New Materials Based on Collagen and Taxifolin Derivatives: Production and Properties

Capa

Citar

Texto integral

Resumo

In this work, the properties of gel materials based on collagen and derivatives of taxifolin, pentaglutarate of taxifolin, and conjugate of taxifolin with glyoxylic acid were studied. It was shown that the increase in the proportion of the polyphenols in a gel led to the decrease in the rate of degradation of the materials. The materials had no negative impact on the viability of NIH/3T3 cells. The cells attached to the surface of the materials. Moreover, it was shown that they spread to the surface of the material containing pentaglutarate of taxifolin. It was also found that fibroblast migrated throughout the materials. An increase in the proportion of conjugate of taxifolin with glyoxylic acid in a material led to a decrease in cell migration throughout the material, whereas an increase in the proportion of pentaglutarate of taxifolin in a material led to a significant increase in cell migration throughout the material. The obtained data suggest that new materials for regenerative medicine can be derived from collagen and taxifolin derivatives.

Texto integral

ВВЕДЕНИЕ

Проблема ожогов является одной из самых серьезных на сегодняшний день [1]. Эффективность заживления ран зависит от нескольких факторов, в том числе размера, глубины, местоположения, инфицирования и пр. Хотя на данный момент в клинической практике применяются различные ранозаживляющие материалы, нет четкого алгоритма выбора материалов при различных видах ран [2]. Кроме того, с расширением представлений о механизмах заживления ран изменяются требования к разрабатываемым материалам [2]. Следует также отметить, что эффективность ранозаживляющего действия таких покрытий зависит от фазы регенерации и существенно различается при поражениях различной степени тяжести, что исключает универсальность их применения [3]. Материалы, полученные на основе коллагена, играют важную роль в лечении ран и стимуляции регенеративных процессов [4, 5]. Коллаген является основным белком внеклеточного матрикса [6]. Он продуцируется фибробластами и вовлечен во все фазы регенерации. Данный биополимер нетоксичен, биоразлагаем, обладает низкой иммуногенностью, способствует организации новосинтезированного коллагена [7]. Тем не менее проводятся постоянные исследования, направленные на получение новых материалов на основе данного биополимера. Многие из них нацелены на преодоление высокой скорости биодеградации материалов, полученных на основе коллагена, а также включение в состав коллагеновой матрицы различных биологически активных соединений (например, антибактериальных средств, таких как цефтазидим и доксициклин [8–10], или соединений, способствующих регенерации ткани [11–13]). Коллагеновая матрица рассматривается как средство адресной доставки биологически активных веществ, из которой соединения высвобождаются постепенно, благодаря чему они способны оказывать пролонгированное действие в зоне повреждения [14–16]. Для стабилизации структуры коллагена и материалов на его основе, полипептидные цепи данного биополимера сшивают. Существуют химические, физические и ферментативные методы сшивки коллагена. Достоинства и недостатки данных методов рассмотрены в следующих обзорах [17, 18]. Можно отметить несколько моментов. Использование кросс-сшивающих агентов позволяет получать материалы с более высокой степенью сшивки и равномерным распределением сшивок внутри материала [18, 19]. Однако при деградации ряда таких материалов в организме могут формироваться токсичные продукты [8, 20–22]. Формирование нетоксичных материалов с улучшенными механическими свойствами возможно в результате непосредственной сшивки карбоксильных групп глутаминовой/аспарагиновой кислот с аминогруппами лизина полипептидных цепей коллагена [23]. Однако в этом случае вовлечение карбоксильных групп глутаминовой кислоты полипептида в формирование сшивки приводит к уменьшению миграции клеток в материале: снижается их прикрепление, распластывание, выживаемость и рост [24]. В последнее время все большую популярность приобретают природные нетоксичные кросс-сшивающие агенты [18], в том числе полифенолы [25–29]. Согласно существующим данным, природные полифенолы стабилизируют структуру коллагена и увеличивают его устойчивость к деградации в биологических системах [25, 30, 31]. Стабилизация структуры полипептидов полифенолами может быть обусловлена как межмолекулярными взаимодействиями (водородные связи, гидрофобные взаимодействия) [27, 32], так и ковалентными связями полипептид — полифенол [22, 27, 33–36]. В частности, в качестве перспективных природных кросс-сшивающих агентов рассматривают генипин [37–40] и полифенол — дубильную кислоту [28, 40, 41].

Мы предположили, что стабилизация коллагена с помощью производных таксифолина, содержащих в своей структуре карбоксильные группы, является рациональным подходом для получения материалов, которые будут более устойчивы к деградации, чем нативный коллаген. При этом сшивка будет формироваться между карбоксильной группой полифенола и остатками лизина полипептида. Таким образом, карбоксильные группы глутаминовой кислоты боковых цепей полипептида будут оставаться свободными, что является критичным для прикрепления клеток к коллагену и их миграции через материал. Кроме того, материалы на основе коллагена и таксифолина будут постепенно высвобождать активный компонент (полифенол) в области повреждения. Существуют данные, согласно которым флавоноиды [42–44] и их производные [45–47], а также материалы, включающие в свой состав полифенольные соединения [11, 12, 48, 49], способствуют лучшему заживлению ран. В частности, нами было показано, что препараты, полученные на основе конъюгатов таксифолина с карбонильными соединениями — продуктами перекисного окисления липидов, такими как ацетальдегид и малоновый диальдегид, способствуют интенсификации регенерационных процессов и репарации волосяных фолликулов и сальных желез [49]. Целью настоящей работы являлось изучение биосовместимости новых материалов на основе коллагена и производных таксифолина, конъюгата таксифолина с глиоксалевой кислотой (DfTf) и пентаглутарата таксифолина (TfG5) (рис. 1). Основное внимание было сфокусировано на изучении влияния данных материалов на жизнеспособность клеток, оценке способности материалов поддерживать адгезию клеток и изучении миграции клеток через данные материалы.

