Human Blood Serum Antagonizes Effects of EGFR/HER2-Targeted Drug Lapatinib on Squamous Carcinoma SK-BR-3 Cell Growth and Gene Expression

Толық мәтін

Принятые сокращения: ДЭГ – дифференциально экспрессируемые гены; РМЖ – рак молочной железы; EGF – эпидермальный фактор роста (Epidermal Growth Factor); EGFR – рецептор эпидермального фактора роста (Epidermal Growth Factor Receptor); FBS – эмбриональная телячья сыворотка; HER – человеческий рецептор эпидермального фактора роста (Human Epidermal growth factor Receptor); PAL – уровень активации пути (Pathway Activation Level).

ВВЕДЕНИЕ

Семейство рецепторов ERBB/HER (HER – человеческий рецептор эпидермального фактора роста, Human Epidermal growth factor Receptor) включает в себя четыре структурно родственные тирозинкиназы. У человека они называются HER1–4: рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), HER2 (neu), ErbB3 и ErbB4 [1–5]. Несколько факторов роста, названные лигандами рецепторов HER, обладают способностью связывать эти рецепторы и инициировать их активацию [6–8]. В своей апо-форме HER-рецепторы существуют в равновесии между мономерным и предимеризованным состояниями, находясь в конформации, не допускающей образования активных димеров. После связывания лиганда с внеклеточными доменами (эктодоменами) EGFR, HER3 или HER4 голорецепторы гомо- или гетеродимеризуются и становятся функционально активными за счёт трансфосфорилирования специфических остатков тирозина [9, 10]. Фосфорилированные рецепторы являются сайтами связывания для ряда белков, которые активируют нижележащие сигнальные пути, регулируют рост, выживание и дифференцировку клеток [11–13]. Среди HER-рецепторов HER2 является рецептором, не имеющим известного лиганда. Внеклеточный домен HER2 всегда находится в открытой конформации и готов к димеризации. Поэтому HER2 является предпочтительным гетеродимерным партнёром для других активированных HER-рецепторов [14], а также легко образует гомодимеры [15].

Сверхэкспрессия и нарушение внутриклеточной сигнализации через рецепторы семейства HER играет ключевую роль в канцерогенезе, а сверхэкспрессия HER2 служит прогностическим биомаркером при многих видах рака [5]. 15–20% всех случаев рака молочной железы (РМЖ) характеризуется сверхэкспрессией HER2 (HER2+ РМЖ) [16]. В настоящее время разработан терапевтический подход, направленный на блокирование активности рецептора HER2. Для терапии HER2+ РМЖ в качестве стандарта лечения одобрено гуманизированное моноклональное антитело трастузумаб, которое воздействует на внеклеточные домены HER2. Кроме того, клиническую эффективность в отношении HER2+ РМЖ доказал лапатиниб – обратимый синтетический ингибитор тирозинкиназы, предотвращающий фосфорилирование и активацию как HER2, так и EGFR [17–19, 20].

Однако не все пациенты с опухолями, экспрессирующими HER2 на высоком уровне, отвечают на HER2-таргетную терапию [21–23], и часто в опухолях развивается резистентность к такому лечению [24, 25], обусловленная как исходно существующими, так и приобретёнными факторами [26]. Так, например, только у 39% больных HER2+ РМЖ наблюдался ответ опухоли на лапатиниб [27].

В настоящее время продолжаются работы по выявлению и валидации эффективных и клинически применимых факторов, связанных с лекарственной устойчивостью, с целью дальнейшего повышения эффективности лечения. Внутриклеточные факторы характерны для самой опухоли и определяются мутациями или аномальной экспрессией генов. Некоторые больные РМЖ с мутациями HER2 (L755S, V842I, K753I или D769Y) не получают пользы от трастузумаба [28]. В литературе обсуждается несколько групп предполагаемых факторов, влияющих на эффективность терапии, среди них экспрессия генов в опухоли, которая коррелирует с ответом на терапию (биомаркеров) [29], и данные об активности внутриклеточных молекулярных путей в опухолевых тканях, полученные на основе транскриптомного профилирования [30–32].

Внеклеточные факторы лекарственной устойчивости связаны с межклеточной коммуникацией или факторами, присутствующими в организме пациента. Для выявления таких факторов было проведено сравнение протеомных спектров образцов сыворотки крови пациентов, отвечающих и не отвечающих на терапию [33, 34]. По некоторым данным, HER и его лиганды (эпидермальный фактор роста (EGF), амфирегулин, HB-EGF, TGF-α) могут быть использованы в качестве серологических биомаркеров для прогноза и предсказания ответа на HER-таргетную терапию при раке лёгкого [35], яичников [36] и колоректальном раке [37]. В исследованиях на клеточных культурах было продемонстрировано значительное влияние лигандов HER, препятствующее действию HER-таргетных препаратов (EGF, нейрегулин (NRG)) на клетки [38–41]. Например, ингибитор HER2 лапатиниб парадоксальным образом способен стимулировать пролиферативное поведение HER2+ клеток РМЖ в присутствии лиганда рецептора HER3 – NRG [39]. Таким образом, на опухолевый ответ может влиять целый ряд внеклеточных факторов, присутствующих в периферической крови человека. Концентрация эндогенного EGF и других лигандов HER может варьировать в организме пациента и, следовательно, влиять на эффективность лечения за счёт потенциального спасения раковых клеток при проведении HER-таргетной терапии [42]. Тем не менее взаимодействие между сывороткой крови человека и таргетными препаратами при их сочетанном действии на клетки опухоли ещё недостаточно изучено.

Недавно мы обнаружили, что периферическая кровь человека модулирует активность HER-специфических препаратов цетуксимаба, эрлотиниба и трастузумаба [41, 42]. В этой работе мы показываем, что сыворотка крови человека подавляет ингибирующее влияние лапатиниба на скорость роста SK-BR-3, HER2+ клеток аденокарциномы молочной железы человека. Используя образцы сыворотки крови 14 женщин-доноров (протестированные по отдельности или объединённые), мы обнаружили, что сыворотка крови человека резко уменьшает ингибирующее действие лапатиниба на рост клеточной линии плоскоклеточной карциномы молочной железы SK-BR-3. Этот антагонизм между лапатинибом и сывороткой крови человека был связан с отменой лапатиниб-индуцированной остановки клеток в фазе G0/G1 клеточного цикла.

Секвенирование РНК выявило 308 дифференциально экспрессируемых генов (ДЭГ) в присутствии лапатиниба. Примечательно, что в сочетании с лапатинибом сыворотка крови человека оказалась способной восстанавливать скорость роста клеток, а также экспрессию 96,1% тех генов, для которых она изменялась при воздействии лапатиниба.

