Kinetics of solid-phase biocatalysis of cellulose-containing raw materials in static-dynamic mode on substrates of various fractional compositions

Full Text

Введение

При сохраняющемся мировом дефиците пищевых и энергетических ресурсов и постоянно возрастающем их потреблении наиболее актуальной задачей является поиск и технологическое освоение надежных возобновляемых источников сырья, остро необходимых для преодоления названного дефицита. В настоящее время одним из наиболее перспективных возобновляемых источников жизненно важных ресурсов признано целлюлозосодержащее сырье [1]. Это объясняется глобальным относительно однородным континентальным распределением целлюлозосодержащего сырья и высочайшей интенсивностью его ежегодного воспроизводства в процессе фотосинтеза растительной биомассы, существенной частью которой является целлюлоза (по некоторым данным до 700 млрд т в год). Кроме того, важным фактором является то, что целлюлозосодержащее сырье имеет большие перспективы для переработки с использованием экологически безопасных технологий, предотвращающих тепловое и химическое загрязнение окружающей среды.

В настоящее время основным способом многоцелевого использования целлюлозосодержащего сырья является его гидролиз, позволяющий осуществить конверсию полисахаридов в простые сахара, широко востребованные во многих отраслях промышленности и АПК. Среди существующих методов гидролиза, к которым относятся физические, химические и биологические методы, последние являются наиболее перспективными для широкого применения. Это связано с тем, что биологические методы предотвращают загрязнение окружающей среды и являются менее энергоемкими. В основе биологических методов переработки целлюлозосодержащего сырья лежит ферментативный гидролиз, представляющий собой биокаталитическую реакцию, в которой в качестве катализатора используются вырабатываемые микроорганизмами целлюлолитические ферменты.

Во многих отраслях промышленности, сельского и лесного хозяйства, занятых производством и переработкой растительного сырья, образуется большое количество целлюлозосодержащих отходов, компоненты которых имеют богатый сырьевой потенциал [2]. Однако для использования этого потенциала в целях пополнения пищевых, кормовых и энергетических ресурсов требуется конверсия целлюлозосодержащих компонентов до легко усвояемых и перерабатываемых форм сахаридов. Осуществление конверсии традиционным биотехнологическим методом (глубинным жидкофазным ферментолизом) является низко рентабельным, вследствие низкого выхода продукта, и характеризуется значительным отрицательным экологическим эффектом при необходимости потребления больших объемов растворителя.

Во многом перечисленные недостатки глубинного жидкофазного ферментолиза могут быть преодолены с использованием методов твердофазного ферментативного гидролиза. Преимущества твердофазного ферментолиза обусловлены низким содержанием влаги, высокой концентрацией питательных веществ и других ростовых факторов в ферментативной среде и, как следствие, более высокой удельной производительностью, а также резким снижением остроты экологических проблем [3, 4]. Еще одним существенным преимуществом твердофазного ферментирования является возможность организации процесса с использованием экономичного и надежного в эксплуатации оборудования [3, 4].

Результаты исследований, представленные в работах [5 – 7], свидетельствуют о целесообразности организации твердофазного ферментолиза целлюлозосодержащих отходов деревообрабатывающего производства в статико-динамическом режиме с использованием целлюлаз, продуцируемых в процессе метаболизма культуры микроскопического гриба Trichoderma viride. Установлено, что в статико-динамическом режиме ферментолиза достигается более высокая интенсивность биоконверсии при высоких показателях объемной однородности формирования больших плодовых тел и минимальном спорообразовании по сравнению, как со статическим, так и динамическим режимами [6]. Наибольшая эффективность ферментолиза по основным показателям обеспечивается, если статико-динамический режим организуется при продолжительности периода между операциями перемешивания ферментативной среды, равной трем часам [7]. При соответствующей частоте операций перемешивания, с одной стороны, достигается достаточно интенсивное обновление поверхности межфазного контакта, а с другой – сводится к минимуму негативное механическое воздействие на культуру микроскопического гриба.