 

Рис. 1. Полифенолы, используемые для стабилизации коллагена. DfTf — конъюгат таксифолина с глиоксалевой кислотой, TfG5 — пентаглутарат таксифолина.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали коллаген (ЗАО “Зеленая Дубрава”, Россия) и таксифолин (96%), любезно предоставленный ЗАО “НПФ “Флавит” (Россия).

Получение гидрогелей на основе коллагена и производных таксифолина. Получение и характеристика конъюгата таксифолина с глиоксалевой кислотой и пентаглутарата таксифолина подробно описаны в работах [50, 51] и [52, 53] соответственно.

Материалы на основе коллагена и производных таксифолина получали следующим образом. К 1 мл 5% водного раствора полифенола добавляли 100 мМ раствор 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолина (DMTMM) [52] в молярном соотношении 1:3. В случае пентаглутарата таксифолина раствор содержал 10% диметилсульфоксида. Затем к 1 мл раствора полифенола добавляли 1 мл 4% раствора коллагена, смесь быстро перемешивали и заливали в подготовленные формы. Для оценки деградации материала смесь заливали в цилиндрические формы диаметром 1.5 см и объемом 1 мл. Для оценки влияния материалов на жизнеспособность клеток и миграции клеток через материал 100 мкл смеси наносили на вкладыши с проницаемой мембраной (8 мкм, SPL, Южная Корея) для 24-луночного планшета. Для оценки способности материалов поддерживать адгезию клеток и возможного контактного цитотоксического действия 1 мл смеси помещали в 35-мм чашки Петри (SPL). Концентрация полифенола в геле составляла 0; 0.5; 1.0; и 2.5%, концентрация коллагена — 2%. Концентрацию белка определяли спектрофотометрическим методом [53].

Доля аминогрупп, участвующих в формировании сшивки. Долю аминогрупп, участвующих в формировании сшивки, определяли по изменению количества терминальных аминогрупп полипептида нингидриновым методом [53]. Для этого 100 мг геля предварительно лиофилизировали, после чего помещали в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (pH 7.4). К полученной суспензии добавляли 25 мкл 0.2% раствора нингидрина в ацетоне. Приготовленный раствор инкубировали при 90 °C в течение 15 мин, охлаждали до комнатной температуры и регистрировали оптическую плотность супернатанта при 570 нм. Расчет доли аминогрупп, участвующих в формировании поперечных сшивок, проводили по формуле:

Доля аминогрупп = (Aм ‒ Aср)/(Aпр ‒ Aср) × 100%,

где Aм ‒ оптическая плотность анализируемого материала; Aпр ‒ оптическая плотность нативного коллагена; Aср ‒ оптическая плотность коллагена, кросс-сшитого с использованием глиоксалевой кислоты.

Анализ деградации материала. Деградацию гелевого материала оценивали по количеству полипептида, перешедшего в раствор в процессе инкубации в фосфатно-солевом буфере (pH 7.4). Количество полипептида считали эквивалентным количеству терминальных аминогрупп, регистрируемых в растворе нингидриновым методом. К образцу гелевого материала объемом 100 мкл добавляли 1 мл раствора фосфатно-солевого буфера (pH 7.4) и помещали в термостат (37 °C) с орбитальным перемешиванием (100 об/мин). Через определенные промежутки времени отбирали 100 мкл водной фазы, центрифугировали при 10000 об/мин для удаления нерастворимой фракции и определяли количество аминогрупп в суспензии. Степень деградации определяли по формуле:

Степень деградации = (Aс ‒ Aб)/(Aпр ‒ Aб) × 100%,

где Aс ‒ оптическая плотность анализируемой суспензии; Aпр ‒ оптическая плотность нативного коллагена; Aб ‒ оптическая плотность буферного раствора.

Динамика высвобождения полифенола из геля. Для определения динамики высвобождения полифенола из коллагенового геля фрагмент геля объемом 100 мкл помещали в фосфатно-солевой буфер (pH 7.4) объемом 1 мл, после чего смесь помещали в термостат (37 °C) с орбитальным перемешиванием (100 об/мин). Через определенные промежутки времени отбирали 100 мкл водной фазы, центрифугировали при 10000 об/мин для удаления нерастворимой фракции и определяли концентрацию полифенола, перешедшего в раствор, спектрофотометрическим методом. Расчет концентрации полифенола в растворе проводили по среднему коэффициенту экстинкции (ε330 = 3146 M-1см-1 и ε228 = 5765 M-1см-1 для DfTf и TfG5 соответственно).

Влияние DfTf, TfG5 и материалов, полученных на их основе, на жизнеспособность клеток. В работе использовали эмбриональные мышиные фибробласты NIH 3T3, полученные из Всероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки культивировали в среде DMEM/F-12 (Sigma-Aldrich, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Himedia, Бразилия), 80 мкг/мл сульфата гентамицина (Sigma-Aldrich, США) и 24 мкг/мл флуконазола (Белмедпрепараты, Белоруссия) при 37 °C и 5% СО2. Для открепления клеток от поверхности культурального пластика использовали раствор трипсина–EDTA 0.05% (ПанЭко, Россия).