Совместное воздействие лапатиниба и EGF также восстанавливает рост клеток и отменяет изменение экспрессии 95,8% тех генов, для которых она изменялась при воздействии лапатиниба. Дифференциальный анализ экспрессии генов также показал, что в присутствии сыворотки крови человека или EGF лапатиниб неспособен ингибировать сигнальный путь Toll-подобного рецептора и изменять экспрессию генов, связанных с термином Focal adhesion из базы данных Gene Ontology.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование клеток. Клеточная линия плоскоклеточной карциномы SK-BR-3 (ATCC HTB-30) была получена из коллекции Института цитологии (Санкт-Петербург, Россия). Клетки SK-BR-3 культивировали при 37 °С и 5% CO₂ в среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия), дополненной 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой (FBS) («Biosera», Франция) и 2 мМ L-глутамина, 4,5 г/л глюкозы и 1%-ной смесью пенициллина со стрептомицином («ПанЭко»).

Измерение скорости роста клеток. Клетки высевали на 24-луночные культуральные планшеты, ~5500 клеток на лунку. Планшеты с равным количеством высеянных клеток инкубировали в течение 24 ч перед обработкой препаратом – EGF, лапатинибом или сывороткой крови человека. В день добавления препаратов проводился контрольный подсчёт для определения фонового значения числа клеток. Через 7 дней после добавления препаратов среду удаляли, обработанные клетки промывали и трипсинизировали в течение 10 мин. После ресуспендирования клетки подсчитывали с помощью камеры для подсчёта клеток Neubauer Improved. Рост клеток (%) рассчитывали как отношение числа клеток в лунке, содержащей препарат, к числу клеток в контрольной лунке, содержащей только стандартную среду роста (одна контрольная лунка на пять лунок, содержащих препарат). Все эксперименты проводились не менее чем в трёх независимых повторностях.

Анализ клеточного цикла. Клетки высевали в шестилуночные культуральные планшеты с плотностью 50 000 клеток на лунку. Клетки инкубировали в течение 16 ч, после чего добавляли препараты. Через 3–4 дня клетки отделяли от подложки трипсином. Затем клетки дважды промывали PBS и центрифугировали при 100 g. Клетки фиксировали этанолом (70%) при −20 °С в течение 30 мин. Клетки центрифугировали при 3800 об./мин (1000 g) в течение 10 мин; промывали PBS и ресуспендировали в 0,2 мл PBS, содержащем 10 мкг/мл РНКазы A II и 2 мкг/мл пропидия йодида. Клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин в тёмном месте. Образцы анализировали методом проточной цитометрии (FACS BD Accuri C6 Plus). Все эксперименты проводились не менее чем в трёх независимых повторностях.

Обработка клеток для РНК-секвенирования. Клеточную суспензию разводили до 27 000 клеток в мл и аликвоты клеточной суспензии объёмом 5 мл вносили в культуральные флаконы площадью 25 см2. Для измерения скорости роста из той же суспензии клеток в лунки 24-луночных планшетов вносили аликвоты по 0,5 мл на лунку. Клетки инкубировали в течение 16 ч, после чего добавляли препараты. Например: лапатиниб, свежеразведённый раствор в среде роста без FBS на флакон до конечной концентрации 200 нМ; EGF, свежеразведённый раствор в среде роста на флакон до конечной концентрации 2 нг/мл; 300 мкл сыворотки крови человека на флакон до конечной концентрации 5,5%. Клетки обрабатывали препаратами во флаконах за 48 ч перед сбором образцов для секвенирования РНК и за 7 дней до подсчёта клеток. Для секвенирования РНК клетки отделяли трипсином, промывали PBS, а образцы клеток до анализа хранили при −70 °С в растворе RNAlater. Сыворотка человека, использованная для профилирования РНК, представляла собой пул сывороток, полученных от десяти доноров (sm1, sd12, sd18–23, sd26, sd27) и смешанных в равных объёмных концентрациях.

EGFR-Таргетные препараты, EGF, образцы сыворотки крови человека. Лапатиниб (сухой порошок) был приобретён у компании «Sigma-Aldrich» (США) и хранился при −20 °С в виде 10 мМ раствора в ДМСО или в сухом виде. rhEGF (сухой порошок) был приобретён в компании «SCI store» (Москва, Россия) и хранился при −20 °С. Образцы периферической крови от неродственных здоровых доноров 23–64 лет собирали в две пробирки Vacuette объёмом 8 мл, содержащие прокоагулянт и гель («Greiner», Австрия), сыворотку готовили в течение 3–12 ч после взятия крови: пробирки центрифугировали при 2500 об./мин в течение 15 мин, сыворотки аликвотировали и хранили при −75 °С. Для всех исследуемых биоматериалов человека от соответствующих доноров было получено информированное письменное согласие на участие в исследовании и передачу результатов в виде научного отчёта. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией; процедура получения согласия и дизайн исследования были одобрены этическим комитетом Медицинского центра «Витамед», Москва; дата одобрения: 6 октября 2021 г.

Подготовка библиотек и РНК-секвенирование. Библиотеки РНК были созданы и секвенированы в соответствии с методом Suntsova et al. [43]. РНК выделяли с помощью набора RNeasy Micro Kit («Qiagen», Нидерланды). Концентрацию РНК определяли с помощью набора Qubit RNA Assay Kit («Thermo Fisher Scientific», США), измеряя флуоресценцию с помощью флуориметра Qubit 4. Для измерения числа целостности РНК (RIN, RNA Integrity Number) использовали биоанализатор Tapestation 4150 с набором ScreenTapes and Reagents («Agilent», США). Удаление рибосомальной РНК проводили с помощью набора KAPA RNA HyperPrep Kit с RiboErase (HMR) («Roche», Швейцария). Уникальные праймеры KAPA с двойной индексацией («Roche») использовались для мультиплексирования образцов в одном цикле секвенирования. Концентрацию библиотек измеряли с помощью наборов Qubit 4 и Qubit dsDNA HS Assay («Thermo Fisher Scientific»). Распределение длины фрагментов определяли с помощью прибора Tapestation 4150 с набором D1000 ScreenTapes and Reagents («Agilent»). Секвенирование РНК проводили в лаборатории клинической и геномной биоинформатики Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова (Сеченовский университет), Москва, Россия, на оборудовании Illumina NextSeq 550 для одноконцевого секвенирования, длина считывания 75 п.н., приблизительно 20 млн прочтений на образец. Проверка качества данных проводилась с помощью программы Illumina SAV. Демультиплексирование проводили с помощью программного обеспечения Illumina Bcl2fastq2 v. 2.17.

Обработка данных РНК-секвенирования. Первоначальная обработка профилей экспрессии генов проводилась в соответствии с методом Suntsova et al. [43]. Дифференциальный анализ экспрессии проводили с помощью программы DESeq2 [44]. Гены, которые считались дифференциально экспрессированными, должны были преодолеть пороговое значение коэффициента ложного обнаружения Бенджамини–Хохберга (FDR) с поправ- кой на p-значения < 0,05. Графики вулканов визуализировали с помощью пакета R EnhancedVolcano (v. 1.16.0).

