Cell Number Dynamics, Chlorophyll а Fluorescence Intensity, and Photosynthetic Pigment Content in Thalassiosira nordenskioeldii Cleve 1873 (Bacillariophyta) Exposed to Environmental Copper Pollution

Full Text

Диатомовая водоросль Thalassiosira nordenskioeldii Cleve 1873 (Bacillariophyta) – доминирующий вид фитопланктона Японского моря. Его численность может достигать 400 кл./мл (Шевченко и др., 2020), составляя до 90% от общей численности фитопланктона в зимний период. В летнее время этот вид также может быть в числе субдоминирующих планктонных микроводорослей (Стоник, 2018; Шевченко и др., 2020). Массовое развитие T. nordenskioeldii отмечено и в других районах Мирового океана: в Белом (Ильяш и др., 2014), Южно-Китайском (Liu et al., 2021), Шотландском (Harris et al., 1995) и Северном (Muylaert, Sabbe, 1996) морях.

Известно, что T. nordenskioeldii массово развивается в водах, обогащенных нитратами (Ильяш и др., 2014). Снижение концентрации нитратов может быть результатом активного потребления этих соединений водорослями данного вида (Шевченко и др., 2020). Медь, относящаяся к жизненно необходимым для растения элементам, также оказывает стимулирующий эффект на рост популяций разных представителей микроводорослей (Miazek et al., 2015; Cavalletti et al., 2022; Maltsev et al., 2023). Этот металл содержится в прибрежных водах всех морей России и считается одним из основных загрязняющих элементов (Коршенко, 2021).

Для выяснения действия экологических факторов на микроводоросли традиционно изучают динамику численности клеток – интегральный показатель, отражающий происходящие в организмах микроводорослей процессы. Кроме того, эффект действия тяжелых металлов на микроводоросли часто определяется по изменению содержания фотосинтетических пигментов и интенсивности флуоресценции хлорофилла а (Miazek et al., 2015; Cavalletti et al., 2022).

Цель настоящей работы заключалась в оценке влияния меди на рост популяции, количество клеток в колониях, интенсивность флуоресценции хлорофилла а и содержание фотосинтетических пигментов у Thalassiosira nordenskioeldii.

Материал и методика. Объектом исследования служила клоновая культура диатомовой водоросли Thalassiosira nordenskioeldii (Bacillariophyta) из коллекции Морского биобанка ННЦМБ ДВО РАН – клон MBRU_Tnor22 (Коллекция живых микроорганизмов). Водоросль выращивали на среде f/2 (Guillard, Ryther, 1962), приготовленной на основе фильтрованной и стерилизованной морской воды соленостью 32‰, без добавления меди, в 250 мл колбах Эрленмейера с объемом культуральной среды 200 мл, при температуре 16±2°С, интенсивности освещения 2500 лк в области видимого света и свето-темновым периодом 14 ч свет : 10 ч темнота. В качестве инокулята использовали культуры на экспоненциальной стадии роста. Начальная концентрация клеток составляла 500 кл./мл.

Медь добавляли в виде CuSO₄×5H₂O в день постановки эксперимента, концентрации указаны в пересчете на ионы меди. Исследуемые концентрации составляли 10, 20 и 50 мкг/л. Выбор концентраций основан на содержании этого металла в прибрежных водах России. Предельно допустимая концентрация (ПДК) для меди составляет 5 мкг/л (Коршенко, 2021). Суспензию водоросли вводили в эксперимент без предварительной адаптации культуры к меди.