Влияние DfTf и TfG5 на жизнеспособность клеток. В лунки 96-луночного планшета высевали клетки (15 тыс. клеток/см2) и культивировали в течение 24 ч. Затем к клеткам добавляли полифенолы (DfTf и TfG5) в различных конценрациях (0.0; 0.8; 1.6; 3.1; 6.3; 12.5; 25.0; 50.0; 100.0 мкМ) и инкубировали в течение 24 ч. Далее оценивали жизнеспособность клеток. Для этого клетки фиксировали 70% этанолом в течение 30 мин, после чего окрашивали 0.5% раствором кристаллического фиолетового (Sigma-Aldrich, США) в течение 15 мин. Клетки лизировали раствором 0.1% додецилсульфата натрия, затем измеряли оптическую плотность (A) на микропланшетном ридере Infinite F200 (Tecan, Австрия) при 550 нм. Долю жизнеспособных клеток в присутствии полифенолов определяли следующим образом: Доля клеток,% от контроля = (A клеток, окрашенных после инкубации с полифенолами / A окрашенных контрольных клеток) × 100%.

Влияние материалов, полученных на основе коллагена и производных таксифолина (DfTf и TfG5), на жизнеспособность клеток. В лунки 24-луночного планшета высевали клетки (15 тыс. клеток/см2) и культивировали в течение 24 ч. Затем в лунки устанавливали вкладыши с проницаемой мембраной (8 мкм), покрытые материалами на основе DfTf и TfG5, и инкубировали еще в течение 24 ч. Далее оценивали жизнеспособность клеток. Для этого клетки фиксировали 70% этанолом в течение 30 мин, затем окрашивали 0.5% раствором кристаллического фиолетового (Sigma-Aldrich, США) в течение 15 мин. Клетки лизировали раствором 0.1% додецилсульфата натрия и измеряли оптическую плотность (A) на микропланшетном ридере Infinite F200 (Tecan, Австрия) при 550 нм. Долю жизнеспособных клеток определяли следующим образом: Доля клеток,% от контроля = (A клеток, окрашенных после инкубации с материалами / A окрашенных контрольных клеток) × 100%.

Оценка миграции фибробластов через материалы, полученные на основе коллагена и производных таксифолина (DfTf и TfG5). Материалы готовили на вкладыше с проницаемой мембраной (8 мкм). Клетки (50 тыс. клеток) высевали на поверхность данных материалов и инкубировали в течение 5 ч в среде DMEM/F-12, содержащей 10% ЭТС. В лунки 24-луночного планшета, в которых находились вкладыши, также добавляли среду DMEM/F-12, содержащую 10% ЭТС. Спустя 5 ч инкубации во вкладыше заменяли среду на DMEM/F-12, не содержащую ЭТС, и инкубировали еще 24 ч. После этого клетки, мигрировавшие через материалы, снимали с поверхности лунок 24-луночного планшета и внешней стороны мембраны вкладыша с помощью раствора трипсина–EDTA 0.05% и подсчитывали в камере Горяева. В качестве контроля на вкладыш наносили нативный коллаген. Концентрация полифенола в исследуемых материалах составляла 0; 0.5; 1.0; и 2.5%.

Оценка адгезии и распластывания фибробластов на поверхности полученных материалов. Материалы, содержащие 2.5% полифенола, готовили в 35-мм чашках Петри. Затем на их поверхность высевали клетки (15 тыс. клеток/см2) и инкубировали в течение 24 ч. Далее образцы окрашивали в течение 30 мин Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, США) (5 мкг/ мл), пропидий иодидом (Sigma-Aldrich, США) (10 мкг/мл), а также ацетоксиметиловым эфиром кальцеина (кальцеин-AM) (Sigma-Aldrich, США) (100 нМ) и изучали с помощью конфокального микроскопа TCS SP5 (Leica Microsystems, Германия). В качестве контроля на чашки Петри наносили нативный коллаген.

Статистический анализ. Все эксперименты были выполнены в трех независимых повторах. Каждый образец был проанализирован в трех технических повторах. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Сравнение средних значений проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим попарным сравнением с помощью Тьюки-теста. Для расчетов применяли статистический программный пакет GraphPad Prism 9.0.0 (GraphPad Software Inc., SanDiego, CA, USA). Различия считали значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика полученных материалов. Формирование сшивок между полипептидными цепями осуществлялось с помощью TfG5 и DfTf. DfTf содержит в своей структуре одну карбоксильную группу, тогда как TfG5 содержит пять карбоксильных групп, способных после активации формировать ковалентную связь с аминогруппами белка. Отметим, что полифенолы, по всей видимости, также могут стабилизировать структуру коллагена за счет нековалентных взаимодействий.

Было показано, что доля аминогрупп, участвующих в формировании поперечных сшивок, дозозависимо возрастает с увеличением количества полифенола, введенного в состав материала. Так, доля аминогрупп, участвующих в формировании сшивки, составляет 73±7, 80±3 и 90±5% при доле DfTf в материале 0.5, 1.0 и 2.5% соответственно. Доля аминогрупп, участвующих в формировании сшивки, составляет 69±3, 73±5 и 78±4% при доле TfG5 в материале 0.5, 1.0 и 2.5% соответственно. Было установлено, что доля фрагментов полипептида, высвобождающихся в процессе деградации материалов, уменьшается с увеличением доли полифенола в материале (рис. 2а, 2б). Полной деградации материалов на протяжении всего эксперимента не наблюдалось. Было обнаружено, что в процессе деградации материала в окружающую среду высвобождается (биологически активный) полифенол (рис. 2в, 2г).