Анализ GO-обогащения проводили с помощью пакетов R clusterProfile (v.4.2.1) и org.Hs.eg.db (v.3.8.2). Для фильтрации путей и GO-терминов мы использовали p-значения < 0,05 с поправкой на FDR в качестве отсекающего значения. Анализ по методу главных компонент (PCA) и визуализацию проводили для log10-трансформированных количеств всех генов с помощью программ pca2d R (v.3.6.2) и prcomp. Анализ генно-регуляторных сетей проводили, как описано в работе Jung et al. [45]. Уровни активации путей (Pathway activation levels, PAL) рассчитывали и визуализировали с помощью биоинформационной платформы Oncobox [46]. Молекулярная функция компонентов сигнальных путей была алгоритмически аннотирована в соответствии с методом Sorokin et al. [47]. Проверка значимости пересечений проводилась согласно работе Raevskiy et al. [48]. Сигнальные пути визуализировали с помощью программного обеспечения Oncobox [49].

Статистический анализ. Статистический анализ проводили с помощью программы GraphPad PRISM 6.0 (GraphPad Software Inc.), статистически значимыми считали значения p < 0,05. Данные представлены как среднее ± SD не менее чем трёх экспериментов, проведённых в разные дни.

Для расчёта IC50 – среднеэффективной дозы, которая ингибирует исследуемую систему на 50% – мы использовали следующее уравнение:

$IC50 = D/(100/{(y - 1))}^{1/m}$,

где D – концентрация препарата; y – количество клеток (% по отношению к уровню без препарата); m – коэффициент, характеризующий форму зависимости «доза-эффект».

Значимость PAL определяли с помощью метода анализа путей Oncobox [49] для 1611 молекулярных путей, содержащих 10 и более генных продуктов, извлечённых из публичных баз данных [47] с использованием оригинального программного обеспечения [46]. Для расчётов PAL профиль экспрессии каждого образца был нормализован по среднегеометрическим уровням экспрессии генов для всех образцов в исследуемом наборе данных.

Для фильтрации и отбора ДЭГ, путей и GO-терминов мы использовали р-значения < 0,05 с поправкой на FDR Бенджамини–Хохберга.

Чтобы проверить, является ли значимым заданное количество дифференциальных генов или путей, являющихся общими для двух из трёх пересекающихся наборов данных, было проведено 1000 случайных пересечений в соответствии с методом Raevskiy et al. [48]. В каждом случае брались две/три случайные выборки из двух/трёх соответствующих наборов генов из соответствующих наборов данных. Затем эти случайные выборки пересекались на каждой итерации, и было получено 1000 случайных общих генов. p-Значение значимости пересечения вычислялось как доля случайных чисел, равных или превышающих экспериментально наблюдаемое количество общих генов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для изучения взаимодействия сыворотки крови человека с таргетным препаратом лапатинибом и оценки различия во влиянии сыворотки между донорами мы измерили скорость роста HER2+ клеток SK-BR-3 в присутствии сыворотки крови человека, взятой от 14 здоровых доноров. Для изучения молекулярных механизмов мы оценили распределение по фазам клеточного цикла и профилировали экспрессию генов в клетках SK-BR-3 под воздействием лапатиниба, EGF и сыворотки крови человека.

Сыворотка крови человека снижает влияние лапатиниба на рост клеток SK-BR-3. На эффективность терапевтических препаратов в подавлении роста опухоли могут влиять различные молекулярные факторы, присутствующие в организме пациента. В этой работе мы измерили влияние индивидуальных образцов сыворотки периферической крови человека на скорость роста клеток, полученных из аденокарциномы молочной железы, SK-BR-3, в присутствии лапатиниба, ингибитора тирозинкиназ, который предотвращает фосфорилирование и активацию HER2 и EGFR [19].

В соответствии с литературными данными, в наших экспериментах лапатиниб эффективно ингибировал рост клеток SK-BR-3 в стандартной среде, содержащей 9% FBS (рис. 1, а); концентрация лапатиниба, необходимая для 50%-ного ингибирования скорости роста (IC50), составляла ~45 нМ.

 

Рис. 1. Рост клеток SK-BR-3 после 7 дней инкубации в среде, содержащей FBS (9%) и: а – лапатиниб (в нМ); б – EGF (в нг/мл). Кривые показывают среднее количество клеток, рассчитанное по трём повторностям и нормализованное к условиям без добавления препаратов

 

SK-BR-3 – хорошо известная клеточная линия РМЖ со сверхэкспрессией HER2, использовавшаяся в многочисленных исследованиях активности HER2-таргетных препаратов in vitro, в том числе лапатиниба [50, 51]. Известно, что клетки SK-BR-3 сверхэкспрессируют HER2 (примерно 1–2 × 10⁶ молекул белка HER2 на клетку против 0,4 × 10⁵ и 0,2 × 10⁵ в HER2-негативных клеточных линиях MDA-MB-231 [52] и A431 [53] соответственно). Клетки SK-BR-3 высокочувствительны к HER2-таргетным препаратам [54, 55], IC50 лапатиниба в наших тестах составляет ~45 нМ. В свою очередь, значения IC50 лапатиниба для клеток MDA-MB-231 и A431 на два-три порядка выше: 27 мкМ и 10 мкМ соответственно [56, 57].

Мы использовали образцы сыворотки периферической крови человека, полученные от 14 здоровых женщин-доноров. Сначала мы изучили влияние сыворотки крови доноров на скорость роста клеток SK-BR-3 в отсутствии препаратов (рис. 2). Для всех исследуемых образцов исходная среда роста содержала инактивированную нагреванием (56 °С, 30 мин) FBS. Поэтому мы оценивали скорость роста клеток в среде, содержащей 5% FBS и дополненной 4% сыворотки отдельных женщин-доноров или 4% дополнительной FBS в качестве контроля. Для реализации этого плана исследования мы сначала измерили скорость роста клеток SK-BR-3 при различных концентрациях FBS (от 5 до 22%) в среде роста. Мы обнаружили, что скорость роста клеток мало зависит от концентрации FBS в этом диапазоне концентраций (рис. S1 Приложения 1). Таким образом, в одном и том же эксперименте можно сравнить рост клеток в диапазоне концентраций FBS от 5 до 13%.

 

Рис. 2. Скорость роста клеток SK-BR-3 в среде, содержащей 5% FBS и 4% сыворотки крови человека, полученной от различных доноров. Скорость роста нормализована по отношению к среде, содержащей только FBS (9% FBS; столбец «FBS»)

 

Мы обнаружили, что в присутствии 4% сыворотки крови человека скорость роста SK-BR-3 существенно не отличалась от контроля, содержащего только FBS, и составляла в среднем ~97% от контрольного уровня. Скорость роста варьирует от 83 до 116% по сравнению с контролем, содержащим только FBS (рис. 2).

