукт ПЦР 5′-ggaacagcacaagtcacgtg-3′/5′-caccaatgcagaaaacttcttgtc-3′ обрабатывали эндонуклеазой BglII, а продукт ПЦР 5′-gcccttaaaaagTatcgacgct-3′/5′-aatccgtgcgttccataat-3′ – эндонуклеазой EagI. В качестве матрицы для ПЦР использовали кДНК Su(Hw). Полученные фрагменты ДНК совместно клонировали в плазмиду pGBTSu(Hw), обработанную BglII и EagI.

Для создания конструкции pGBTSu(Hw)E8Δ114 фрагмент XhoI-Afl II, содержащий делецию 114 а.о., из pGBTSu(Hw)Δ114 клонировали в плазмиду pGBTSu(Hw)E8, обработанную XhoI и Afl II.

Для создания конструкции pGBTSu(Hw)E8Δ283 фрагмент EagI-SalI, содержащий делецию 17 а.о., из pGBTSu(Hw)Δ283 клонировали в плазмиду pGBTSu(Hw)E8, обработанную EagI и SalI.

Плазмиды pGBTSu(Hw), pGBTSu(Hw)Δ283, pGADMod(mdg4)-67.2 и pGADCP190 были получены и описаны ранее [18, 20].

Дрожжевая двугибридная система.

Анализ взаимодействий между белками в ДДС проводили с использованием плазмид и протоколов от «Clontech». Плазмиды трансформировали в штамм дрожжей pJ69-4A литий-ацетатным методом, как описано производителем, и высевали на среду без триптофана и лейцина. Через 3 дня роста при 30 °С клетки пересевали на селективные среды без триптофана, лейцина, гистидина и аденина и сравнивали рост дрожжевых колоний ещё через 2–3 дня. В качестве отрицательного контроля тестировали взаимодействие производных белка Su(Hw), экспрессировавшихся в векторе pGBT9, с вектором pGAD24. Положительным контролем служили взаимодействия полноразмерного белка Su(Hw) с белками Mod(mdg4)-67.2 или СР190, описанные ранее [18, 20]. Каждый эксперимент повторяли трижды.

Фенотипический анализ в трансгенных линиях дрозофил.

Всех мух содержали при температуре 25 °С на стандартной дрожжевой среде (Bloomington Drosophila Stock Center). Эффекты различных комбинаций мутаций оценивались двумя исследователями независимо. Уровень выраженности фенотипов yellow и cut оценивали в возрасте 3–5 дней у самцов, развивающихся при 25 °С. Изменения в экспрессии гена yellow (в теле и в крыльях) оценивали по пятибалльной шкале, где 5 соответствует пигментации дикого типа; 2 – уровню пигментации, ассоциированному с мутацией у2; 3 и 4 – частичной активации базовой транскрипции; 1 – отсутствию экспрессии. В качестве эталона использовали мух, у которых экспрессия аллеля yellow была охарактеризована ранее. Изменения в экспрессии гена cut оценивали, подсчитывая количество вырезок, возникающих по краю крыловой пластины. В качестве эталона использовали мух дикого типа и мух, несущих аллель ct6. Репрезентативные формы крыльев, представленные на рис. 2, б, были выбраны как «средние» из серии крыльев, расположенных в порядке возрастания выраженности их мутантного фенотипа. В каждой трансгенной линии оценивали фенотип не менее чем 50 мух.

Трансгенные линии Su(Hw)+, Su(Hw)Δ62, Su(Hw)Δ52, Su(Hw)Δ114 и Su(Hw)J, тагетированные эпитопом 3хFLAG, были получены и описаны ранее [18, 35]. Введение в трансгенные линии мутации mod(mdg4)u1 или комбинаций мутаций su(Hw)v/su(Hw)2 и su(Hw)v/su(Hw)E8 проводили в соответствии со схемой, описанной ранее [36]. Все детали генетических скрещиваний могут быть предоставлены по запросу.

Иммуноокрашивание политенных хромосом.

Личинок дрозофилы 3-го возраста выращивали при 18 °С в стандартных условиях. Окрашивание политенных хромосом проводили в соответствии с ранее описанной методикой [37]. Использовали следующие первичные антитела: анти-Su(Hw) (кролик) 1 : 300 и анти-FLAG (мышь) 1 : 50. Применяемыми вторичными антителами были FITC-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit 1 : 200 и Cy5-AffiniPure Donkey Anti-Mouse 1 : 200 («Jackson ImmunoResearch», США). Анализ проводился с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Axio Observer.Z1 («Zeiss», Германия), в который встроена система микроскопии со структурированным освещением OptiGrid («Qioptiq», Великобритания). Для обработки изображений использовали программу Fiji.

Иммунопреципитация хроматина.

Выделение хроматина из дрозофил на куколочной стадии развития и последующую иммунопреципитацию хроматина проводили в соответствии с методикой, описанной ранее [35]. Для иммунопреципитации использовали следующие антитела: анти-Su(Hw) (кролик) 1 : 200 и анти-FLAG (мышь) 1 : 300. Количество иммунопреципитированной ДНК определяли с помощью количественной ПЦР с использованием красителя SYBR green («Bio-Rad», США, Cat# 170-8882). Последовательности праймеров, использованных в ПЦР:

62D fw – 5′-TTTGGGCTTGGTGAGAACAG-3′

62D rev – 5′-TGATACCAGGCGAACAGAAATC-3′

50A fw – 5′-ATACAAAGTGGTTTCAGCCAAGAAG-3′

50A rev – 5′-TTGATAAATAGTCCAGCACGCATAC-3′

87E fw – 5′-GGATGTTACA TTGAGAGTGCTTAGG-3′

87E rev – 5′-TTTGCGTTTCGGCTGCTGTC-3′

1A2 fw – 5′-ACCACACATCAGTCATCGTGT-3′

1A2 rev – 5′-CTTCGTCTACCGTTGTGC-3′

gypsy fw – 5′-TTCTCTAAAAAGTATGCAGCACTT-3′

gypsy rev – 5′-CACGTAATAAGTGTGCGTTGA-3′

ras fw – 5′-GAGGGATTCCTGCTCGTCTTCG-3′

ras rev – 5′-GTCGCACTTGTTACCCACCATC-3′

Каждый эксперимент выполняли в трёх биологических повторах.