Однако в работах [5 – 7] без должного внимания остается влияние дисперсности твердого субстрата на интенсивность ферментолиза, в то время как размер частиц субстрата определяет удельную поверхность и условия межфазного контакта компонентов ферментативной среды. Настоящая работа посвящена исследованию влияния степени дисперсности отходов деревообрабатывающего производства на эффективность их ферментативного гидролиза с использованием культуры микроскопического гриба Trichoderma viride, который характеризуется высокой целлюлазной активностью [8, 9].

Материалы и методы исследования

Исследование кинетики твердофазного ферментативного гидролиза проведено в статико-динамическом режиме организации процесса, технологические параметры которого оставались инвариантными и соответствующими условиям ферментолиза, рекомендованным в результате ранее проведенных исследований [7]. Исследование выполнено с использованием трех вариантов субстрата в виде смеси древесных опилок лиственных пород деревьев определенного фракционного состава, пшеничных отрубей и солодового экстракта [5]. Соотношение компонентов субстрата и процедура его подготовки изложены в работах [5, 6]. Единственным отличием вариантов субстрата был фракционный состав древесных частиц мелкой (0…1 мм), средней (1…3 мм) и крупной (3…5 мм) дисперсности. Ферментолиз проведен с использованием целлюлаз, являющихся продуктом метаболизма микроскопического гриба Trichoderma viride, вводимого в стерилизованный субстрат в виде водной суспензии (28,5 %) спор в количестве 10 масс. %. Ферментативный гидролиз имеет своей целью получение твердофазного субстрата, который может быть использован для выращивания макроскопических грибов продовольственного назначения и в качестве кормовой добавки для животноводства. Такого рода продукты остро востребованы на предприятиях АПК [10, 11].

Условия мягкого механического воздействия на мицелий микроскопического гриба в процессе ферментолиза обеспечены путем перемешивания ферментативной среды в режиме гравитационного обрушения ее откосов, периодически формируемых в засыпке медленно вращающегося барабана [5]. Скорость вращения барабана обеспечивала трехчасовую продолжительность периода статического состояния культуры между операциями перемешивания ферментативной среды. Аэрирование среды осуществлялось с использованием устройства ввода кондиционированного воздуха, размещенного по центру циркуляции материала в засыпке барабана [5]. Согласно результатам ранее проведенных исследований [5 – 7] длительность процесса ферментолиза ограничена 96 часами.

В процессе ферментолиза контролировались концентрация протеина, редуцирующих сахаров и содержание остаточной целлюлозы в ферментативной среде. Концентрация протеина определялась колориметрическим методом с применением биуретового реактива [12], содержание редуцирующих (восстанавливающих) сахаров – йодометрическим методом [13]. Содержание целлюлозы и целлюлазная активность в ферментативной среде контролировались с использованием методик, регламентированных действующими стандартами [14, 15]. Кроме измерения перечисленных характеристик ферментативной среды осуществлялся визуальный контроль ее состояния с целью оценки состояния плодовых тел и спорообразования для различных вариантов фракционного состава целлюлозосодержащего субстрата.

В процессе экспериментального исследования с периодом 24 часа проводился отбор образцов ферментативной среды для измерения концентрации протеина, сахаров и остаточной целлюлозы для трех вариантов фракционного состава целлюлозосодержащего субстрата. В целях снижения влияния случайных факторов на результат измерения и статистической оценки допущенной погрешности осуществлялся параллельный отбор проб для определения каждой измеряемой характеристики среды. Результаты параллельных измерений после проверки их статистической однородности при 5%-м уровне значимости использовались для вычисления среднего измеренного значения.

При анализе результатов исследования исходили из основных общепринятых положений теории ферментативных реакций, в соответствии с которыми биокатализ представляется в упрощенном виде как совокупность двух последовательных стадий [1]. На первой стадии при взаимодействии фермента и субстрата формируется фермент-субстратный комплекс, на второй – происходит диссоциация комплекса с образованием ферментолизата и несвязанного фермента, сохранившего свою каталитическую активность.