Затем мы определили влияние одновременного добавления сыворотки крови человека и лапатиниба. Мы обнаружили, что добавление каждого из 14 протестированных образцов сыворотки крови человека статистически значимо снижало ингибирование роста клеток лапатинибом (рис. 3). При концентрации 75 нМ лапатиниб в среде, содержащей только FBS, вызывал сильное снижение скорости роста до ~29% от уровня без препарата. Напротив, в среде, дополненной 4% сыворотки крови человека и 5% FBS, добавление лапатиниба вызывало очень слабое снижение скорости роста клеток, до 74–84% от уровня без препарата, что примерно в 2,7 раза превышает скорость роста клеток по сравнению с таковой в среде, содержащей только лапатиниб. Эти эффекты были ещё более выражены при концентрации лапатиниба 150 нМ: средняя скорость роста составляла ~7,5% при добавлении только лапатиниба и ~44% (примерно в 6 раз больше) при добавлении лапатиниба и сыворотки крови человека.

 

Рис. 3. Скорость роста клеток SK-BR-3 в присутствии лапатиниба в концентрации 75 нМ (а) или 150 нМ (б) и сыворотки крови человека. Среда роста содержала 5% FBS и 4% сыворотки крови человека или 9% FBS (столбцы «FBS»). Столбцы представляют среднюю скорость роста клеток для каждого донорского образца, рассчитанную из трёх повторностей, нормализованную к условиям без лапатиниба и сыворотки крови человека («no drug»). Для всех образцов донорской сыворотки человека различия между образцами «FBS + лапатиниб» и «сыворотка крови человека + лапатиниб» были статистически значимыми (p < 0,05)

 

Таким образом, мы обнаружили, что в наших экспериментальных условиях сыворотка крови человека препятствует ингибированию роста клеток лапатинибом. В присутствии 4% сыворотки крови человека IC50 лапатиниба увеличивалась в ~3 раза по сравнению со значением в присутствии только FBS (рис. 4). Параметр индекса комбинации (combination index) для лапатиниба и сыворотки крови человека рассчитывали согласно методу Chou et al. [58], где взаимодействие считается антагонистическим, если индекс комбинации превышает 1,5. В наших экспериментах он варьировал от 1,9 до 3,3 во всех исследованных образцах донорской крови, что свидетельствует о сильном антагонизме между лапатинибом и сывороткой крови человека в экспериментах по исследованию скорости роста клеток SK-BR-3.

 

Рис. 4. Скорость роста клеток SK-BR-3 с возрастающими концентрациями лапатиниба (0–220 нМ) в среде роста, содержащей 5% FBS и 4% сыворотки человека из четырёх образцов крови (sm1, sd12, sd19 и sd27) или 9% FBS (FBS). Кривые зависимости скорости роста клеток от концентрации препарата для каждого донорского образца рассчитывали по трём повторностям, нормированным по отношению к условиям без лапатиниба и без сыворотки крови человека

 

Влияние EGF на рост клеток SK-BR-3 и лекарственная устойчивость к лапатинибу. Лиганды EGFR могут положительно влиять на жизнеспособность HER-положительных клеток, обработанных HER-таргетными препаратами. Например, EGF и другой лиганд рецепторов HER, NRG1, могут препятствовать действию лапатиниба и цетуксимаба на культивируемые клетки [38–41]. Поэтому в данной работе мы определили влияние рекомбинантного человеческого EGF на рост клеток SK-BR-3 в присутствии лапатиниба.

Сначала мы измерили влияние EGF на рост SK-BR-3 в диапазоне концентраций от 0,5 до 30 нг/мл (рис. 1, б). Мы обнаружили, что EGF может снизить скорость роста клеток примерно до трети от контрольного уровня с IC50 ~7,6 нг/мл. Отметим, что эта концентрация значительно выше физиологической концентрации EGF в крови человека (~0,3–1,7 нг/мл [41, 59]).

Ранее мы показали, что одновременная обработка клеток A431 ингибиторами EGFR и EGF восстанавливает их рост, а EGF уменьшает ингибирующее действие трастузумаба на клетки BT474 [42]. Это явление может быть связано со взаимным влиянием механизмов ингибирования и активации EGFR [60, 61]. В данном исследовании мы оценили влияние различных концентраций лапатиниба (от 0 до 100 нМ) на скорость роста клеток SK-BR-3 при фиксированных концентрациях EGF (0, 82, 5 и 20 нг/мл; рис. 5). Мы обнаружили, что даже при концентрации лапатиниба 100 нМ скорость роста клеток восстанавливалась практически до контрольного уровня (без препаратов), когда EGF присутствовал в концентрациях 0,82–20 нг/мл, тогда как IC50 лапатиниба в условиях добавления только этого препарата составляла почти 45 нМ.

 

Рис. 5. Скорость роста клеток SK-BR-3 при добавлении лапатиниба в присутствии EGF в указанных концентрациях. Кривые зависимости скорости роста клеток от концентрации препарата рассчитывали с использованием не менее трёх биологических повторностей каждого эксперимента, нормированных по отношению к условиям без лапатиниба и EGF (точка кривой «без EGF», при 0 нМ лапатиниба)

 

Индекс комбинации (combination index), рассчитанный в соответствии с методом Chou et al. [58], составил 7,1, что указывает на очень сильное антагонистическое взаимодействие между EGF и лапатинибом. Таким образом, наши данные подтвердили, что хотя лапатиниб и EGF по отдельности могут ингибировать рост клеток SK-BR-3, их совместное присутствие может уравновешивать действие друг друга и, наоборот, способствовать пролиферации.

Индуцированная лапатинибом остановка клеточного цикла в фазе G0/G1 в клетках SK-BR-3 снижается в присутствии сыворотки крови человека и прекращается в присутствии EGF. Лапатиниб, как и другие препараты, направленные на EGFR и/или HER2, ингибирует прогрессию клеточного цикла, вызывая остановку фазового перехода G0/G1. Чтобы изучить влияние лапатиниба на распределение фаз клеточного цикла, мы использовали сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS) для измерения доли клеток SK-BR-3 в различных фазах клеточного цикла. Мы проводили эти эксперименты в среде, содержащей FBS и EGF, и образцы сыворотки крови человека. В клетках, обработанных одним только лапатинибом в концентрации 200 нМ, мы наблюдали резкое повышение доли клеток в фазе G0/G1 на ~20% (79% против 59%) по сравнению с уровнем без препарата (рис. 6). Обработка клеток такой концентрацией лапатиниба также привела к ингибированию их роста до 3% (рис. 1, а). В свою очередь, доля клеток в фазе S значительно сократилась и составила примерно 1,7% против 11% в условиях отсутствия препарата (рис. 6).

 

Рис. 6. Распределение клеток SK-BR-3 по фазам клеточного цикла после обработки лапатинибом (200 нМ) в присутствии EGF (3 нг/мл) или 4% сыворотки крови человека по сравнению с необработанными клетками («FBS» – чёрный столбец). Показана доля клеток в фазе G0/G1 и в фазе S. Звёздочками отмечены статистически значимые различия между образцами: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001. Анализ распределения клеток по стадиям клеточного цикла проводили методом FACS после окрашивания клеток пропидий йодидом. Каждый столбик представляет собой среднее ± стандартное отклонение в трёх независимых экспериментах

 

Когда EGF добавляли одновременно с лапатинибом, скорость роста клеток в значительной степени восстанавливалась и составляла около 70% от контрольного показателя без препарата. Анализ клеточного цикла FACS показал, что это сопровождалось значительным сдвигом доли клеток в фазе G0/G1 к уровню без препарата. Одновременное присутствие EGF и лапатиниба приводило к аналогичному эффекту и для доли клеток в S-фазе, близкой к контролю без препарата. Добавление только EGF к клеткам не изменяло долю клеток в G0/G1- и S-фазах клеточного цикла (рис. 6).