Антитела.

В работе использовали поликлональные антитела к N-концевому домену белка Su(Hw), полученные и описанные ранее [32, 33], и моноклональные антитела к эпитопу FLAG («Sigma-Aldrich», Cat# F 1804).

Статистический анализ проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Белок Su(Hw)E8 способен напрямую взаимодействовать с белками Mod(mdg4)-67.2 и CP190. Ранее мы показали, что мутантный белок Su(Hw)f, в котором инактивирован десятый ZF, утрачивает способность взаимодействовать с белком СР190 (Centrosomal protein 190kD) in vitro [35]. Чтобы проверить, как мутация в седьмом ZF белка Su(Hw)E8 влияет на взаимодействие с двумя другими компонентами Su(Hw)-зависимого комплекса, белками CP190 и Mod(mdg4)-67.2, мы использовали ДДС. На основе вектора pGBT9 были созданы 3 конструкции. Первая экспрессировала в дрожжах полноразмерный белок Su(Hw)E8, вторая – его производную Su(Hw)E8Δ114 с делецией района 88–202 а.о., взаимодействующего с белком СP190, и третья – производную Su(Hw)E8Δ283, в которой делетирован район взаимодействия с белком Mod(mdg4)-67.2 от 760 до 778 а.о. (рис. 1, а). Затем мы протестировали прямые взаимодействия вариантов Su(Hw)E8 с полноразмерными белками CP190 и Mod(mdg4)-67.2, которые экспрессировались в векторе pGAD24. Белок Su(Hw)E8 взаимодействовал со всеми инсуляторными белками так же, как белок дикого типа. Белок Su(Hw)E8Δ114 утрачивал способность взаимодействовать с СP190, а белок Su(Hw)E8Δ283 – с Mod(mdg4)-67.2 (рис. 1, а). Следовательно, мутация в седьмом ZF не влияет на взаимодействие белка Su(Hw)E8 с остальными компонентами инсуляторного комплекса. Поэтому через взаимодействие с белками CP190 и Mod(mdg4)-67.2 белок Su(Hw)E8 может рекрутироваться на хроматин.

 

Рис. 1. Производные белка Su(Hw), использованные в работе. a – Схематичное изображение полноразмерного белка Su(Hw). Обозначения доменов: CID – домен, взаимодействующий с СР190; ZF – цинковые пальцы; LZ – лейциновая молния. На схеме показаны районы взаимодействия с белками Mod(mdg4)-67.2 (Mod-67.2) и СР190, которые изображены в виде овалов. Вертикальная стрелка указывает на мутацию su(Hw)E8. Скобкой под схемой указан район белка, к которому были получены антитела. Цифрами обозначены аминокислотные остатки, ограничивающие домены и производные формы. Слева указаны названия производных, размер производных обозначен отрезками, пунктирные линии обозначают внутренние делеции, звёздочкой обозначена мутация su(Hw)E8. Справа от схем приведены результаты, полученные в ДДС. «+» – наличие взаимодействия, «–» – отсутствие взаимодействия. б – Делеционные производные, использованные в генетических экспериментах и в иммуноокрашивании политенных хромосом

 

Белок Su(Hw)E8 восстанавливает инсуляторную функцию мутантных белков Su(Hw), взаимодействие которых c СР190 нарушено.

Для исследования Su(Hw)-зависимой инсуляции обычно используют две модельные системы, которые получены в результате интеграции мобильного элемента gypsy в локусы yellow (y2) и cut (ct6).

Ген yellow отвечает за пигментацию кутикулярных структур дрозофилы [38]. В диком типе тело, крылья и щетинки мух окрашены в тёмный цвет. В аллеле y2 ретротранспозон gypsy встроился между энхансерами тела и крыльев и промотором гена yellow (рис. 2, а). В этом случае инсулятор Su(Hw) полностью блокирует активацию экспрессии yellow в теле и крыльях, в результате чего тело и крылья мутантных мух приобретают жёлтую окраску (рис. 2, б). Однако щетинки мух остаются пигментированными, т.к. энхансер щетинок расположен в интроне гена [39].