 

Рис. 2. Характеристика гелевых материалов. а, б — Деградация гелевых материалов, полученных на основе коллагена и полифенолов. в, г — Динамика высвобождения полифенолов из гелевых материалов.

 

Влияние DfTf, TfG5 и материалов, полученных на их основе, на жизнеспособность клеток NIH 3T3. Было показано, что DfTf и TfG5 не влияют на жизнеспособность клеток NIH 3T3 во всем диапазоне исследуемых концентраций (0.8–100 мкМ). Изучение влияния материалов на основе DfTf и TfG5 на жизнеспособность клеток проводили без непосредственного контакта клеток с поверхностью материалов. Клетки находились в лунках 24-луночных планшетов, в которые были погружены вкладыши с проницаемой мембраной (8 мкм), покрытые материалами на основе коллагена и производных таксифолина (DfTf и TfG5). Спустя 24 ч инкубации оценивали жизнеспособность клеток. За время инкубации материалы частично деградировали, а продукты их распада переходили в раствор. Было установлено, что во всех образцах количество живых клеток соответствовало контрольным значениям. Таким образом, бесконтактного цитотоксического действия материалов выявлено не было.

Миграция фибробластов через материалы, полученные на основе коллагена и производных таксифолина (DfTf и TfG5). Было обнаружено, что TfG5 способствует миграции клеток через материал. Увеличение доли TfG5 в материале приводит к увеличению числа клеток, мигрировавших через материал (рис. 3). DfTf при его доле в материале 0.5% не влияет на миграцию клеток, тогда как увеличение доли данного полифенола в материале до 1.0% приводит к снижению миграции клеток в среднем на 55%. При доле DfTf в материале 2.5% клеток, мигрировавших через материал, обнаружено не было. За 100% принимали количество клеток, мигрировавших через нативный коллаген.

 

Рис. 3. Миграция фибробластов NIH 3T3 через гелевые материалы. За 100% принимали количество клеток, мигрировавших через нативный коллаген. * Достоверные различия по сравнению с контролем (коллаген), p < 0.001.

 

Для последующей оценки способности материалов поддерживать адгезию клеток и возможного контактного цитотоксического действия были отобраны материалы, содержащие максимальное количество полифенола (2.5%).

Адгезия и распластывание фибробластов на поверхности полученных материалов. Было установлено, что в процессе культивирования контрольный образец (коллаген, нанесенный на поверхность чашки) полностью деградирует, фибробласты прикрепляются к поверхности чашки и распластываются на ней (рис. 4). Показано, что исследуемые материалы подвергаются частичной деградации. Однако в поле зрения были обнаружены крупные фрагменты геля, которые в дальнейшем изучали с помощью конфокального микроскопа. Несмотря на полное отсутствие миграции клеток через материал, содержащий 2.5% DfTf, было установлено, что фибробласты прикрепляются к поверхности данного материала (рис. 4). Они имеют округлую форму, но сохраняют жизнеспособность. Сканирование образцов в разных плоскостях позволило обнаружить единичные мертвые клетки. Изучение фрагментов геля, содержащего 2.5% TfG5, миграция через который превышала в 2 раза миграцию через контрольный образец (коллаген), показало, что фибробласты прикрепляются к поверхности данного материала и распластываются на ней. Сканирование образцов позволило выявить единичные мертвые клетки.

 

Рис. 4. Фибробласты NIH 3T3 на поверхности гелевых материалов после инкубации в течение 24 ч. а — Контроль. Клетки высевали на поверхность коллагеновой матрицы, не содержащей полифенол. В процессе инкубации коллагеновая матрица деградировала, и фибробласты прикрепились к поверхности чашки. б–г — Клетки на поверхности гелевого материала, содержащего 2.5% DfTf (б), 2.5% TfG5 (в), 2.5% TfG5 при большем увеличении (г). Ядра клеток окрашены Hoechst 33342 (синий канал) и пропидий иодидом (красный канал) для выявления мертвых клеток. Цитоплазма живых клеток окрашена кальцеином-AM (зеленый канал). Масштабный отрезок 50 мкм.

 

Таким образом, токсического действия на клетки, вызванного взаимодействием с поверхностью исследуемых материалов, в том числе в местах деградации материалов, выявлено не было.