Мы измерили распределение клеток SK-BR-3 по фазам клеточного цикла в среде, дополненной сыворотками пяти доноров. Во всех пяти исследуемых образцах доля клеток в G0/G1- и S-фазе не претерпела значительных изменений по сравнению с контролем, содержащим только FBS в среде роста (табл. S1 Приложения 1, рис. 6). В присутствии сыворотки крови человека и лапатиниба (среднее значение для четырёх доноров) скорость роста клеток SK-BR-3 составляла ~50% от уровня без препарата вместо всего лишь 2%, когда к среде был добавлен только лапатиниб (рис. 4). Это хорошо согласуется с нашими данными о том, что лапатиниб совместно с сывороткой крови человека вызывает сдвиг доли клеток в фазе G0/G1 на 10%, в то время как обработка только лапатинибом приводит к сдвигу примерно на 20% от уровня без препарата (рис. 6). Насколько нам известно, о влиянии образцов сыворотки крови человека на ингибирование роста клеток лапатинибом на уровне анализа клеточного цикла ранее не сообщалось. Эти результаты могут дать ключ к пониманию механизма взаимодействия EGFR/HER2-таргетных препаратов с сывороткой крови человека.

Изменения транскриптомных профилей, связанные с взаимодействием сыворотки крови человека, EGF и лапатиниба в клетках SK-BR-3. Для оценки молекулярных механизмов, лежащих в основе опосредованного сывороткой человека и/или EGF предотвращения остановки клеточного роста SK-BR-3, обработанных лапатинибом, мы провели транскриптомный анализ методом секвенирования РНК. Использовали смешанный образец сыворотки крови человека, полученный путём объединения сывороток десяти доноров. Для каждого функционального состояния эксперименты по секвенированию проводили в трёх повторностях. Значения Fold change ДЭГ по сравнению с контрольным уровнем без препарата (с критериями FDR-adjusted p-value (p-значение с поправкой на FDR) < 0,05; fold change > 2) приведены в табл. S2 Приложения 2; полные данные секвенирования депонированы в NCBI (nih.gov, BioProject) с ID PRJNA1029741.

Мы обнаружили, что 48-часовая обработка клеток SK-BR-3 150 нМ лапатиниба, снижающая скорость их роста до 7% от уровня без препарата, вызвала дифференциальную экспрессию 308 генов, из которых у 198 экспрессия была понижена, а у 110 – повышена (рис. 7 и рис. 8, а). Когда лапатиниб был добавлен в сочетании с сывороткой крови человека, эти изменения в экспрессии генов резко снизились: из первоначальных 308 ДЭГ экспрессия только 8 и 4 генов оставалась пониженной и повышенной соответственно (рис. 8). С точки зрения восстановления роста клеток это соответствует ~62% от контрольного уровня без препарата.

 

Рис. 7. Дифференциально экспрессированные гены (ДЭГ) в серии сравнений с образцом клеток без воздействия препаратов для: лапатиниба; лапатиниба и сыворотки крови человека; лапатиниба и EGF. ДЭГ показаны красным цветом (log₂FC > 1 или log₂FC < −1, скорректированное p-значение < 0,05)

 

Рис. 8. РНК-Секвенирование клеток SK-BR-3. Рост клеток в условиях обработки, использованной для сбора образцов для РНК-секвенирования (а). Диаграммы Венна, показывающие перекрытие генов с повышенной (б) и пониженной (в) экспрессией, а также, вместе, генов с повышенной и пониженной экспрессией (г) в присутствии: только лапатиниба, лапатиниба и сыворотки крови человека или лапатиниба и EGF. Звёздочками отмечена статистическая значимость совпадений: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001

 

При добавлении EGF в сочетании с лапатинибом получается аналогичная картина: экспрессия только 12 и 1 гена остаётся пониженной и повышенной соответственно (рис. 8), что соответствует ~73% восстановления роста клеток.

Таким образом, мы определили набор из 295 лапатиниб-специфичных ДЭГ, экспрессия которых не изменялась при добавлении лапатиниба к EGF или сыворотке крови человека, в качестве ключевых генов лапатиниба (lapatinib core genes).

Молекулярные пути, связанные с взаимодействием лапатиниба, EGF и сыворотки крови человека. Мы использовали анализ на основе базы данных Gene Ontology (GO) для выявления GO-терминов, содержащих наибольшее число ДЭГ (Gene Onthology enrichment, далее – обогащённые термины) и, следовательно, биологических процессов, связанных с активностью лапатиниба (рис. 9). Большинство GO-терминов, обогащённых для ДЭГ, негативно регулируемых только при лечении лапатинибом, были связаны с мембранными компонентами или активностью мембранных транспортеров. Из восьми GO-терминов, идентифицированных таким образом, семь были также обогащены для негативно регулируемых генов набора ключевых генов лапатиниба (lapatinib core).

 

Рис. 9. Термины базы данных Gene Onthology (GO), наиболее обогащённые для генов из множества ДЭГ с повышенной и пониженной экспрессией, вызванной обработкой лапатинибом (а) и набором ключевых генов лапатиниба (lapatinib core) (б). Визуализировано с помощью пакета R enrichplot (http://bioconductor.org/packages/ release/bioc/html/enrichplot.html). Обогащение указанных терминов GO статистически значимо (p-значение, скорректированное по критерию Бенджамини–Хохберга, меньше 0,05)

 

Мы обнаружили 20 GO-терминов, обогащённых для генов, регулируемых лапатинибом. Два из них, «клеточно-субстратное соединение» (“cell-substrate junction”) и его дочерний термин «фокальные контакты» (“focal adhesion”), тесно связаны между собой. Эти термины GO описывают опосредованные адгезией сигнальные процессы, влияющие на пролиферацию, дифференцировку, якорно-зависимое выживание и миграцию. Актиновый цитоскелет изменяется при эпителиально-мезенхимальном переходе (ЭМП), что приводит к усилению подвижности клеток [62]. Другие GO-термины, обогащённые для генов, регулируемых лапатинибом, включают связывание рецептора RAGE, активность трансмембранного транспортера жирных кислот, связывание и сплайсинг мРНК, семафорин и активность тирозин/треониновой фосфатазы. Все они также были обогащены для положительно регулируемых генов из набора ключевых генов лапатиниба (рис. 9, б).