 

Рис. 2. Влияние белка Su(Hw)E8 на gypsy-зависимую инсуляцию. а – Схематичное изображение аллелей y2 и ct6. Экзоны генов yellow и cut изображены в виде прямоугольников. Сайты инициации транскрипции генов указаны стрелками. Ретротранспозон gypsy изображён в виде треугольника. Прямоугольники на его концах обозначают длинные концевые повторы (ДКП), ориентация которых указана стрелками. Обозначения: Su(Hw) – инсулятор Su(Hw); Эн-К – энхансер крыльев, Эн-Т – энхансер тела; Эн-Щ – энхансер щетинок; Эн-Кп – энхансер крыловой пластины. б – Влияние производных белка Su(Hw) на активность инсулятора gypsy в аллелях y2 и ct6 на фоне мутаций su(Hw)v/su(Hw)2 (v/2) и su(Hw)v/su(Hw)E8 (v/E8). Названия линий, использованных для фенотипического анализа, указаны в правой колонке: wt – y2ct6, Su(Hw)+ – трансген экспрессировал полноразмерный белок. Схемы и названия остальных производных приведены на рис. 1. Цифры в колонке y2 показывают уровень экспрессии гена yellow в кутикуле тела и крыльев. На фотографиях показаны изменения крылового фенотипа гена cut на различных мутантных фонах

 

В аллеле ct6 (рис. 2, а) gypsy находится между энхансером крыловой пластины и промотором гена cut, отвечающим за развитие края крыла, которые дистанцированы друг от друга на расстояние более 70 т.п.н. В этом случае инсулятор полностью блокирует крыловой энхансер, вследствие чего край крыла практически целиком обрезан и крыловые щетинки отсутствуют (рис. 2, б) [22, 40].

Белок CР190 связывается с двумя районами, 88–150 а.о. и 150–202 а.о., на N-конце белка Su(Hw) (рис. 1, а) [18]. C помощью генетических скрещиваний во вторую хромосому линии y2ct6;su(Hw)v/su(Hw)2 были интегрированы трансгены, экспрессирующие полноразмерный белок Su(Hw)+ и его производные: Su(Hw)Δ62 (делеция района 88–150 а.о.), Su(Hw)Δ52 (делеция района 150–202 а.о.) и Su(Hw)Δ114 (делеция обоих районов, взаимодействующих с CP190) (рис. 1, б). Сочетание мутаций su(Hw)v/su(Hw)2 инактивирует нативный белок Su(Hw), поэтому мы смогли проанализировать влияние мутантных белков на фенотип y2ct6 (рис. 2, б) [18].

Инактивация белка Su(Hw) в линии y2ct6; su(Hw)v/su(Hw)2 восстанавливала экспрессию yellow в аллеле y2 и экспрессию cut в аллеле ct6, демонстрируя, что связывание белка Su(Hw) имеет решающее значение для инсуляции. Введение трансгена Su(Hw)+ приводит к полному восстановлению инсуляции (рис. 2, б). Ранее мы показали, что белок СР190 также необходим для Su(Hw)-зависимой инсуляции [18]. В линиях с экспрессией белков Su(Hw)Δ62 и Su(Hw)Δ52, где связывание белка СР190 с Su(Hw)-зависимым комплексом было ослаблено, инсулятор полностью блокировал энхансеры тела и крыльев гена yellow (фенотип y2). Однако фенотип cut гораздо сильнее реагировал на недостаток СР190. В случае экспрессии белка Su(Hw)Δ52 инсуляция в аллеле ct6 ослабевала: по краю крыла присутствовали многочисленные, но отдельные вырезки, и часть щетинок развивалась. Белок Su(Hw)Δ62 демонстрировал лишь слабую инсуляторную активность: по краю крыла возникали 1–2 вырезки. В линии Su(Hw)Δ114 белок СР190 не связывался с инсуляторным комплексом. В результате инсуляторная активность не проявлялась: мухи имели крылья дикого типа, окраска кутикулярных структур также была близка к норме (рис. 2, б).

Затем мы изучили инсуляцию в линии y2ct6;su(Hw)v/su(Hw)E8 (рис. 2, б). В этом случае экспрессия белка Su(Hw)E8 не восстанавливала инсуляцию. Неожиданно оказалось, что инсуляция частично восстанавливается при введении в линию y2ct6;su(Hw)v/su(Hw)E8 трансгенов, экспрессирующих производные Su(Hw). В линии Su(Hw)Δ62 количество крыловых вырезок существенно возрастало, а в линии Su(Hw)Δ52 мухи имели крыловой фенотип, близкий к ct6. Даже в линии Su(Hw)Δ114 в аллеле ct6 проявлялась слабая инсуляция: появлялись отдельные крыловые вырезки. При этом инсуляция в аллеле y2 восстанавливалась практически полностью (рис. 2, б). Анализ полученных результатов позволяет предположить, что делеционные производные Su(Hw) рекрутируют на сайты инсулятора gypsy белок Su(Hw)E8, способный связывать белок СР190, что приводит к восстановлению инсуляции.

Поскольку белок Su(Hw)Δ114 не взаимодействует с белком CР190, то привлечение Su(Hw)E8 на Su(Hw)-зависимые сайты хроматина может осуществляться через белок Mod(mdg4)-67.2, который связывается с С-концевым районом Su(Hw) (716–892 а.о.), необходимым для инсуляции и репрессии транскрипции [20, 21]. Чтобы протестировать роль Mod(mdg4)-67.2 в рекрутировании белка Su(Hw)E8, мы использовали трансген Su(Hw)J, экспрессирующий мутантный белок с делецией 144 С-концевых а.о. [16]. В мутантном белке Su(Hw)J (1–801 а.о.) делетирован район взаимодействия с Mod(mdg4)-67.2, поэтому Su(Hw)J связывается только с СР190 (рис. 1, б). На мутантном фоне y2ct6;su(Hw)v/su(Hw)2 фенотипы мух из линий, экспрессирующих белки Su(Hw)J и Su(Hw)Δ114, схожи: экспрессия yellow и cut восстанавливается (рис. 2, б). Однако в линии Su(Hw)J на фоне su(Hw)v/su(Hw)E8 восстановления инсуляции не происходило. Полученные данные согласуются с предполагаемой ролью белка Mod(mdg4)-67.2 в привлечении белка Su(Hw)E8 на Su(Hw)-зависимые сайты хроматина.