Полученные результаты говорят о том, что включение производных таксифолина, DfTf и TfG5, в состав коллагеновой матрицы позволяет получать нетоксичные стабильные материалы. О стабилизации структуры коллагена полифенольными соединениями ранее уже сообщалось в литературе [25, 30, 31]. Стабилизация структуры полипептидов полифенолами может быть обусловлена как межмолекулярными взаимодействиями (водородные связи, гидрофобные взаимодействия) [27, 32], так и ковалентными связями полипептид — полифенол [22, 27, 33–36]. В рамках данной работы также установлено, что способность фибробластов к адгезии и распластыванию на поверхности полученных материалов различна. Отличается способность клеток мигрировать через материалы, полученные на основе DfTf и TfG5. Таким образом, полученные данные подчеркивают влияние агента, стабилизирующего структуру коллагена, на свойства полученного материала. Показано, что увеличение доли DfTf в материале приводит к снижению миграции клеток через материал. Увеличение доли полифенола в материале приводит к увеличению взаимодействий между фрагментами полифенола и аминокислотными остатками коллагена, изменению трехмерной архитектуры материала в целом, которая, как известно, влияет на прикрепление, распластывание и миграцию клеток. Важную роль в данных процессах играют карбоксильные группы остатков глутаминовой кислоты полипептида. В частности, было показано, что формирование сшивки за счет данных карбоксильных групп приводит к снижению прикрепления, распластывания, миграции, а также выживаемости и роста клеток [24]. Согласно существующим данным, в трехспиральной структуре коллагена присутствуют аминокислотные остатки, которые в совокупности формируют области взаимодействия коллагена с интегриновыми рецепторами клеток. Карбоксильные группы глутаминовой кислоты (E) играют первостепенную роль в этих взаимодействиях [54, 55]. Так области GxOGEx′ важны для взаимодействия с α1β1, α2β1, α10β1 и α11β1 интегриновыми рецепторами. GFOGER имеет наибольшее сродство к α2β1 и α11β1 рецепторами, тогда как GLOGEN имеет большее сродство к α1β1 и α10β1 рецепторам [55]. Первоначально мы полагали, что карбоксильная группа DfTf будет формировать ковалентную связь с аминогруппами аминокислотных остатков лизина полипептидной цепи, таким образом изменяя и стабилизируя структуру коллагеновых волокон. Мы также предполагали, что нековалентные взаимодействия между функциональными группами и циклическими структурами полифенола и аминокислотными остатками полипептида будут вносить свой вклад в стабилизацию материала. Однако данные о стабильности исследуемых материалов, полученные в ходе данной работы, говорят о том, что материалы, полученные на основе DfTf являются более стабильными, чем материалы, полученные на основе TfG5, хотя последний содержит в своей структуре пять карбоксильных групп, которые потенциально могут участвовать в формировании ковалентной связи полифенола с аминогруппами аминокислотных остатков полипептида. Эти данные позволяют нам предположить, что, во-первых, не все карбоксильные группы TfG5 участвуют в формировании ковалентной связи, и, во-вторых, вероятно, DfTf может формировать дополнительные связи с коллагеном. Предположительно, отдельные гидроксильные группы DfTf взаимодействуют с карбоксильными группами аминокислотных остатков коллагена. Взаимодействия гидроксильных групп с карбоксильными группами могут быть электростатическими или же в результате реакции этерификации может формироваться ковалентная (сложноэфирная) связь. Это могло бы объяснить снижение миграции клеток через материал при увеличении доли DfTf в нем, а также плохое распластывание фибробластов на поверхности материала с долей DfTf 2.5%. С другой стороны, мы не можем исключать того, что карбоксильные группы полипептида остаются свободными, но формирующаяся трехмерная архитектура материала создает неблагоприятные условия для дальнейшего распластывания и миграции клеток через него.

Примечательным является то, что увеличение доли TfG5, напротив, приводит к усилению миграции клеток через материал. Как уже упоминалось, вероятно, часть карбоксильных групп TfG5 не вовлечена в формирование ковалентных сшивок и потенциально может стабилизировать структуру материала за счет нековалентных взаимодействий, а также участвовать в формировании областей взаимодействия материала с клетками, способствуя их распластыванию и миграции через материал. Полученные данные свидетельствуют о том, что модификация коллагеновых биоматериалов различными производными таксифолина позволяет модулировать адгезию клеток и их миграцию в материале. Полученные данные открывают новые направления в области регенеративной медицины и могут быть полезны, в частности, для разработки новых материалов, обеспечивающих направленную регенерацию тканей.

Авторы благодарны В.Г. Заикину (ЗАО “НПФ “Флавит”) за любезно предоставленный таксифолин. Работа выполнена с использованием приборной базы ЦКП ИТЭБ РАН.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 23–25–00149).

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

×

Sobre autores

Yu. Shatalin

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences

Autor responsável pela correspondência
Email: shubinavictoria@yandex.ru
Rússia, Pushchino, 142290

M. Kobyakova

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences; Research Institute of Clinical and Experimental Lymрhology — Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences

Email: shubinavictoria@yandex.ru
Rússia, Pushchino, 142290; Novosibirsk, 630060

V. Shubina

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences

Email: shubinavictoria@yandex.ru
Rússia, Pushchino, 142290

Bibliografia

  1. WHO Burns Available online: https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/burns
  2. Shi C., Wang C., Liu H., Li Q., Li R., Zhang Y., Liu Y., Shao Y., Wang J. 2020. Selection of appropriate wound dressing for various wounds. Front. Bioeng. Biotechnol. 8, 182. https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.00182
  3. Rowan M. P., Cancio L.C., Elster E.A., Burmeister D.M., Rose L.F., Natesan S., Chan R.K., Christy R.J., Chung K.K. 2015. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Crit Care. 19, 243. https://doi.org/10.1186/s13054–015–0961–2
  4. Chattopadhyay S., Raines R.T. 2014. Collagen‐based biomaterials for wound healing. Biopolymers. 101 (8), 821–833. https://doi.org/10.1002/bip.22486
  5. Ермолов А. С., Смирнов С.В., Карасев Н.А., Курилин Б.Л., Кислухина Е.В., Киселевская-Бабинина И.В., Васильев В.А. 2016. Анализ основных показателей работы Московского городского ожогового центра после модернизации. Журнал им. Н.В. Склифосовского «Неотложная медицинская помощь». (1), 60–62.
  6. Fleck C. A., Simman R. 2010. Modern collagen wound dressings: Function and purpose. J. Am. Coll. Certif. Wound Spec. 2 (3), 50–54. https://doi.org/10.1016/j.jcws.2010.12.003
  7. Liu R., Dai L., Si C., Zeng Z. 2018. Antibacterial and hemostatic hydrogel via nanocomposite from cellulose nanofibers. Carbohydr. Polym. 195, 63–70. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2018.04.085
  8. Adhirajan N., Shanmugasundaram N., Shanmuganathan S., Babu M. 2010. Collagen-based wound dressing for doxycycline delivery: In-vivo evaluation in an infected excisional wound model in rats. J. Pharm. Pharmacol. 61 (12), 1617–1623. https://doi.org/10.1211/jpp.61.12.0005
  9. Jana P., Mitra T., Selvaraj T.K.R., Gnanamani A., Kundu P.P. 2016. Preparation of guar gum scaffold film grafted with ethylenediamine and fish scale collagen, cross-linked with ceftazidime for wound healing application. Carbohydr. Polym. 153, 573–581. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2016.07.053
  10. Simões D., Miguel S.P., Ribeiro M.P., Coutinho P., Mendonça A.G., Correia I.J. 2018. Recent advances on antimicrobial wound dressing: A review. Eur. J. Pharm. Biopharm. 127, 130–141. https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2018.02.022
  11. Gomathi K., Gopinath D., Rafiuddin Ahmed M., Jayakumar R. 2003. Quercetin incorporated collagen matrices for dermal wound healing processes in rat. Biomaterials. 24 (16), 2767–2772. https://doi.org/10.1016/S0142–9612(03)00059–0
  12. Gopinath D., Ahmed M.R., Gomathi K., Chitra K., Sehgal P.K., Jayakumar R. 2004. Dermal wound healing processes with curcumin incorporated collagen films. Biomaterials. 25 (10), 1911–1917. https://doi.org/10.1016/S0142–9612(03)00625–2
  13. Kim H., Kawazoe T., Han D.-W., Matsumara K., Suzuki S., Tsutsumi S., Hyon S.-H. 2008. Enhanced wound healing by an epigallocatechin gallate-incorporated collagen sponge in diabetic mice: Wound healing by EGCG-incorporated collagen sponge. Wound Repair Regen. 16 (5), 714–720. https://doi.org/10.1111/j.1524–475X.2008.00422.x
  14. Chak V., Kumar D., Visht S. 2013. A review on collagen based drug delivery systems. Int. J. Pharm. Teach. Pract. 4 (4), 811–820.
  15. Hwang J., Sullivan M.O., Kiick K.L. 2020. Targeted drug delivery via the use of ECM-mimetic materials. Front. Bioeng. Biotechnol. 8, 69. https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.00069
  16. Terzopoulou Z., Michopoulou A., Palamidi A., Koliakou E., Bikiaris D. 2020. Preparation and evaluation of collagen-based patches as curcumin carriers. Polymers. 12 (10), 2393. https://doi.org/10.3390/polym12102393
  17. Oryan A., Kamali A., Moshiri A., Baharvand H., Daemi H. 2018. Chemical crosslinking of biopolymeric scaffolds: Current knowledge and future directions of crosslinked engineered bone scaffolds. Int. J. Biol. Macromol. 107 (Pt A), 678–688. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.08.184
  18. Gu L., Shan T., Ma Y., Tay F.R., Niu L. 2019. Novel biomedical applications of crosslinked collagen. Trends Biotechnol. 37 (5), 464–491. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.10.007
  19. Choi Y., Kim H.-J., Min K.-S. 2016. Effects of proanthocyanidin, a crosslinking agent, on physical and biological properties of collagen hydrogel scaffold. Restor. Dent. Endod. 41 (4), 296–303. https://doi.org/10.5395/rde.2016.41.4.296
  20. Gough J. E., Scotchford C.A., Downes S. 2002. Cytotoxicity of glutaraldehyde crosslinked collagen/poly(vinyl alcohol) films by the mechanism of apoptosis. J. Biomed. Mater. Res. 61 (1), 121–130. https://doi.org/10.1002/jbm.10145
  21. Reddy N., Reddy R., Jiang Q. 2015. Crosslinking biopolymers for biomedical applications. Trends Biotechnol. 33 (6), 362–369. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2015.03.008
  22. Wang X., Ma B., Chang J. 2015. Preparation of decellularized vascular matrix by co-crosslinking of procyanidins and glutaraldehyde. Biomed. Mater. Eng. 26 (1–2), 19–30. https://doi.org/10.3233/BME-151548
  23. Huang G. P., Shanmugasundaram S., Masih P., Pandya D., Amara S., Collins G., Arinzeh T.L. 2015. An investigation of common crosslinking agents on the stability of electrospun collagen scaffolds: An investigation of common crosslinking agents. J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (2), 762–771. https://doi.org/10.1002/jbm.a.35222
  24. Bax D. V., Davidenko N., Gullberg D., Hamaia S.W., Farndale R.W., Best S.M., Cameron R.E. 2017. Fundamental insight into the effect of carbodiimide crosslinking on cellular recognition of collagen-based scaffolds. Acta Biomater. 49, 218–234. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2016.11.059
  25. Shavandi A., Bekhit A.E.-D.A., Saeedi P., Izadifar Z., Bekhit A.A., Khademhosseini A. 2018. Polyphenol uses in biomaterials engineering. Biomaterials. 167, 91–106. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2018.03.018
  26. Manjari M. S., Aaron K.P., Muralidharan C., Rose C. 2020. Highly biocompatible novel polyphenol cross-linked collagen scaffold for potential tissue engineering applications. React. Funct. Polym. 153, 104630. https://doi.org/10.1016/j.reactfunctpolym.2020.104630
  27. Zhang X., Li Z., Yang P., Duan G., Liu X., Gu Z., Li Y. 2021. Polyphenol scaffolds in tissue engineering. Mater. Horiz. 8, 145–167. https://doi.org/10.1039/D0MH01317J
  28. Kaczmarek B. 2020. Tannic acid with antiviral and antibacterial activity as a promising component of biomaterials — A minireview. Materials. 13 (14), 3224. https://doi.org/10.3390/ma13143224