Затем мы рассчитали уровни активации путей (PAL) 3044 внутриклеточных молекулярных путей человека и визуализировали результаты с помощью онлайн-инструмента OncoboxPD [46]. Этот анализ выявил 663 пути, дифференциально регулируемых (p < 0,01) при обработке лапатинибом (идентифицированных с помощью 295 ДЭГ из набора ключевых генов лапатиниба), 20 путей с наиболее значительно изменённой активностью показаны на рис. 10. Среди них наиболее сильно активируются пути, связанные с клеточным метаболизмом и регуляцией ЭМП. В условиях «лапатиниб + EGF» путь ЭМП, напротив, ингибировался и не изменялся при анализе ДЭГ в условиях «лапатиниб + сыворотка крови человека» (табл. S3 Приложения 3). Процесс ЭМП включает в себя нарушение межклеточной адгезии и клеточной полярности, глубокую перестройку цитоскелета и значительные изменения в адгезии клеток на матриксе [56, 63]. Следует отметить, что большинство GO-терминов, обогащённых для ДЭГ, негативно регулируемых лапатинибом, были связаны с мембранными компонентами или активностью мембранных транспортеров, в то время как GO-термины для позитивно регулируемых генов были в основном связаны с клеточной адгезией.

Ещё один путь – путь PKA-опосредованного фосфорилирования CREB (PKA mediated phosphorylation of CREB, база данных Reactome) – активирован только при обработке клеток лапатинибом (рис. 10, рис. S2 Приложения 1). Активность этого пути существенно не изменилась при анализе ДЭГ при обработке «лапатиниб + EGF» (p-значение 0,09) и была подавлена при анализе ДЭГ при обработке «лапатиниб + сыворотка крови человека». Циклический AMP (cAMP) регулирует транскрипцию множества генов-мишеней в основном через механизм, опосредованный протеинкиназой А (PKA) и её нижележащими эффекторами, такими как белок, связывающий cAMP-реактивный элемент (CREB) [64, 65]. Путь cAMP–PKA–CREB также играет важную роль в развитии РМЖ и связан с резистентностью к трастузумабу при HER-2+ РМЖ [65].

 

Рис. 10. 20 наиболее сильно активированных и ингибированных молекулярных путей, рассчитанных для набора ключевых генов лапатиниба (lapatinib core) в клетках SK-BR-3. Показаны значение PAL и скорректированное p-значение

 

Два наиболее сильно ингибированных лапатинибом пути относятся к клеточному метаболизму, тогда как третий ингибированный путь связан с TLR-сигнализацией. Напротив, при анализе ДЭГ в условиях «лапатиниб + EGF» этот путь имел умеренно повышенную активность. В условиях добавления лапатиниба и сыворотки крови человека активация этого пути не изменялась по сравнению с условиями без препарата. Toll-Подобные рецепторы (TLR) в основном экспрессируются в эпителиальных и иммунных клетках человека. Активация TLR, экспрессируемых в опухолевых клетках, может усиливать рост опухоли за счёт повышения про- и антиапоптотических сигналов, цитокинов, способствующих развитию опухоли, ангиогенеза и инвазивности [66, 67]. Нокдаун гена TLR4 приводил к увеличению гибели клеток РМЖ [68], что согласуется с нашими наблюдениями.

Мы также обнаружили следующие пути, которые сильно ингибировались лапатинибом: mTOR Pathway Cap-dependent Translation, DCC in regulating apoptosis Pathway (DCC означает «deleted in colorectal cancer») и EPHA2 forward signaling Pathway (рис. S3, табл. S3 Приложения 1).

Добавление лапатиниба приводило к резкому снижению активации сигнального пути TLR (рис. 11, а). Однако это снижение сильно ослабевало при добавлении препарата в комбинации с сывороткой крови человека или с EGF (рис. 11, в, г). Анализ группы ключевых генов лапатиниба показал, что ингибирование узла TLR6 этого пути не связано с ингибированием роста клеток, в то время как ингибирование узла CD14, скорее всего, с ним связано. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что клетки, обработанные EGF или сывороткой крови человека, можно считать частично устойчивыми к обработке лапатинибом. В этих клетках узлы S100A8/S100A9 и LY96/S100A8/S100A9/TLR1/TLR2/TLR4 оказались активированы по сравнению с уровнем без препарата.

 

Рис. 11. Диаграмма активации сигнального пути NCI Endogenous TLR signaling, представленная в виде взаимодействующей сети. Активность компонентов пути по сравнению с образцом без препарата показана для: клеток, обработанных только лапатинибом (a); группы ключевых генов лапатиниба (Lapatinib core genes) (б); обработки только сывороткой крови человека (в), обработки сывороткой крови человека в комбинации с лапатинибом (г), обработки только EGF (д), обработки EGF в комбинации с лапатинибом (е). Уровень активации пути (PAL) указан для каждой группы ДЭГ по сравнению с условиями без препаратов. Зелёные/красные стрелки указывают на взаимодействия активации/ингибирования соответственно; интенсивность цвета транскрипционных узлов отражает степень активации узла (натуральный логарифм изменения экспрессии по сгибам для каждого узла, референсным значением считали среднее геометрическое между уровнями экспрессии во всех образцах в соответствующих группах). Зелёный цвет означает активацию, красный – ингибирование, белый – недифференциальную экспрессию, серый – отсутствие молекулярных данных

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Прогнозирование ответа на лекарственную терапию – одна из важнейших задач в онкологии. Она требует углублённого изучения генетических, эпигенетических или транскриптомных маркеров, информативных для конкретной опухоли [69–74]. Кроме того, значение могут иметь не только внутренние молекулярные свойства опухолей. В ряде исследований оценивалось разнообразие влияния компонентов сыворотки крови, что указывает на их важность для предварительного отбора пациентов, которые могли бы ответить на таргетную терапию [33, 75]. Однако такое влияние сыворотки крови человека ещё недостаточно изучено. Выяснение основных механизмов требует проведения комбинированных исследований с использованием моделей клеточных культур [38–40], образцов донорской крови человека и анализа молекулярных путей [49, 76–78].

В этом исследовании на примере HER2+ клеточной линии аденокарциномы молочной железы SK-BR-3 мы продемонстрировали значительное влияние сыворотки крови человека на ингибирование роста клеток EGFR/HER2-таргетным препаратом лапатинибом. Для всех 14 образцов сыворотки крови, взятых у здоровых доноров, мы обнаружили сильное увеличение IC50 лапатиниба в 2,6–3,7 раза. Для EGFR-положительной клеточной линии A431 мы недавно показали, что эффективные концентрации EGFR-таргетных препаратов цетуксимаба и эрлотиниба увеличиваются в 5–25 раз при добавлении различных образцов сыворотки крови человека [42]. Таким образом, присутствие сыворотки крови человека может существенно изменить эффективность HER-таргетных препаратов, потенциально вызывая многократное изменение их IC50. Таким образом, при оценке противоопухолевой активности экспериментальных препаратов в ходе доклинических испытаний важно учитывать потенциальное влияние периферической крови человека на ингибирующую способность препарата.

Мы обнаружили, что добавленные по отдельности лапатиниб и EGF подавляют рост клеток SK-BR-3. Однако при их совместном добавлении ингибирование роста клеток исчезает из-за сильного антагонистического взаимодействия между EGF и лапатинибом. Этот вывод хорошо согласуется с нашими предыдущими результатами, где аналогичное антагонистическое взаимодействие было обнаружено для EGF в комбинации с одним из EGFR-таргетных препаратов, цетуксимабом и эрлотинибом, в EGFR+ клетках A431 [41, 61].