Белок Mod(mdg4)-67.2 опосредует рекрутирование белка Su(Hw)E8 на сайты связывания белка Su(Hw)ΔN с политенными хромосомами.

Чтобы подтвердить рекрутирование белка Su(Hw)E8 на сайты хроматина через белок Mod(mdg4)-67.2, мы использовали трансгенные линии, экспрессирующие производную Su(Hw)ΔN с делецией N-концевого домена Su(Hw) от 1 до 238 а.о., тагетированную эпитопом 3хFLAG (рис. 1, б) [20]. Производная Su(Hw)ΔN, как и Su(Hw)Δ114, взаимодействует только с белком Mod(mdg4)-67.2. На политенных хромосомах личинок дрозофилы из линии y2ct6;Su(Hw)ΔN-FLAG/Su(Hw)ΔN-FLAG;su(Hw)v/su(Hw)2 белок Su(Hw)ΔN можно идентифицировать с помощью антител к FLAG, но не с помощью антител к N-концевому домену (1–150 а.о.) белка Su(Hw) (рис. 1, рис. 3). В линии y2ct6 сайты инсерции ретротранспозона gypsy находятся на дистальном по отношению к хромоцентру конце хромосомы Х. Иммуноокрашивание антителами к FLAG показало, что, в сравнении с полноразмерным белком Su(Hw)+, белок Su(Hw)ΔN связывается с хроматином менее эффективно, так как стабильность связывания Su(Hw) опосредуется белком СP190 (рис. 3) [18].

 

Рис. 3. Связывание белка Su(Hw)E8 с политенными хромосомами. Иммуноокрашивание политенных хромосом слюнных желёз личинок третьего возраста из линий y2ct6 (wt), y2ct6 su(Hw)v/su(Hw)2 (v/2), y2ct6;su(Hw)v/su(Hw)E8 (v/E8), y2ct6;su(Hw)vmod(mdg4)u1/su(Hw)E8mod(mdg4)u1 (v-m/E8-m) и из тех же линий, экспрессирующих белок Su(Hw)ΔN-FLAG или Su(Hw)+-FLAG. В экспериментах использовали антитела к эпитопу FLAG (αFLAG) и к N-концевому домену белка Su(Hw) (αSu(Hw)-N). Стрелки указывают на инсерцию gypsy на конце хромосомы Х

 

В линии y2ct6;su(Hw)v/su(Hw)E8, как и в линии y2ct6;su(Hw)v/su(Hw)2, антитела к N-концевому домену Su(Hw) не окрашивали Su(Hw)-связывающие сайты. Однако на мутантном фоне su(Hw)v/su(Hw)E8 при экспрессии производной Su(Hw)ΔN эти антитела эффективно окрашивали многочисленные сайты связывания Su(Hw), в том числе сайты gypsy на конце хромосомы Х (рис. 3). Следовательно, антитела к N-концевому домену идентифицировали полноразмерный белок Su(Hw)E8, который рекрутировался на хроматин через взаимодействие с белком Su(Hw)ΔN.

Введение мутации mod(mdg4)u1, полностью инактивирующей белок Mod(mdg4)-67.2, не изменило окрашивание антителами к FLAG в линиях, экспрессирующих Su(Hw)ΔN. Тем не менее в линии y2ct6;Su(Hw)ΔN-FLAG/Su(Hw)ΔN-FLAG; su(Hw)vmod(mdg4)u1/su(Hw)E8mod(mdg4)u1 окрашивание антителами к N-концевому домену Su(Hw) полностью исчезло (рис. 3). Таким образом, в отсутствии белка Mod(mdg4)-67.2 белок Su(Hw)ΔN утрачивал способность взаимодействовать с Su(Hw)E8 и рекрутировать его на свои сайты связывания.

Белок Mod(mdg4)-67.2 опосредует ассоциацию белка Su(Hw)E8 с сайтами связывания белка Su(Hw)ΔN.

Для дальнейшего подтверждения полученных результатов с помощью иммунопреципитации хроматина мы протестировали уровень связывания белка Su(Hw)E8 в линии y2ct6;su(Hw)v/ su(Hw)E8 с пятью наиболее исследованными Su(Hw)-зависимыми инсуляторами [41, 42]. Для детекции белка Su(Hw)E8 использовали антитела к N-концевому домену Su(Hw). Как ожидалось, белок Su(Hw) не детектировался на тестируемых сайтах ни на мутантном фоне su(Hw)v/su(Hw)2, ни на фоне su(Hw)v/su(Hw)E8 (рис. 4, а).

 

Рис. 4. Связывание белка Su(Hw)E8 с SBS. a – Тестирование связывания белка Su(Hw) в линиях y2ct6 с помощью антител к N-концевому домену Su(Hw). б – Тестирование связывания белка Su(Hw)ΔN в линиях y2ct6;Su(Hw)ΔN-FLAG/Su(Hw)ΔN-FLAG с помощью антител к эпитопу FLAG. в – Тестирование связывания белка Su(Hw)E8 в линиях y2ct6;Su(Hw)ΔN-FLAG/Su(Hw)ΔN-FLAG с помощью антител к N-концевому домену Su(Hw). Кодирующую область гена ras64B (ras) использовали как контроль, не содержащий сайты связывания белкa Su(Hw). Процент обогащения иммунопреципитированной ДНК (ось Y) рассчитывали относительно количества загруженной ДНК. Внизу (ось Х) указаны названия выбранных Su(Hw)-зависимых cайтов. Показано стандартное отклонение для трёх независимых биологических повторностей. Уровни значимости (критерий Стьюдента) p < 0,05. Обозначения: wt – дикий тип; v-m/2-m – сочетание мутаций su(Hw)vmod(mdg4)u1/su(Hw)2mod(mdg4)u1; IgG – иммуноглобулины. Остальные обозначения – как на рис. 2 и 3