  29. Kaczmarek B., Mazur O. 2020. Collagen-based materials modified by phenolic acids — A review. Materials. 13 (16), 3641. https://doi.org/10.3390/ma13163641
  30. Schlebusch H., Kern D. 1972. Stabilization of collagen by polyphenols. Angiologica. 9 (3–6), 248–252. https://doi.org/10.1159/000157937
  31. Тараховский Ю. С., Селезнева И.И., Васильева Н.А., Егорочкин М.А., Ким Ю.А. 2007. Ускорение фибриллообразования и температурная стабилизация фибрилл коллагена в присутствии таксифолина (дигидрокверцетина). Бюлл. эксперим. биол. и мед. 144 (12), 640–643. https://doi.org/10.1007/s10517–007–0433-z
  32. Madhan B., Subramanian V., Rao J.R., Nair B.U., Ramasami T. 2005. Stabilization of collagen using plant polyphenol: role of catechin. Int. J. Biol. Macromol. 37 (1–2), 47–53. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2005.08.005
  33. Han B., Jaurequi J., Tang B.W., Nimni M.E. 2003. Proanthocyanidin: A natural crosslinking reagent for stabilizing collagen matrices. J. Biomed. Mater. Res. 65A (1), 118–124. https://doi.org/10.1002/jbm.a.10460
  34. Greco K. V., Francis L., Huang H., Ploeg R., Boccaccini A.R., Ansari T. 2018. Is quercetin an alternative natural crosslinking agent to genipin for long‐term dermal scaffolds implantation? J. Tissue Eng. Regen. Med. 12 (3), e1716-e1724. https://doi.org/10.1002/term.2338
  35. He L., Mu C., Shi J., Zhang Q., Shi B., Lin W. 2011. Modification of collagen with a natural cross-linker, procyanidin. Int. J. Biol. Macromol. 48 (2), 354–359, https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2010.12.012
  36. Pinheiro A., Cooley A., Liao J., Prabhu R., Elder S. 2016. Comparison of natural crosslinking agents for the stabilization of xenogenic articular cartilage. J. Orthop. Res. 34 (6), 1037–1046. https://doi.org/10.1002/jor.23121
  37. Scialla S., Gullotta F., Izzo D., Palazzo B., Scalera F., Martin I., Sannino A., Gervaso F. 2022. Genipin‐crosslinked collagen scaffolds inducing chondrogenesis: A mechanical and biological characterization. J. Biomed. Mater. Res. A. 110 (7), 1372–1385. https://doi.org/10.1002/jbm.a.37379
  38. Du A., Liu D., Zhang W., Wang X., Chen S. 2022. Genipin-crosslinked decellularized scaffold induces regeneration of defective rat kidneys. J. Biomater. Appl. 37 (3), 415–428. https://doi.org/10.1177/08853282221104287
  39. Isali I., Mclellan P., Wong T.R., Cingireddi S., Jain M., Anderson J.M., Hijaz A., Akkus O. 2022. In vivo delivery of M0, M1, and M2 macrophage subtypes via genipin-crosslinked collagen biotextile. Tissue Eng. Part A. 28 (15–16), 672–684. https://doi.org/10.1089/ten.TEA.2021.0203
  40. Нащекина Ю. А., Луконина О.А., Михайлова Н.А. 2020. Химические сшивающие агенты для коллагена: механизмы взаимодействия и перспективность применения в регенеративной медицине. Цитология. 62 (7), 459–472. https://doi.org/10.31857/S0041377120070044
  41. Chen C., Yang H., Yang X., Ma Q. 2022. Tannic acid: A crosslinker leading to versatile functional polymeric networks: A review. RSC Adv. 12 (13), 7689–7711, https://doi.org/10.1039/D1RA07657D
  42. Shevelev A. B., La Porta N., Isakova E.P., Martens S., Biryukova Y.K., Belous A.S., Sivokhin D.A., Trubnikova E.V., Zylkova M.V., Belyakova A.V., Smirnova M.S., Deryabina Yu.I. 2020. In vivo antimicrobial and wound-healing activity of resveratrol, dihydroquercetin, and dihydromyricetin against Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, and Candida albicans. Pathogens. 9 (4), 296. https://doi.org/10.3390/pathogens9040296
  43. Carvalho M. T.B., Araújo-Filho H.G., Barreto A.S., Quintans-Júnior L.J., Quintans J.S.S., Barreto R.S.S. 2021. Wound healing properties of flavonoids: A systematic review highlighting the mechanisms of action. Phytomedicine. 90, 153636. https://doi.org/10.1016/j.phymed.2021.153636
  44. Nguyen V.-L., Truong C.-T., Nguyen B.C.Q., Vo T.-N.V., Dao T.-T., Nguyen V.-D., Trinh D.-T.T., Huynh H.K., Bui C.-B. 2017. Anti-inflammatory and wound healing activities of calophyllolide isolated from Calophyllum inophyllum Linn. PLoS One. 12 (10), e0185674. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0185674
  45. Bhaskar Rao A., Ernala P., Deepthi Seelam S., Vennapusa H., Sistla R., Kuncha M., Surekha Mullapudi V., Rao Yerramilli S. 2015. Wound healing: A new perspective on glucosylated tetrahydrocurcumin. Drug Des. Devel. Ther. 9, 3579–3588. https://doi.org/10.2147/DDDT.S85041
  46. Yeh C.-J., Chen C.-C., Leu Y.-L., Lin M.-W., Chiu M.-M., Wang S.-H. 2017. The effects of artocarpin on wound healing: In vitro and in vivo studies. Sci. Rep. 7, 15599. https://doi.org/10.1038/s41598–017–15876–7
  47. Шубина В. С., Шаталин Ю.В. 2012. Влияние липосомных препаратов на основе комплексов таксифолина с металлами переменной валентности на регенерацию кожи при химическом ожоге. Цитология. 54 (3), 251–260.
  48. Ang L., Darwis Y., Koh R., Gah Leong K., Yew M., Por L., Yam M. 2019. Wound healing property of curcuminoids as a microcapsule-incorporated cream. Pharmaceutics. 11 (5), 205. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics11050205
  49. Шубина В. С., Шаталин Ю.В. 2012. Регенерация кожи после химического ожога в присутствии препаратов на основе производных таксифолина. Клеточные технологии в биологии и медицине. 3, 160–166.
  50. Shubina V.S., Shatalin Y.V. 2017. Antioxidant and iron-chelating properties of taxifolin and its condensation product with glyoxylic acid. J. Food Sci. Technol. 54 (6), 1467–1475. https://doi.org/10.1007/s13197–017–2573–0
  51. Shubina V. S., Kozina V.I., Shatalin Yu.V. 2021. Comparison of antioxidant properties of a conjugate of taxifolin with glyoxylic acid and selected flavonoids. Antioxidants (Basel). 10 (8), 1262. https://doi.org/10.3390/antiox10081262
  52. Шаталин Ю. В., Шубина В.С. 2015. Материал на основе коллагена и таксифолина. Биофизика. 60 (3), 583–588.
  53. Шаталин Ю. В., Шубина В.С. 2019. Железосвязывающая и железовосстанавливающая способность материала, полученного на основе коллагена и таксифолина (дигидрокверцетина), в физиологических и патофизиологических условиях. Хим.-фарм. журн. 53 (2), 52–56. https://doi.org/10.30906/0023–1134–2019–53–2–52–56
  54. Davidenko N., Hamaia S., Bax D.V., Malcor J.-D., Schuster C.F., Gullberg D., Farndale R.W., Best S.M., Cameron R.E. 2017. Selecting the correct cellular model for assessing of the biological response of collagen-based biomaterials. Acta Biomater. 65, 88–101. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2017.10.035
  55. Majid Q. A., Fricker A.T.R., Gregory D.A., Davidenko N., Cruz O.H., Jabbour R.J., Owen T.J., Basnett P., Lukasiewicz B., Stevens M., Best S., Cameron R., Sinha S., Harding S.E., Roy I. 2020. Natural biomaterials for cardiac tissue engineering: A highly biocompatible solution. Front Cardiovasc Med. 7, 554597. https://doi.org/10.3389/fcvm.2020.554597