Продолжительность экспериментов составляла 14 сут. Пробы для подсчета численности клеток, количества клеток в цепочках и определения флуоресценции хлорофилла а отбирали на 0, 4, 7, 11 и 14 сут опыта, для определения содержания хлорофилла а и каротиноидов – на 0, 7 и 14 сут опыта. Подсчет численности клеток и количества клеток в цепочках проводили в камере Седвика-Рафтера. Интенсивность флуоресценции хлорофилла а регистрировали в 96-луночном планшете на мультимодальном планшетном ридере Spark 10 TM (Tecan, Швейцария) при длине волны 685 нм, длина волны возбуждения составляла 490 нм. Содержание хлорофилла а и каротиноидов определяли стандартным методом экстракции из клеток ацетоном с последующим измерением на мультимодальном планшетном ридере Spark 10 TM. Расчет концентрации пигментов проводили по известным формулам (Jeffrey, Humphrey, 1975).

Эксперименты проводили в трех биологических повторностях, данные выражали в процентах к контролю. За контроль (100%) принимали показатели, полученные на культуре без добавления меди. Статистическую обработку выполняли с помощью программы Excel.

Результаты и обсуждение. При концентрации меди 10 мкг/л численность клеток Thalassiosira nordenskioeldii на 4-е сутки опыта не отличалась от таковой в контроле (рис. 1а). На 7-е и 11-е сутки этот показатель превышал контроль соответственно в 3.1 и 3.0 раза, а на 14-е – в 5.8 раза. При внесении 20 мкг/л металла количество клеток уже на 4-е сутки превышало контрольное и впоследствии не отличалось от такового при 10 мкг/л. Увеличение концентрации меди до 50 мкг/л приводило к угнетению роста популяции микроводоросли на 4-е сутки. Впоследствии число клеток увеличивалось и на 11-е сутки соответствовало контрольному, однако было существенно меньше, чем при концентрациях меди 10 и 20 мкг/л.

 

Рис. 1. Влияние разных концентраций меди на численность клеток микроводоросли Thalassiosira nordenskioeldii (а) и флуоресценцию хлорофилла а в них (б).

 

В культуре T. nordenskioeldii преобладали одиночные клетки, доля которых возрастала к концу опыта как в контроле, так и при добавлении меди (табл. 1). Доля собранных в цепочки клеток, напротив, снижалась. При концентрации меди 50 мкг/л доля одиночных клеток на 14-е сутки была выше, чем в контроле и в остальных вариантах опыта.

 

Таблица 1. Доля (%) клеток Thalassiosira nordenskioeldii в цепочках в контроле и при воздействии разных концентраций меди

Сутки	Контроль			Концентрация меди, мкг/л
				10			20			50
	1	2	3	1	2	3	1	2	3	1	2	3
0	60.0	23.6	16.4	60.0	23.6	16.4	60.0	23.6	16.4	60.0	23.6	16.4
4	74.4	16.8	8.8	55.4	30.2	14.4	62.6	27.0	10.4	69.4	23.4	7.2
7	80.9	8.3	10.8	75.0	20.6	4.4	85.4	12.3	2.3	80.6	14.8	4.6
11	90.6	7.9	1.4	90.6	7.9	1.5	92.7	6.4	0.8	87.8	9.6	2.6
14	92.4	6.9	0.7	92.4	7.0	0.6	89.4	10.0	0.6	80.3	15.8	3.9

Примечание. 1 – одиночные клетки, 2 – цепочки из 2-х клеток, 3 – более длинные цепочки.

 

В присутствии 10 и 20 мкг/л меди флуоресценция хлорофилла а была существенно выше контрольной на всем протяжении опыта (рис. 1б). Медь в концентрации 50 мкг/л на 4-е сутки вызывала снижение этого показателя; в дальнейшем он увеличивался, но не достигал контрольного значения.

Содержание хлорофилла а и каротиноидов превышало контрольное при добавлении 10 и 20 мкг/л меди, особенно на 14-е сутки опыта (рис. 2). Наличие в среде 50 мкг/л вещества приводило к снижению содержания пигментов на 7-е сутки, а на 14-е превышало контрольное в два раза.

 

Рис. 2. Изменение содержания фотосинтетических пигментов хлорофилла а (а) и каротиноидов (б) в клетках Thalassiosira nordenskioeldii под воздействием меди.