 

Затем, используя антитела к FLAG, мы продемонстрировали, что в линиях, экспрессирующих производную Su(Hw)ΔN-FLAG, белок Su(Hw)ΔN связывается со всеми SBS (Su(Hw) binding sites, сайты связывания белка Su(Hw)) как в присутствии, так и в отсутствии белка Mod(mdg4)-67.2 (рис. 4, б). Введение мутации mod(mdg4)u1 несколько снижало уровень связывания Su(Hw), поскольку Mod(mdg4)-67.2, так же как и СР190, стабилизирует ассоциацию инсуляторного комплекса с SBS [20].

Анализ уровня связывания Su(Hw) в линии y2ct6;Su(Hw)ΔN-FLAG/Su(Hw)ΔN-FLAG;su(Hw)v/su(Hw)2 показал, что белок отсутствует на четырёх из пяти сайтов (рис. 4, в). Введение в эту линию мутации mod(mdg4)u1 не влияло на связывание Su(Hw). Присутствие некоторого количества Su(Hw) на наиболее эффективно связывающем сайте 62D объясняется остаточной экспрессией в аллеле su(Hw)2 [34]. Это ещё раз подтверждает, что антитела к N-концевому домену Su(Hw) способны узнавать нативный белок, но не мутантную производную Su(Hw)ΔN.

В линии y2ct6;Su(Hw)ΔN-FLAG/Su(Hw)ΔN-FLAG; su(Hw)v/su(Hw)E8 уровень связывания белка Su(Hw) на всех тестируемых сайтах возрастал в сравнении с мутантным фоном su(Hw)v/su(Hw)2 в 1,5–3 раза (рис. 4, в). При введении мутации mod(mdg4)u1 Su(Hw)E8 переставал связываться с четырьмя сайтами, а на сайте 62D его связывание снижалось до уровня мутантного фона su(Hw)v/su(Hw)2. Полученные данные полностью подтверждают, что белок Mod(mdg4)-67.2 играет решающую роль во взаимодействиях между комплексом, формирующимся на Su(Hw)-зависимых сайтах, и белком Su(Hw)E8.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты демонстрируют, что через взаимодействие с белком Mod(mdg4)-67.2 мутантный белок Su(Hw)E8, не способный связываться с консенсусной последовательностью ДНК, может не только рекрутироваться на SBS, но и усиливать инсуляторную активность Su(Hw)-зависимых комплексов. Согласно предложенной ранее модели [33], спеклы являются местом формирования белковых комплексов, которые в дальнейшем связываются с ДНК. Изоформы Mod(mdg4) и белок CP190 принимают участие в формировании спеклов и привлекают в их состав архитектурные белки, в том числе белок Su(Hw). Можно предположить, что в спеклах происходит образование комплекса Su(Hw)ΔN-Su(Hw)E8/CP190, который стабилизируется мультимеризацией белка Mod(mdg4)-67.2, взаимодействующего со всеми компонентами этого комплекса. В результате последующего связывания комплекса с SBS белки Su(Hw)E8/СР190 также рекрутируются на них, что приводит к частичному восстановлению активности инсулятора gypsy, зависящей от белка СР190.

Полученные результаты позволяют предположить, что белок Su(Hw) способен рекрутироваться на хроматиновые Su(Hw)-связывающие сайты без непосредственного взаимодействия с консенсусной последовательностью ДНК. Необходимо отметить, что почти во всех регуляторных элементах SBS представлены в единичном количестве [41]. Рекрутирование на единичные SBS не связанного с хроматином белка Su(Hw) может увеличивать эффективность привлечения белков-партнёров, тем самым повышая функциональную активность Su(Hw)-зависимого инсулятора. Также белки Su(Hw), не ассоциированные с ДНК, в процессе репликации могут связываться со вновь синтезируемой ДНК, конкурируя с нуклеосомами, и таким образом эффективно воспроизводить инсуляторы в процессе деления клетки (рис. 5). Для экспериментального подтверждения предложенной модели необходимы дальнейшие исследования механизмов формирования инсуляторных комплексов в спеклах и на хроматине.

 

Рис. 5. Модель рекрутирования Su(Hw)-зависимых комплексов на SBS в процессе репликации ДНК

 

Вклад авторов. А.К. Головнин – концепция и руководство работой; Л.С. Мельникова, В.В. Молодина, А.К. Головнин, П.Г. Георгиев – проведение экспериментов; Л.С. Мельникова, А.К. Головнин, П.Г. Георгиев – обсуждение результатов исследования; А.К. Головнин, Л.С. Мельникова, П.Г. Георгиев – написание текста; А.К. Головнин, П.Г. Георгиев – редактирование текста статьи.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда. Все эксперименты, за исключением фенотипического анализа трансгенных линий, выполнены за счёт гранта № 21-14-00205. Фенотипический анализ выполнен за счёт гранта № 19-74-30026-P.

Благодарности. В работе использовали оборудование Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ИБГ РАН.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

×

Sobre autores

L. Melnikova

Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences

Autor responsável pela correspondência
Email: lsm73@mail.ru
Rússia, Moscow

V. Molodina

Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences

Email: lsm73@mail.ru
Rússia, Moscow

P. Georgiev

Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences

Email: lsm73@mail.ru
Rússia, Moscow

A. Golovnin

Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences

Email: lsm73@mail.ru
Rússia, Moscow

Bibliografia

  1. Cavalheiro, G. R., Pollex, T., and Furlong, E. E. (2021) To loop or not to loop: what is the role of TADs in enhancer function and gene regulation? Curr. Opin. Genet. Dev., 67, 119-129, https://doi.org/10.1016/j.gde.2020.12.015.
  2. Kim, J., and Dean, A. (2021) Enhancers navigate the three-dimensional genome to direct cell fate decisions, Curr. Opin. Struct. Biol., 71, 101-109, https://doi.org/10.1016/j.sbi.2021.06.005.
  3. Kyrchanova, O., Sokolov, V., and Georgiev, P. (2023) Mechanisms of interaction between enhancers and promoters in three Drosophila model systems, Int. J. Mol. Sci., 24, 2855, https://doi.org/10.3390/ijms24032855.
  4. Furlong, E. E. M., and Levine, M. (2018) Developmental enhancers and chromosome topology, Science, 361, 1341-1345, https://doi.org/10.1126/science.aau0320.
  5. Melnikova, L. S., Georgiev, P. G., and Golovnin, A. K. (2020) The functions and mechanisms of action of insulators in the genomes of higher eukaryotes, Acta Naturae, 12, 15-33, https://doi.org/10.32607/actanaturae.11144.
  6. Schoborg, T., and Labrador, M. (2014) Expanding the roles of chromatin insulators in nuclear architecture, chromatin organization and genome function, Cell. Mol. Life Sci., 71, 4089-4113, https://doi.org/10.1007/s00018-014-1672-6.
  7. Chen, D., and Lei, E. P. (2019) Function and regulation of chromatin insulators in dynamic genome organization, Curr. Opin. Cell Biol., 58, 61-68, https://doi.org/10.1016/j.ceb.2019.02.001.
  8. Kyrchanova, O., Maksimenko, O., Stakhov, V., Ivlieva, T., Parshikov, A., Studitsky, V. M., and Georgiev, P. (2013) Effective blocking of the white enhancer requires cooperation between two main mechanisms suggested for the insulator function, PLoS Genet., 9, e1003606, https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1003606.
  9. Savitskaya, E., Melnikova, L., Kostuchenko, M., Kravchenko, E., Pomerantseva, E., Boikova, T., Chetverina, D., Parshikov, A., Zobacheva, P., Gracheva, E., et al. (2006) Study of long-distance functional interactions between Su(Hw) insulators that can regulate enhancer-promoter communication in Drosophila melanogaster, Mol. Cell Biol., 26, 754-761, https://doi.org/10.1128/MCB.26.3.754-761.2006.
  10. Maksimenko, O. G., Fursenko, D. V., Belova, E. V., and Georgiev, P. G. (2021) CTCF as an example of DNA-binding transcription factors containing clusters of C2H2-type zinc fingers, Acta Naturae, 13, 31-46, https://doi.org/10.32607/actanaturae.11206.
  11. Kyrchanova, O. V., Bylino, O. V., and Georgiev, P. G. (2022) Mechanisms of enhancer-promoter communication and chromosomal architecture in mammals and Drosophila, Front. Genet., 13, 1081088, https://doi.org/10.3389/fgene.2022.1081088.
  12. Roseman, R. R., Pirrotta, V., and Geyer, P. K. (1993) The su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects, EMBO J., 12, 435-442, https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1993.tb05675.x.
  13. Holdridge, C., and Dorsett, D. (1991) Repression of hsp70 heat shock gene transcription by the suppressor of hairy-wing protein of Drosophila melanogaster, Mol. Cell. Biol., 11, 1894-1900, https://doi.org/10.1128/mcb.11.4.1894-1900.1991.
  14. Geyer, P. K., and Corces, V. G. (1992) DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein, Genes Dev., 6, 1865-1873, https://doi.org/10.1101/gad.6.10.1865.
  15. Soshnev, A. A., Baxley, R. M., Manak, J. R., Tan, K., and Geyer, P. K. (2013) The insulator protein Suppressor of Hairy-wing is an essential transcriptional repressor in the Drosophila ovary, Development, 140, 3613-3623, https:// doi.org/10.1242/dev.094953.
  16. Melnikova, L., Elizar’ev, P., Erokhin, M., Molodina, V., Chetverina, D., Kostyuchenko, M., Georgiev, P., and Golovnin, A. (2019) The same domain of Su(Hw) is required for enhancer blocking and direct promoter repression, Sci. Rep., 9, 5314, https://doi.org/10.1038/s41598-019-41761-6.
  17. Baxley, R. M., Bullard, J. D., Klein, M. W., Fell, A. G., Morales-Rosado, J. A., Duan, T., and Geyer, P. K. (2017) Deciphering the DNA code for the function of the Drosophila polydactyl zinc finger protein suppressor of Hairy-wing, Nucleic Acids Res., 45, 4463-4478, https://doi.org/10.1093/nar/gkx040.
  18. Melnikova, L., Kostyuchenko, M., Molodina, V., Parshikov, A., Georgiev, P., and Golovnin, A. (2018) Interactions between BTB domain of CP190 and two adjacent regions in Su(Hw) are required for the insulator complex formation, Chromosoma, 127, 59-71, https://doi.org/10.1007/s00412-017-0645-6.
  19. Pai, C. Y., Lei, E. P., Ghosh, D., and Corces, V. G. (2004) The centrosomal protein CP190 is a component of the gypsy chromatin insulator, Mol. Cell, 16, 737-748, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2004.11.004.
  20. Melnikova, L., Kostyuchenko, M., Molodina, V., Parshikov, A., Georgiev, P., and Golovnin, A. (2017) Multiple interactions are involved in a highly specific association of the Mod(mdg4)-67.2 isoform with the Su(Hw) sites in Drosophila, Open Biol., 7, 170150, https://doi.org/10.1098/rsob.170150.
  21. Ghosh, D., Gerasimova, T. I., and Corces, V. G. (2001) Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function, EMBO J., 20, 2518-2527, https://doi.org/10.1093/emboj/20.10.2518.
  22. Gause, M., Morcillo, P., and Dorsett, D. (2001) Insulation of enhancer-promoter communication by a gypsy transposon insert in the Drosophila cut gene: cooperation between suppressor of hairy-wing and modifier of mdg4 proteins, Mol. Cell. Biol., 21, 4807-4817, https://doi.org/10.1128/MCB.21.14.4807-4817.2001.
  23. Bonchuk, A., Balagurov, K., and Georgiev, P. (2023) BTB domains: A structural view of evolution, multimerization, and protein-protein interactions, Bioessays, 45, e2200179, https://doi.org/10.1002/bies.202200179.
  24. Bonchuk, A., Denisov, S., Georgiev, P., and Maksimenko, O. (2011) Drosophila BTB/POZ domains of “ttk group” can form multimers and selectively interact with each other, J. Mol. Biol., 412, 423-436, https://doi.org/10.1016/ j.jmb.2011.07.052.
  25. Glenn, S. E., and Geyer, P. K. (2019) Investigation of the developmental requirements of Drosophila HP1 and insulator protein partner, HIPP1, G3 (Bethesda), 9, 345-357, https://doi.org/10.1534/g3.118.200705.
  26. Melnikova, L., Molodina, V., Erokhin, M., Georgiev, P., and Golovnin, A. (2019) HIPP1 stabilizes the interaction between CP190 and Su(Hw) in the Drosophila insulator complex, Sci. Rep., 9, 19102, https://doi.org/10.1038/s41598-019-55617-6.
  27. Stow, E. C., Simmons, J. R., An, R., Schoborg, T. A., Davenport, N. M., and Labrador, M. (2022) A Drosophila insulator interacting protein suppresses enhancer-blocking function and modulates replication timing, Gene, 819, 146208, https://doi.org/10.1016/j.gene.2022.146208.
  28. Kurshakova, M., Maksimenko, O., Golovnin, A., Pulina, M., Georgieva, S., Georgiev, P., and Krasnov, A. (2007) Evolutionarily conserved E(y)2/Sus1 protein is essential for the barrier activity of Su(Hw)-dependent insulators in Drosophila, Mol. Cell, 27, 332-338, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2007.05.035.
  29. Matzat, L. H., Dale, R. K., Moshkovich, N., and Lei, E. P. (2012) Tissue-specific regulation of chromatin insulator function, PLoS Genet., 8, e1003069, https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1003069.
  30. King, M. R., Matzat, L. H., Dale, R. K., Lim, S. J., and Lei, E. P. (2014) The RNA-binding protein Rumpelstiltskin antagonizes gypsy chromatin insulator function in a tissue-specific manner, J. Cell. Sci., 127, 2956-2966, https:// doi.org/10.1242/jcs.151126.
  31. Schoborg, T., Rickels, R., Barrios, J., and Labrador, M. (2013) Chromatin insulator bodies are nuclear structures that form in response to osmotic stress and cell death, J. Cell Biol., 202, 261-276, https://doi.org/10.1083/jcb.201304181.
  32. Golovnin, A., Melnikova, L., Volkov, I., Kostuchenko, M., Galkin, A. V., and Georgiev, P. (2008) “Insulator bodies” are aggregates of proteins but not of insulators, EMBO Rep., 9, 440-445, https://doi.org/10.1038/embor.2008.32.
  33. Golovnin, A., Volkov, I., and Georgiev, P. (2012) SUMO conjugation is required for the assembly of Drosophila Su(Hw) and Mod(mdg4) into insulator bodies that facilitate insulator complex formation, J. Cell Sci., 125, 2064-2074, https://doi.org/10.1242/jcs.100172.
  34. Harrison, D. A., Gdula, D. A., Coyne, R. S., and Corces, V. G. (1993) A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function, Genes Dev., 7, 1966-1978, https://doi.org/ 10.1101/gad.7.10.1966.
  35. Melnikova, L., Kostyuchenko, M., Parshikov, A., Georgiev, P., and Golovnin, A. (2018) Role of Su(Hw) zinc finger 10 and interaction with CP190 and Mod(mdg4) proteins in recruiting the Su(Hw) complex to chromatin sites in Drosophila, PLoS One, 13, e0193497, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193497.
  36. Georgiev, P., and Kozycina, M. (1996) Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations, Genetics, 142, 425-436, https://doi.org/10.1093/genetics/142.2.425.
  37. Murawska, M., and Brehm, A. (2012) Immunostaining of Drosophila polytene chromosomes to investigate recruitment of chromatin-binding proteins, Methods Mol. Biol., 809, 267-277, https://doi.org/10.1007/978-1-61779-376-9_18.
  38. Geyer, P. K., and Corces, V. G. (1987) Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster, Genes Dev., 1, 996-1004, https://doi.org/10.1101/gad.1.9.996.
  39. Geyer, P. K., Spana, C., and Corces, V. G. (1986) On the molecular mechanism of gypsy-induced mutations at the yellow locus of Drosophila melanogaster, EMBO J., 5, 2657-2662, https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1986.tb04548.x.
  40. Jack, J., Dorsett, D., Delotto, Y., and Liu, S. (1991) Expression of the cut locus in the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer, Development, 113, 735-747, https://doi.org/ 10.1242/dev.113.3.735.
  41. Parnell, T. J., Kuhn, E. J., Gilmore, B. L., Helou, C., Wold, M. S., and Geyer, P. K. (2006) Identification of genomic sites that bind the Drosophila suppressor of Hairy-wing insulator protein, Mol. Cell. Biol., 26, 5983-5993, https:// doi.org/10.1128/MCB.00698-06.
  42. Kuhn-Parnell, E. J., Helou, C., Marion, D. J., Gilmore, B. L., Parnell, T. J., Wold, M. S., and Geyer, P. K. (2008) Investigation of the properties of non-gypsy suppressor of hairy-wing-binding sites, Genetics, 179, 1263-1273, https:// doi.org/10.1534/genetics.108.087254.

Arquivos suplementares

Arquivos suplementares
Ação
1. JATS XML
Baixar
2. Fig. 1. Su(Hw) protein derivatives used in the work. a – Schematic representation of the full-length Su(Hw) protein. Domain designations: CID – domain interacting with CP190; ZF – zinc fingers; LZ – leucine zipper. The diagram shows the regions of interaction with the Mod(mdg4)-67.2 (Mod-67.2) and CP190 proteins, which are depicted as ovals. The vertical arrow indicates the su(Hw)E8 mutation. The bracket under the diagram indicates the region of the protein to which the antibodies were obtained. The amino acid residues limiting the domains and derivative forms are indicated by numbers. The names of the derivatives are indicated on the left, the size of the derivatives is indicated by segments, the dotted lines indicate internal deletions, the su(Hw)E8 mutation is indicated by an asterisk. The results obtained in DDS are shown to the right of the diagrams. “+” – presence of interaction, “–” – absence of interaction. b – Deletion derivatives used in genetic experiments and in immunostaining of polytene chromosomes

Baixar (471KB)
Metadados
3. Fig. 2. Effect of the Su(Hw)E8 protein on gypsy-dependent insulation. a – Schematic representation of the y2 and ct6 alleles. The exons of the yellow and cut genes are shown as rectangles. The transcription initiation sites of the genes are indicated by arrows. The gypsy retrotransposon is shown as a triangle. The rectangles at its ends denote the long terminal repeats (LTRs), the orientation of which is indicated by arrows. Designations: Su(Hw) – Su(Hw) insulator; En-K – wing enhancer, En-T – body enhancer; En-Shch – bristle enhancer; En-Kp – wing plate enhancer. b – Effect of Su(Hw) protein derivatives on the activity of the gypsy insulator in the y2 and ct6 alleles against the background of the su(Hw)v/su(Hw)2 (v/2) and su(Hw)v/su(Hw)E8 (v/E8) mutations. The names of the lines used for phenotypic analysis are shown in the right column: wt – y2ct6, Su(Hw)+ – the transgene expressed the full-length protein. The schemes and names of the remaining derivatives are shown in Fig. 1. The numbers in the y2 column indicate the level of yellow gene expression in the body and wing cuticle. The photographs show changes in the wing phenotype of the cut gene against various mutant backgrounds.

Baixar (1MB)
Metadados
4. Fig. 3. Binding of the Su(Hw)E8 protein to polytene chromosomes. Immunostaining of polytene chromosomes of the salivary glands of third instar larvae from the y2ct6 (wt), y2ct6 su(Hw)v/su(Hw)2 (v/2), y2ct6;su(Hw)v/su(Hw)E8 (v/E8), y2ct6;su(Hw)vmod(mdg4)u1/su(Hw)E8mod(mdg4)u1 (v-m/E8-m) lines and from the same lines expressing the Su(Hw)ΔN-FLAG or Su(Hw)+-FLAG protein. Antibodies to the FLAG epitope (αFLAG) and to the N-terminal domain of the Su(Hw) protein (αSu(Hw)-N) were used in the experiments. Arrows point to the gypsy insertion at the end of chromosome X.

Baixar (3MB)
Metadados
5. Fig. 4. Binding of Su(Hw)E8 protein to SBS. a – Testing of Su(Hw) protein binding in y2ct6 lines using antibodies to the N-terminal domain of Su(Hw). b – Testing of Su(Hw)ΔN protein binding in y2ct6;Su(Hw)ΔN-FLAG/Su(Hw)ΔN-FLAG lines using antibodies to the FLAG epitope. c – Testing of Su(Hw)E8 protein binding in y2ct6;Su(Hw)ΔN-FLAG/Su(Hw)ΔN-FLAG lines using antibodies to the N-terminal domain of Su(Hw). The coding region of the ras64B gene (ras) was used as a control, which does not contain Su(Hw) protein binding sites. The percentage of enrichment of immunoprecipitated DNA (Y axis) was calculated relative to the amount of loaded DNA. The names of the selected Su(Hw)-dependent sites are indicated at the bottom (X-axis). The standard deviation for three independent biological replicates is shown. Significance levels (Student's t-test) p < 0.05. Designations: wt – wild type; v-m/2-m – combination of mutations su(Hw)vmod(mdg4)u1/su(Hw)2mod(mdg4)u1; IgG – immunoglobulins. Other designations are as in Figs. 2 and 3

Baixar (903KB)
Metadados
6. Fig. 5. Model of recruitment of Su(Hw)-dependent complexes to SBS during DNA replication.

Baixar (686KB)
Metadados

Declaração de direitos autorais © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».