Результаты исследования и их обсуждение

Визуальная информация, отражающая состояние ферментативной среды после двух и четырех суток биоконверсии твердофазного целлюлозосодержащего субстрата, приведена на рис. 1 для трех вариантов его фракционного состава: мелкодисперсного, умеренной и крупной дисперсности. Анализ информации, представленной в виде характерных фрагментов поверхностной культуры, приводит к следующим выводам:

 

Рис. 1. Характерные фрагменты ферментативной среды после двух (а – в) и четырех (г – е) суток культивирования микроскопического гриба Trichoderma viride в статико-динамическом режиме в процессе твердофазного ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья для субстратов различного фракционного состава, мм: а, г – 0…1; б, д – 1…3; в, е – 3…5

 

1. при культивировании микроскопического гриба на мелкодисперсном субстрате (см. рис. 1, а и г) на всех стадиях процесса наблюдается наличие относительно слабо развитых плодовых тел только на отдельных ограниченных участках объема культуральной среды при относительно слабых признаках ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего субстрата;
2. при культивировании микроскопического гриба с использованием целлюлозосодержащего субстрата умеренной дисперсности (1…3 мм) после двух суток ферментативного гидролиза (см. рис. 1, б) объем плодовых тел меньше, чем в культуральной среде с крупным субстратом (см. рис. 1, в). Однако после четырех суток ферментолиза на субстрате с умеренной дисперсностью формируются плодовые тела, имеющие наибольший объем и однородное высокоплотное распределение в реакционном пространстве (см. рис. 1, д);
3. в процессе ферментолиза, организованного с использованием крупнодисперсного субстрата, после двух суток (см. рис. 1, в) в ферментативной среде наблюдаются наиболее ярко выраженные плодовые тела при относительно однородном их распределении в реакционном объеме. Однако после четырех суток ферментолиза на крупнодисперсном субстрате (см. рис. 1, е) плодовые тела значительно уступают по объему телам, культивируемым на субстрате с умеренной дисперсностью (см. рис. 1, д). Это косвенно свидетельствует о снижении интенсивности биоконверсии целлюлозы и снижении доступа микроскопического гриба к ферментолизату на завершающей стадии процесса в культуральной среде с крупнодисперсным целлюлозосодержащим субстратом.

Результаты исследования динамики прироста биомассы в процессе ферментолиза целлюлозосодержащего сырья с использованием культуры микроскопического гриба Trichoderma viride представлены на рис. 2 в виде зависимостей концентрации белка и относительной скорости ее изменения от времени. Представленные результаты отражают зависимость концентрации белка и относительной скорости ее изменения от времени в ферментативной среде в процессе статико-динамического твердофазного ферментолиза при различной дисперсности частиц целлюлозосодержащего субстрата.

 

Рис. 2. Динамика изменения концентрации белка (а) и относительной скорости ее прироста (б) в процессе твердофазной биоконверсии целлюлозосодержащего сырья при различном фракционном составе частиц целлюлозосодержащего твердого субстрата: 1 – 0…1 мм; 2 – 1…3 мм; 3 – 3…5 мм

 

Анализ приведенных зависимостей позволяет сделать вывод о принципиально различной динамике прироста биомассы в случаях мелкой, средней и крупной дисперсности твердой фазы. Так, начальный этап культивирования характеризуется ускоренным ростом биомассы для мелкодисперсного субстрата, отрицательным ускорением роста для крупнодисперсного и устойчивым темпом роста в случае субстрата средней дисперсности. Еще более значительное различие в кинетике культивирования наблюдается на четвертые сутки процесса, когда стадия устойчивого роста концентрации белка на субстрате средней дисперсности сменяется стадией замедленного роста, а при культивировании на тонко- и грубодисперсных субстратах в этот период происходит переход от стадии замедленного роста к стадии снижения белковой массы.

Такого рода весьма резкий переход от стадии роста к стадии деградации белковой массы для процесса ферментолиза на тонкодисперсном субстрате объясняется, очевидно, блокированием центров роста мицелия микроскопического гриба под действием эффекта агломерирования ферментативной среды. Данный эффект, характерный для тонкодисперсных материалов с высокой связностью частиц, приводит к резкому возрастанию диффузионного и теплового сопротивлений газообменных и теплообменных процессов, которые увеличиваются пропорционально квадрату диаметра формируемых агломератов [15, 16], что становится причиной ингибирования жизнедеятельности микроорганизмов. Таким образом, следствием процесса агломерирования ферментативной среды является формирование в ней центров с высокой концентрацией факторов, которые инициируют автолиз микроорганизмов. В первую очередь к таким факторам следует отнести дефицит газообразного субстрата и повышенные значения температуры и концентрации газообразного метаболита.

Высокая интенсивность роста биомассы в первые сутки ферментирования на крупнодисперсном субстрате объясняется высокой интенсивностью диффузионных и теплообменных процессов вследствие того, что центры роста мицелия концентрируются на поверхности крупных частиц субстрата. Поверхность таких частиц обогащена питательными веществами, входящими в состав жидкой фазы ферментативной среды, что обусловлено низкой диффузионной проницаемостью крупных частиц и относительно малой их удельной поверхностью межфазного контакта. В таких условиях межфазное взаимодействие ферментативной среды с аэрирующим воздухом характеризуется минимальными значениями диффузионного и тепловых сопротивлений.

Однако по этой же причине уже на вторые сутки ферментирования возможности для интенсивного протекания процесса культивирования исчерпываются и культура микроскопического гриба входит в стадию замедленного роста. Это связано, с одной стороны, с быстрым истощением питательных веществ в жидкой фазе культуральной среды в благоприятных условиях для жизнедеятельности микроорганизмов и, с другой стороны, является следствием ограниченного доступа питательных веществ, генерируемых в процессе биокатализа. Интенсивность биокатализа ограничена вследствие неблагоприятных условий формирования фермент-субстратных комплексов по причине большого внутридиффузионного сопротивления переносу целлюлазы в частицах субстрата крупного размера. В связи с этим за стадией замедленного роста закономерно следует фаза деградации белковой массы микроскопического гриба при отрицательном значении коэффициента скорости культивирования.

В случае организации процесса ферментолиза с использованием твердофазного субстрата фракции 1…3 мм, очевидно, достигается сочетание ростовых факторов, способствующее устойчивому развитию культуры микроскопического гриба и интенсивному протеканию ферментолиза целлюлозосодержащего сырья. К числу таких факторов относится развитая поверхность межфазного контакта твердой, жидкой и газообразной фаз, относительно низкое диффузионное и тепловое сопротивление процессов взаимосвязанного массотеплопереноса. Сочетание названных факторов способствует интенсивному формированию фермент-субстратных комплексов и последующей их диссоциации на продукт ферментолиза и несвязанный фермент – активный биокатализатор.

Динамика изменения содержания сахаров в ферментативной среде в процессе биоконверсии целлюлозосодержащего сырья при тестировании их концентрации йодометрическим методом представлена на рис. 3 в виде условной обобщенной зависимости.