 

Проведенный опыт подтвердил выраженный стимулирующий эффект меди, как на рост популяции T. nordenskioeldii, так и на работу фотосинтетического аппарата, особенно при концентрациях 10 и 20 мкг/л. Увеличение численности клеток, накопление в клетках фотосинтетических пигментов и увеличение флуоресценции хлорофилла а под воздействием меди ранее было отмечено у Thallasiosira pseudonana (Wang et al., 2021). У рафидофитовой водоросли Heterosigma akashiwo, содержавшейся в среде с добавлением 10 мкг/л меди, наблюдался более интенсивный рост чем в контроле, а при 20 и 50 мкг/л происходило его ингибирование (Маркина, 2021).

Необходимо отметить, что флуоресценция хлорофилла а на клетку водоросли была ниже при воздействии всех концентраций меди, за исключением концентрации 10 и 20 мкг/л вещества на 4-е сутки опыта (табл. 2). Такое явление свидетельствует о токсическом воздействии металла. Например, при внесении 35.5 мкг/л металла квантовый выход флуоресценции хлорофилла а у Thalassiosira weisfloggi снижался на фоне ингибирования роста клеток и содержания хлорофилла а, не отличавшегося от контрольного (Акимов и др., 2023).

 

Таблица 2. Динамика интенсивности флуоресценции (относительные единицы) на клетку Thallasiosira nordenskioeldii в контроле и при воздействии разных концентраций меди (мкг/л)

Сутки	Контроль	10	20	50
0	0.70±0.11	0.70±0.11	0.70±0.11	0.70±0.11
4	0.72±0.11	0.88±0.20	0.78±0.21	0.50±0.14
7	0.99±0.17	0.70±0.18	0.56±0.10	0.47±0.07
11	0.56±0.12	0.48±0.06	0.51±0.13	0.31±0.05
14	0.85±0.16	0.40±0.04	0.28±0.06	0.40±0.06

 

В целом, медь в изученных концентрациях оказывала на диатомовые водоросли ингибирующий эффект чаще, чем стимулирующий (Miazek et al., 2015; Cavalletti et al., 2022). По-видимому, у T. nordenskioeldii существуют способы детоксикации меди и использования ее для роста. Например, у диатомеи Skeletonema costatum отмечено депонирование этого металла в вакуолях (Cavalletti et al., 2022). У разных представителей рода Thalassiosira в среде, загрязненной медью, зарегистрирован более интенсивный синтез белков и полисахаридов, предназначенных для связывания с металлами и последующей экскреции их из клетки (Miazek et al., 2015). Еще одним механизмом детоксикации тяжелых металлов является усиление синтеза фитохелатинов в токсической среде, как это отмечалось у T. nordenskioeldii в присутствии кадмия (Wang, Wang, 2008).

Таким образом, в изученных концентрациях медь оказывала выраженный стимулирующий эффект как на рост популяции T. nordenskioeldii, так и на синтез фотосинтетических пигментов и флуоресценцию хлорофилла а. В загрязненной медью среде при подавлении роста сопутствующих видов фитопланктонного сообщества T. nordenskioeldii может получить конкурентное преимущество и достичь более высокой концентрации. Следовательно, медь может способствовать “цветению” этой микроводоросли.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарны ресурсному центру “Морской биобанк” ННЦМБ ДВО РАН (http://marbank.dvo.ru) за предоставленную культуру Thalassiosira nordenskioeldii и возможность пользоваться мультимодальным планшетным ридером Spark 10 TM.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 21-74-30004).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют эксперименты с людьми или животными.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

Zh. V. Markina

Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: zhannav@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7135-1375
Russian Federation, Vladivostok, 690041

A. V. Podoba

Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Email: zhannav@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-4783-3471
Russian Federation, Vladivostok, 690041

T. Yu. Orlova

Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Email: zhannav@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5246-6967
Russian Federation, Vladivostok, 690041

References

Supplementary files