Arquivos suplementares

Arquivos suplementares
Ação
1. JATS XML
Baixar
2. Fig. 1. Polyphenols used for collagen stabilization. DfTf - taxifolin conjugate with glyoxalic acid, TfG5 - taxifolin pentaglutarate.

Baixar (311KB)
Metadados
3. Fig. 2. Characterization of gel materials. a, b - Degradation of gel materials derived from collagen and polyphenols. c, d - Dynamics of polyphenols release from gel materials.

Baixar (327KB)
Metadados
4. Fig. 3. Migration of NIH 3T3 fibroblasts through gel materials. The number of cells that migrated through native collagen was taken as 100%. * Significant differences compared to control (collagen), p < 0.001.

Baixar (159KB)
Metadados
5. Fig. 4. NIH 3T3 fibroblasts on the surface of gel materials after incubation for 24 h. a - Control. Cells were seeded on the surface of collagen matrix containing no polyphenol. During incubation, the collagen matrix degraded and fibroblasts attached to the cup surface. b-d - Cells on the surface of gel material containing 2.5% DfTf (b), 2.5% TfG5 (c), 2.5% TfG5 at higher magnification (d). Cell nuclei were stained with Hoechst 33342 (blue channel) and propidium iodide (red channel) to identify dead cells. The cytoplasm of live cells was stained with calcein-AM (green channel). The scale bar is 50 μm.

Baixar (1MB)
Metadados

Declaração de direitos autorais © The Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».