 

Рис. 3. Изменение тестовых показателей содержания сахаров в ферментативной среде в процессе статико-динамического культивирования в зависимости от времени для субстратов с различной дисперсностью частиц целлюлозосодержащей твердой фазы: 1 – 0…1 мм; 2 – 1…3 мм; 3 – 3…5 мм (штриховой линией показано изменение осредненного значения содержания сахаров для различной дисперсности субстрата)

 

Так как нередуцирующие сахара не имеют альдегидной группы в своем химическом составе, они не проявляют реакционную восстанавливающую способность и поэтому не обнаруживаются традиционным йодометрическим методом. Однако при подкислении контрольного раствора сахаров нередуцирующие сахара преобразуются в редуцирующие. Таким образом, получаемый в результате анализа отрицательный показатель содержания сахаров можно принять за условную характеристику степени присутствия в среде нередуцирующих сахаров. Анализ динамики содержания сахаров в процессе биоконверсии (рисунок 3) показывает, что в течение всего периода ферментолиза условно тестируется присутствие только нередуцирующих сахаров. Отсутствие редуцирующих сахаров на начальной стадии ферментолиза можно объяснить активным их потреблением интенсивно развивающейся культурой гриба. На последующих стадиях ферментирования потребление легкоперевариваемых сахаров снижается, очевидно, вследствие исчерпания культурой своего ростового потенциала (см. рис. 2), что сопровождается снижением концентрации ростовых факторов в ферментативной среде и приводит к меньшему потреблению редуцирующих сахаров.

С течением времени потребление редуцирующих сахаров снижается и высвобождающийся биокаталитический потенциал продуцированных целлюлаз способствует уменьшению содержания олигосахаров в ферментативной среде [6]. Примерно одинаковая динамика отрицательных значений содержания сахаров для различных вариантов дисперсности субстрата косвенно свидетельствует об одинаковом составе и содержании олигосахаров в ферментативной среде в процессе биокаталитического гидролиза целлюлозы.

Исследование кинетики твердофазной биоконверсии целлюлозосодержащего сырья проведено путем анализа содержания остаточной целлюлозы в ферментативной среде в процессе культивирования микроскопического гриба Trichoderma viride. Результаты исследования кинетики биоконверсии представлены на рис. 4 и 5 для вариантов с различной дисперсностью частиц субстрата. Притом, что зависимости концентрации остаточной целлюлозы от времени для исследованных вариантов ферментолиза имеют тождественный вид, очевидно, что кинетические характеристики процесса существенно зависят от дисперсности твердофазного субстрата.

 

Рис. 4. Кривые изменения концентрации целлюлозы в процессе твердофазной биоконверсии целлюлозосодержащего сырья при различном фракционном составе частиц твердого субстрата: 1 – 0…1 мм; 2 – 1…3 мм; 3 – 3…5 мм

 

Рис. 5. Динамика изменения относительной скорости биоконверсии целлюлозы в процессе твердофазной биоконверсии целлюлозосодержащего сырья при различном фракционном составе частиц целлюлозосодержащего твердого субстрата: 1 – 0…1 мм; 2 – 1…3 мм; 3 – 3…5 мм

 

Наблюдаемые различия в кинетике ферментолиза во многом объясняются кинетическими закономерностями прироста белковой массы в процессе культивирования микроскопического гриба (см. рис. 2).

На всех этапах ферментолиза высокие значения скорости процесса поддерживаются при его организации на субстрате с умеренной дисперсностью (1…3 мм), что подтверждается положением кривой 2 на рис. 5. Высокая интенсивность ферментативного гидролиза целлюлозы обеспечивается при этом за счет высокоразвитой и эффективно обновляемой при перемешивании субстрата поверхности межфазного контакта. Соответствующая дисперсность твердофазного субстрата оказывается благоприятной для организации эффективного объемного аэрирования ферментативной среды и, как следствие, для интенсивного тепломассообмена при контакте среды с газообразным субстратом. Вместе с тем умеренная дисперсность частиц субстрата, очевидно, обеспечивает достаточно высокую диффузионную проницаемость частиц твердофазного субстрата биокатализатором, который интенсивно генерируется поверхностной культурой микроскопического гриба. Таким образом, в случае умеренной дисперсности твердого субстрата обеспечивается благоприятное сочетание внешних и внутренних (в отношении частиц твердой фазы) факторов роста культуры микроскопического гриба. В результате достигается возможность поддержания высокой скорости явлений внешнего и внутреннего массопереноса и оптимальных температурных условий в процессе твердофазного биокатализа. Как следствие, в процессе биокатализа целлюлозы на твердом субстрате с размером частиц 1…3 мм обеспечивается высокая интенсивность формирования фермент-субстратных комплексов с последующей их диссоциацией на ферментолизат и свободный биокатализатор. Степень биоконверсии целлюлозы, достигаемая в течение четырех суток ферментолиза на субстрате с умеренной дисперсностью, на 20 % выше, чем на тонко- и грубодисперсных субстратах.

Процесс биоконверсии целлюлозы с использованием крупнодисперсного твердого субстрата на начальном этапе протекает со значительно более высокой интенсивностью, чем в случае мелкодисперсного. Это объясняется высокой концентрацией ростовых факторов для культуры микроскопического гриба вблизи поверхности крупных частиц субстрата, вследствие низких значений диффузионных и тепловых сопротивлений тепломассообменных процессов, сопряженных с процессом биокатализа. Однако на последующих стадиях ферментолиз замедляется настолько, что скорость биоконверсии целлюлозы становится меньше скорости, имеющей место в процессе, организованном с использованием тонкодисперсного субстрата. Это объясняется снижением интенсивности формирования фермент-субстратных комплексов вследствие увеличения внутридиффузионного сопротивления твердой фазы в процессе углубления зоны проникновения биокатализатора в глубинные слои крупных частиц субстрата.

В исследованном периоде твердофазного ферментолиза целлюлозосодержащего сырья наблюдаются примерно равные средние интегральные значения скорости процесса в случаях крупно- и мелкодисперсного субстратов, что подтверждается для них практически одинаковой достигнутой степенью конверсии целлюлозы (см. рис. 4). Однако динамика изменения кинетических характеристик ферментолиза в названных вариантах организации процесса позволяет сделать вывод о том, что на начальной его стадии более высокой интенсивностью характеризуется вариант с крупнодисперсным твердым субстратом. На последующих же стадиях в таком варианте процесса, в отличие от альтернативных его вариантов, наблюдается существенное и систематическое снижение интенсивности ферментолиза, что, очевидно, связано с возрастающим доминированием в этом случае диффузионной кинетики.

Заключение

Таким образом, в результате исследования определен фракционный состав твердого целлюлозосодержащего субстрата (1…3 мм), при использовании которого достигается максимальная концентрация ростовых факторов культуры микроскопического гриба Trichoderma viride, способствующих интенсивному протеканию процесса ферментативного гидролиза. Высокая концентрация ростовых факторов при использовании субстрата такой дисперсности обеспечивается вследствие благоприятных условий для интенсивного объемного аэрирования ферментативной среды и диффузионного контакта компонентов фермент-субстратного комплекса в процессе ферментолиза целлюлозы и культивирования микроорганизмов в статико-динамическом режиме.

About the authors

V. N. Dolgunin

TSTU

Author for correspondence.
Email: dolgunin-vn@yandex.ru

Doctor of Technical Sciences, Professor of the Department of Technology and Equipment for Food and Chemical Production

Russian Federation, Tambov

I. A. Protopopov

TSTU

Email: dolgunin-vn@yandex.ru

Postgraduate student

Russian Federation, Tambov

A. A. Zhilo

TSTU

Email: dolgunin-vn@yandex.ru

Postgraduate student of the department of "Technology and equipment for food and chemical production"

Russian Federation, Tambov

A. N. Kudi

TSTU

Email: dolgunin-vn@yandex.ru

Doctor of Technical Sciences, Associate Professor of the Department of Technology and Equipment for Food and Chemical Production

Russian Federation, Tambov

V. A. Pronin

TSTU

Email: dolgunin-vn@yandex.ru

Candidate of Technical Sciences, Associate Professor of the Department of Technology and Equipment for Food and Chemical Production

Russian Federation, Tambov

References

Supplementary files