Концентрация EGF в сыворотке крови человека составляет ~0,3–1,7 нг/мл [59]. Для исследованных образцов мы получили схожие значения концентрации EGF (0,6–1,2 нг/мл) [41]. Для анализа скорости роста клеток мы использовали 5% сыворотки, поэтому концентрация эндогенного EGF в опытах не превышала 0,06 нг/мл. Эта концентрация намного меньше, чем 0,8–3 нг/мл рекомбинантного EGF, использованного в экспериментах. Мы пришли к выводу, что влияние сывороток на воздействие лапатиниба не может быть объяснено наличием эндогенного EGF в образцах сывороток крови человека.

В настоящем исследовании показано, что лапатиниб обычно ингибирует прогрессию клеточного цикла и вызывает остановку фазы G0/G1 в восприимчивых клетках, а также снижает долю клеток в S-фазе до незначительных значений (рис. 6).

Этот вывод согласуется с результатами предыдущего исследования, в котором было показано, что лапатиниб индуцирует арест G1-фазы в клеточных линиях SK-BR-3 и MDA-MB-453, сверхэкспрессирующих HER2, и что это сопровождается снижением доли клеток в S-фазе [79]. Кроме того, мы обнаружили, что сам по себе EGF не оказывает влияния на распределение клеток по фазам клеточного цикла, однако при добавлении лапатиниба доля клеток в G0/G1- и S-фазе смещалась обратно к уровню без препарата. Это также соответствует продолжению роста клеток в случае обработки «EGF + лапатиниб». Аналогично добавление сыворотки крови человека само по себе не оказывало влияния на распределение клеток по фазам клеточного цикла. Однако в сочетании с лапатинибом сыворотка отменяла индуцированный им сдвиг доли клеток в фазе G0/G1 и восстанавливала долю клеток в S-фазе практически до уровня без препарата, что сопровождалось частичным восстановлением максимальной скорости роста клеток.

Секвенирование РНК выявило 308 ДЭГ в присутствии лапатиниба по сравнению с контролем. Примечательно, что 96% этих генов переставали быть дифференциально экспрессированными, когда к лапатинибу добавляли сыворотку крови человека. Таким образом, сыворотка крови человека не только восстанавливает скорость роста клеток при добавлении лапатиниба, но и восстанавливает экспрессию 96% (296) лапатиниб-специфичных ДЭГ. Аналогичная картина наблюдалась при добавлении EGF вместе с лапатинибом: только 4,2% (13) лапатиниб-специфичных ДЭГ оставались дифференциально регулируемыми. Для 89% из них статус ДЭГ был утрачен, а для оставшихся 21 ДЭГ экспрессия изменилась в противоположном направлении.

Полученный набор ДЭГ, названных в данном исследовании ключевыми генами лапатиниба (lapatinib core genes), хорошо согласуется с результатами предыдущего исследования [80], в котором изучались изменения фосфорилирования белков и транскрипционной регуляции в клетках SK-BR-3 в ответ на лапатиниб. Среди 173 общих ДЭГ из этих двух исследований экспрессия 170 была изменена (показала повышение или понижение) в одном направлении, и только 3 – в противоположном. Недавно мы провели анализ РНК-секвенирования для EGFR-положительных клеток A431, обработанных EGFR-таргетным препаратом цетуксимабом в сочетании с сывороткой крови человека, и выявили ключевые ДЭГ цетуксимаба [61]. Сравнение этих двух исследований показывает, что среди 45 ДЭГ, общих для обоих наборов, экспрессия 37 генов изменяется в одном направлении в наборах ключевых генов лапатиниба (SK-BR-3) и ключевых генов цетуксимаба (A431), а экспрессия 8 генов изменяется в противоположных направлениях. Аналогичным образом сравнение ключевых генов лапатиниба, рассматриваемых в данном исследовании, и выявленных ранее ключевых генов эрлотиниба [61] показало, что среди 52 ДЭГ, общих для обоих исследований, экспрессия 40 генов изменена в одном направлении, в то время как для 12 генов она изменена в противоположных направлениях. Эти сравнения демонстрируют соответствие между ДЭГ, специфичными для EGFR/HER2-таргетного препарата лапатиниба, выявленными в HER2-позитивных клетках SK-BR-3, и ДЭГ, специфичными для EGFR-таргетных препаратов цетуксимаба и эрлотиниба, выявленными в EGFR-позитивных клетках A431.

Можно отметить несколько возможных связей набора ключевых лекарственно-чувствительных генов с их молекулярными функциями. Среди ключевых генов лапатиниба, экспрессия которых повышается под действием лапатиниба и не повышается при обработке «EGF + лапатиниб» или «сыворотка крови человека + лапатиниб», отметим следующие.

Белки S100 участвуют в регуляции ряда клеточных процессов, таких как прогрессия клеточного цикла и дифференцировка. Продукты генов S100A8/A9 образуют гетеродимер, который запускает множество сигнальных путей, влияющих на состав микротрубочек, а также сложные процессы роста, метастазирования и лекарственной устойчивости рака. Он связан с такими рецепторами, как рецептор для передовых продуктов гликирования (RAGEs) и Toll-подобный рецептор 4 (TLR4), и исследования клеточных культур показывают, что ингибирование S100A8 и S100A9 подавляло миграцию и инвазию [81, 82].

Продукт гена CDK18 может взаимодействовать с циклином A2 и циклином E, и белок CDK18 был предложен в качестве потенциальной мишени для противораковых препаратов [83]. Продукт гена SEMA3B (семафорин-3B) известен как ингибитор ангиогенеза и клеточной пролиферации, а также как супрессор опухолевого роста [84]. FABP5 кодирует один из представителей белков, связывающих жирные кислоты (FABPs). Сверхэкспрессия FABP5 наблюдается во многих типах опухолей и ассоциируется с плохим прогнозом в ряде таких типов [85]. Мы обнаружили, что в клетках, обработанных лапатинибом, повышается активность нескольких путей, связанных с метаболизмом кетонов. Белок PHLDB2 (Pleckstrin Homology Like Domain Family B Member 2), кодируемый геном PHLDB2, может функционировать как опухолевый супрессор в РМЖ. Вклад PHLDB2 в метастазирование согласуется с его молекулярной функцией, заключающейся в содействии прикреплению микротрубочек к точкам фокальной адгезии, необходимым для клеточной подвижности [86].

Гены, дифференциальная экспрессия которых была понижена при обработке клеток только лапатинибом (что приводило к ингибированию роста клеток до 5% от уровня без препарата), но не снижалась при добавлении EGF или сыворотки крови человека в среду роста вместе с лапатинибом (что приводило к восстановлению роста клеток до 73 и 62% от уровня без препарата соответственно, рис. 8, а), могут быть связаны с изменением скорости роста клеток под действием препарата.

Мета-анализ показал, что высокий уровень мРНК гистоновой деацетилазы 9 (HDAC9) в РМЖ человека ассоциируется со снижением общей выживаемости у пациенток, получающих лечение тамоксифеном [87]. CYP4B1 кодирует одну из изоформ цитохрома P450 (CYP). Сообщалось о связи между экспрессией CYP и риском развития рака, его прогрессированием, метастазированием и прогнозом [88]. Gab2 принадлежит к семейству докинг-белков Grb-associated binder (Gab). Gab2 необходим для сигнальных путей эпидермального фактора роста (EGF) и пролиферации клеток РМЖ. Коэкспрессия GAB2 с HER2 приводит к инвазивному фенотипу [89, 90]. Нокдаун GAB2 снижает активность нисходящих путей HER2 и уменьшает пролиферацию клеток in vitro [91].

Продукт гена MUC1 – широко распространённый маркер рака, названный CA 15-3. Как и ожидалось, его экспрессия снижается (в 4,1 раза) при обработке лапатинибом и восстанавливается до уровня без лекарств, когда лапатиниб вводят вместе с сывороткой крови человека или с EGF. Аналогично экспрессия гена CEA, который кодирует онкологический маркер CEA Cell Adhesion Molecule 6, снижается (в 5,2 раза) при обработке лапатинибом. Оба гена относятся к GO-термину «апикальная плазматическая мембрана», обогащённому для ДЭГ, экспрессию которых снижает лапатиниб (рис. 9).

ABCC12 (ATP Binding Cassette Subfamily C Member 12) – член суперсемейства транспортеров ATP-связывающих кассет (ABC). Ген ABCC12 имеет повышенную экспрессию в РМЖ [92]. Молекула адгезии клеток активированных лейкоцитов, кодируемая ALCAM, является членом суперсемейства иммуноглобулинов на клеточной поверхности. ALCAM имеет решающее значение для выживания клеток РМЖ. Нарушение экспрессии ALCAM связано с индукцией двух типов запрограммированной клеточной смерти – апоптоза и аутофагии – в клетках РМЖ [93]. При многофакторном анализе выживаемости без повторного заболевания высокая экспрессия цитоплазматического ALCAM и узловая форма опухоли в карциномах молочной железы были достоверно связаны с более ранним прогрессированием заболевания [94].

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что измерения эффективности противораковых препаратов на основе модельных клеточных культур могут давать ошибки, если препараты тестируются в среде роста, в отсутствии сыворотки крови человека. Более того, изменения в профилях экспрессии генов, вызванные обработкой препаратами, могут значительно отличаться в присутствии сыворотки крови человека. Таким образом, важно учитывать влияние сыворотки крови человека на эффективность лекарств в доклинических исследованиях, особенно если речь идёт о белках семейства HER.

Вклад авторов. Концептуализация – В.С., С.Д., А.Б., Д.К.; методология – Г.З., В.С., С.Д., М.С. (Мария Сунцова), М.С. (Максим Сорокин), А.Б., Д.К.; программное обеспечение – М.С. (Максим Сорокин) и А.Б.; валидация – Н.Ш. и Д.К.; формальный анализ – Н.Ш., М.Р., М.С. (Максим Сорокин), А.Б., Д.К.; исследование – Н.Ш., Д.К.; ресурсы – Г.З., В.С., С.Д.; курирование данных – Н.Ш., М.С. (Мария Сунцова), М.С. (Максим Сорокин), А.Б., Д.К.; написание: подготовка первоначального проекта рукописи – Н.Ш., А.Б., Д.К.; написание: рецензирование и редактирование – А.Б., Д.К.; визуализация – Н.Ш., М.Р.; наблюдение – А.Б., Д.К.; администрирование проекта – Н.Ш., А.Б.; получение финансирования – Г.З., М.С. (Мария Сунцова) и А.Б. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование. Вклад Марии Сунцовой и Антона Буздина был профинансирован Министерством науки и высшего образования Российской Федерации в рамках государственной поддержки создания и развития научных центров мирового уровня «Цифровой биодизайн и персонализированное здравоохранение» (грант № 075-15-2022-304). Финансирующие организации не принимали участия в разработке дизайна исследования, сборе, анализе и интерпретации данных, написании рукописи и принятии решения о публикации результатов.

Исследования клеточных культур были поддержаны грантом Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-15-2022-310 от 20 апреля 2022 г.).

Секвенирование РНК выполнено при поддержке Российского научного фонда, грант № 20-75-10071.

Доступность данных. Данные РНК-секвенирования доступны по ссылке https://www.ncbi.nlm. nih.gov/bioproject/, ID PRJNA1029741 (доступ получен 20/10/2023). Другие данные включены в рукопись и электронные дополнительные материалы.

Соблюдение этических норм. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и было одобрено Комитетом по этике клиники «Витамед» (Москва); дата одобрения: 19 января 2022 года. От всех пациентов, участвовавших в исследовании, было получено информированное согласие.

Конфликт интересов. М.С. (Максим Сорокин) и А.Б. имеют финансовые отношения с ООО «Онкобокс», 121205 Москва, Россия. Работодатели не принимали участия в разработке дизайна исследования, сборе, анализе и интерпретации данных, написании рукописи и принятии решения о публикации результатов. Остальные авторы не заявляют о конфликте интересов.

Дополнительные материалы. Приложение к статье опубликовано на сайте журнала «Биохимия» (https://biochemistrymoscow.com).

Авторлар туралы

N. Shaban

Moscow Institute of Physics and Technology; Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry; The National Medical Research Center for Endocrinology

Email: dkamashev@gmail.com
Ресей, Dolgoprudny; Moscow; Moscow

M. Raevskiy

Sechenov First Moscow State Medical University

Email: dkamashev@gmail.com
Ресей, Moscow

G. Zakharova

Sechenov First Moscow State Medical University

Email: dkamashev@gmail.com
Ресей, Moscow

V. Shipunova

Moscow Institute of Physics and Technology; Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry

Email: dkamashev@gmail.com
Ресей, Dolgoprudny; Moscow

S. Deyev

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry; Kazan Federal University

Email: dkamashev@gmail.com
Ресей, Moscow; Kazan

M. Suntsova

The National Medical Research Center for Endocrinology; Sechenov First Moscow State Medical University

Email: dkamashev@gmail.com
Ресей, Moscow; Moscow

M. Sorokin

Moscow Institute of Physics and Technology; Sechenov First Moscow State Medical University; European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC)

Email: dkamashev@gmail.com
Ресей, Moscow; Moscow; Brussels, Belgium

A. Buzdin

Moscow Institute of Physics and Technology; Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry; The National Medical Research Center for Endocrinology; Sechenov First Moscow State Medical University

Email: dkamashev@gmail.com
Ресей, Dolgoprudny; Moscow; Moscow; Moscow

D. Kamashev

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry; The National Medical Research Center for Endocrinology; Sechenov First Moscow State Medical University

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: dkamashev@gmail.com
Ресей, Moscow; Moscow; Moscow

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар